中国人兽共患病学报
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中国人兽共患病学报
 
2021年 37卷 9期
刊出日期:2021-09-20

论著
调查研究
监测分析
实验研究
综述
疾病防治
学术资料
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中文目录
2021 Vol. 37 (9): 0-0 [摘要] ( 104 ) [HTML 1KB] [PDF 818KB] ( 759 )
论著
773 徐鹏, 张雪飞, 马英
应用16S rDNA分析青海喜马拉雅旱獭肠道菌群多样性
目的 阐述青海喜马拉雅旱獭肠道菌群组成和群落结构,分析群落分布和种群遗传特征,探讨肠道菌群与环境因素之间的关系。方法 对来自青海省3个地理亚区的5个小区共计45份喜马拉雅旱獭粪便样本进行肠道微生物样品的收集,利用16S rDNA技术进行基因测序及微生物多样性分析,得到样本物种分类信息与相对丰度。基于OTU聚类做DCA分析探求肠道菌群与环境因子的关系,使用PICRUSt软件对肠道菌群的功能进行预测。结果 喜马拉雅旱獭的肠道菌群主要分布在6个门,10个属,且环境因素中温度、海拔、经度对其影响较大。功能预测发现遗传信息处理与代谢通路在肠道菌群中明显富集。结论 通过对青海喜马拉雅旱獭肠道菌群组的研究,为青藏高原的鼠疫防控提供具有实用价值的基础信息,还为及早发现新型病原体和更好的防控动物源性传染病提供理论依据,对未来相应学科的深入研究与快速发展具有重要价值与意义。
2021 Vol. 37 (9): 773-782 [摘要] ( 135 ) [HTML 1KB] [PDF 3984KB] ( 930 )
实验研究
783 谢辉, 周蕾, 祁芝珍, 邵高祥
基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌
目的 实现荧光定量PCR技术在鼠疫现场和基层的应用。方法 本试验将已建立的基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法应用于我国各鼠疫疫源地野生菌株的检测,进行特异性评价。选取分布于我国境内不同鼠疫疫源地野生鼠疫耶尔森氏菌株、鼠疫减毒菌株、耶尔森菌属近缘菌株假结核菌及小肠结肠炎菌进行荧光定量PCR检测。结果 55株鼠疫耶尔森氏菌及鼠疫减毒菌株扩增阳性,假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌无阳性扩增,冻干试剂在室温25 ℃和37 ℃条件下可保存6个月,敏感性与冷冻保存无差异,核酸扩增诊断可在1 h内完成。结论 应用基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法对我国各鼠疫疫源地55株鼠疫耶尔森氏菌检测呈现高度特异性,本试验冻干试剂具有可室温保存、便于运输、检测结果精准、快速等特点,具有较好的鼠疫现场应用前景。
2021 Vol. 37 (9): 783-787 [摘要] ( 114 ) [HTML 1KB] [PDF 2081KB] ( 891 )
788 杨小娜, 张琳, 侯学霞, 郝琴
建立双重荧光定量PCR方法检测蜱传疏螺旋体
目的 建立双重荧光定量PCR方法,同时检测Borrelia burgdorferiBorrelia miyamotoi方法 分别利用recA基因、glpQ基因合成引物探针,并优化反应条件。在单重实验的基础上建立双重荧光定量PCR方法,对该方法灵敏度和特异度进行检测,并探索其他因素对反应结果的影响。使用模拟样本和实际样本评价新方法的检测效用。结果 双重荧光定量PCR方法具有良好的灵敏度和特异度,与单重实验方法比较,检测Ct值无明显差异(P>0.05),病原浓度与检测Ct值具有良好的线性相关关系。两种病原浓度差异和其他病原的存在对检测结果无明显影响。使用该方法检测模拟蜱样本和实际蜱样本具有良好的实用性。结论 本实验建立的多重荧光定量PCR方法能快速便捷的检测两种疏螺旋体,为蜱样本病原鉴定提供了有价值的检测工具。
