实时荧光定量PCR检测五日热巴通体
陈梅玲;张晶波;孙长俭;温博海;杨晓;牛东升;
军事医学科学院微生物流行病研究所,军事医学科学院微生物流行病研究所,军事医学科学院微生物流行病研究所,军事医学科学院微生物流行病研究所,军事医学科学院微生物流行病研究所,军事医学科学院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071,北京市西城区疾病预防控制中心,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071
Detection of Bartonella quintana by a quantitative real-time polymerase chain reaction
摘要 目的采用TaqMan- MGB探针建立检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR(real- timequantitativePCR)方法。方法根据五日热巴通体特异的16-23SrRNA间隔区序列设计引物和探针,以克隆的1623SrRNA间隔区基因片段作DNA模板,建立了检测五日热巴通体实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与普通PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度约为它的200倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌,检出结果为阴性。实时荧光定量PCR检测五日热巴通体实验感染小鼠血、脾脏、肝脏和肺组织DNA样本,脾脏和肝脏样本中检出较高水平五日热巴通体DNA,血和肺部检出的目的DNA的水平较低。结论本研究建立的检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR法具有很高的检测灵敏度和特异性,可用于临床患者血样本的检测,作五日热的早期诊断。
关键词 :
五日热巴通体 ,
实时定量PCR ,
16S-23SrRNA ,
巴通体感染
Abstract :According to the 16S-23S rRNA intervening sequences (IVS) of Bartonella quintana, one pair of primers and one TaqMan-MGB probe were designed. A quantitative real-time polymerase chain reaction (quantitative PCR) was developed with the primers, the probe, and the template (16S-23S rRNA IVS DNA fragment of B. quintana). The standard curve was established with the 16S-23S rRNA IVS DNA fragment and the relationship between the values of threshold cycle (C_ t) and the DNA copy number was linear (r=0.996). The sensitivity of this quantitative PCR was about 200 times higher than that of a common PCR to detect the homologous DNA. In addition,this quantitative PCR was highly specific and sensitive for detection of B. quintana. It is very useful for detection of tiny DNA of B. quintana in samples for clinic diagnosis of bartonellosis.
Key words :
Bartonella quintana
quantitative real-time PCR
收稿日期: 2006-06-20
〔1〕俞树荣,陈香蕊.立克次体与立克次体病〔M〕.北京:军事医学科学出版社,1998:157173.
〔2〕BrennerDJ,O'ConnorSP,WinklerHH,etal.Proposalstou nifythegeneraBartonellaandRochalimaea,withdescriptionsof Bartonellaguintanacomb.nov.,andtoremovethefamilyBar tonellaceaefromtheorderRickttsiales〔J〕.IntJSystBacteriol,1993,43:777.
〔3〕AdalKA.Bartonella:newspeciesandnewdiseases〔J〕.Rev MedMicrobiol,1995,6:155164.
〔4〕SanderA,PosseltM,BohmN,etal.DetectionofBartonella henselaeDNAbytwodifferentPCRassaysanddeterminationof thegenotypesofstrainsinvolvedinhistologicallydefinedcat scratchdisease〔J〕.JClinMicrobiol,1999,37:993997.
〔5〕RenestoP,GouvernetJ,DrancourtM,etal.UseofrpoBgeneanalysisfordetectionandidentificationofBartonellaspecies〔J〕.JClinMicrobiol,2001,39:430437.
〔6〕JohnsonG,AyersM,McclureSCC,etal.Detectionandidenti ficationofBartonellaspeciespathogenicforhumanbyPCRam plificationtargetingtheriboflavinsynthasegene(ribC)〔J〕.J ClinMicrobiol,2003,41:10691072.
〔7〕JensenWA,FallMZ,RooneyJ,etal.Rapididentificationand differentiationofBartonellaspeciesusingasingle stepPCRas say〔J〕.JClinMicrobiol,2000,38:17171722.
〔8〕ZeaiterZ,FournierPE,etal.Diagnosisofbartonellaendocardi tisbyarealtimenestedPCRassayusingserum〔J〕.JClinMi crobiol,2003,41:919925.
〔9〕KutyavinIV,AfoninaIA,MillsA,etal.3minorgroovebind ing DNAprobesincreasesequencespecificityatPCRextension temperature〔J〕.NucleicAcidsRes,2000,28:655661.
〔10〕BrennanRE,SamuelJE.EvaluationCoxiellaburnetiiantibi oticsusceptibilitiesbyrealtimePCRassay〔J〕.JClinMicrobi ol,2003,41:18691874.
〔11〕JiangJ,TemenakJJ,etal.Real timePCRduplexassayfor RickettsiaprowazekiiandBorreliarecurrentis〔J〕.AnnNY AcadSci,2003,990:302310.
〔12〕LoftisAD,MassungRF,etal.Quantitativereal timePCRas sayfordetectionofEhlichiachaffeensis〔J〕.JClinMicrobiol,2003,41:38703872.
[1]
叶飞, 宋敬东, 赵莉, 张益, 夏连续, 祝令伟, 任娇, 王文玲, 武桂珍, 田厚文, 谭文杰. 分子与血清学检测确诊2017年西非塞拉利昂1例猴痘病毒感染病例 [J]. 中国人兽共患病学报, 2019, 35(6): 535-538.
[2]
王本敬 王文波 周霞 陈艳勤 张静 刘晨晨 梁幼生 诸葛洪祥. 荧光实时定量PCR定量水体中日本血吸虫尾蚴方法的建立 [J]. 中国人兽共患病学报, 2011, 27(12): 1075-1081.
[3]
杜军伟;王远志;陈创夫;葛阳春;唐利燕;. 实时定量PCR检测siRNA对小鼠巨噬细胞中FTH1基因表达的抑制作用 [J]. 中国人兽共患病学报, 2010, 26(07): 638-641.
[4]
叶勇刚;赵以睿;张仁利;耿艺介;黄达娜;高世同;林瑞庆;朱兴全;. 嗜人按蚊雌蚊差异表达基因的鉴定及全长cDNA的克隆 [J]. 中国人兽共患病学报, 2009, 25(12): 1177-1180.
[5]
张军民;章慧;孙九峰;席丽艳;. 过氧化氢酶家族部分成员在马尔尼菲青霉的相关研究 [J]. 中国人兽共患病学报, 2008, 24(09): 824-826.
[6]
王争强;朱虹;苏裕心;何君;端青;. 鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立 [J]. 中国人兽共患病学报, 2006, 22(08): 701-703.
[7]
刘世国;刘明林;孟桂芳;高同举;. 弓形虫感染家兔精液中虫体含量的动态变化 [J]. 中国人兽共患病学报, 2006, 22(04): 323-325.
[8]
张晶波;温博海;陈梅玲;朱丽娜;邱玲;牛东升;. 荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体 [J]. 中国人兽共患病学报, 2006, 22(04): 289-293.
[9]
张晶波,温博海,陈梅玲,邱玲,牛东升,李丽莉. 检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR [J]. 中国人兽共患病学报, 2005, 21(08): 652-655.