2021 Vol. 37 (9): 788-794 [摘要] ( 128 ) [HTML 1KB] [PDF 3812KB] ( 770 )
795 付莎莎, 孙先谱, 孙凡, 徐正中, 焦新安, 陈祥
伦敦沙门菌的流行与耐药性分析
目的 分离鉴定2016-2018年不同宿主来源的伦敦沙门菌,并对其进行药物敏感性分析。方法通过生化实验和肠毒素基因stn检测进行种属鉴定;参照考夫曼怀特表对沙门菌进行血清型分型;采用琼脂稀释法测定伦敦沙门菌对18种抗菌药物的敏感性。结果成功分离鉴定出135株伦敦沙门菌,分离自猪、人、犬和鸡来源的样品;100%伦敦沙门菌至少对一种抗菌药物表现耐药;伦敦沙门菌对四环素(95.6%)、链霉素(93.3%)和氨苄西林(87.4%)的耐药率较高,对氨曲南(8.9%)和头孢噻肟(11.1%)耐药率较低,对阿米卡星、多粘菌素、呋喃妥因和美罗培南敏感;多重耐药率达到95.6%,常见的多重耐药表型为AMP-CHL-FFC-FOS-GEN-OLA-STR-SXT-TET。结论伦敦沙门菌主要分离自猪全产业链各环节样品和体检人员样品,其耐药性和多重耐药性严重。
2021 Vol. 37 (9): 795-800 [摘要] ( 125 ) [HTML 1KB] [PDF 1301KB] ( 791 )
801 任红宇, 王艳晴, 李一楠, 赵娜, 秦天
102株侵袭性肺炎链球菌血清型分布特征及耐药谱分析
目的 了解侵袭性肺炎链球菌菌株血清群/型分布特征和菌株耐药性情况。方法 选用本科室保存的102株侵袭性肺炎链球菌菌株(来自内蒙古、宁夏、四川及辽宁)。合成23种肺炎链球菌血清群/型特异性引物,采用多重PCR方法扩增进行初筛,扩增阳性的用荚膜肿胀方法进行复核验证。并选用24种抗生素进行药物敏感性实验。结果 102株侵袭性肺炎链球菌共分为21个血清群,主要流行血清群/型(株数由高到低)依次为19、6、14、23、35/42、34、3、22A、15、1、18、4、5、7B、8、10A、11A、13、17A、20、33F。含10株以上的是19群、6群、14群。24种抗生素中,莫西沙星、吉米沙星、头孢曲松、多西环素未发现耐药菌株。其余20种抗生素均有耐药菌株出现。耐药率大于90%的抗生素从高到低依次为:阿奇霉素、地红霉素、克拉霉素、红霉素;耐药率小于10%的依次为:万古霉素、青霉素(注射)、利奈唑胺、美罗培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟。结论 我国侵袭性肺炎链球菌分离株以19群、6群、14群最多见;23价肺炎疫苗覆盖血清群但不包含的血清型(6A、6C、6D、15C、23B、22A、18A、7B、17A)和非疫苗相关的13群、34群、35/42群也占有一定比例。治疗由肺炎链球菌引起的感染首选吉米沙星、莫西沙星、头孢曲松、多西环素等抗生素。
2021 Vol. 37 (9): 801-807 [摘要] ( 137 ) [HTML 1KB] [PDF 1083KB] ( 867 )
808 朱水荣, 张政, 姚苹苹, 杨勇, 方磊, 张严峻
浙江省人源猪链球菌鉴定及毒力基因检测分析
目的 鉴定浙江省2005-2020年散发猪链球菌感染者分离株血清型并检测其毒力基因,了解该地区临床致病株毒力基因的分布情况与分子流行病学特征。方法 收集猪链球菌感染者临床分离株,采用传统细菌学方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)鉴定的同时,利用聚合酶链(PCR)技术检测其链球菌属(tuf)、猪链球菌种(16S rRNA)、猪链球菌7型(Cps7H)、猪链球菌9型(Cps9D)与2型猪链球菌(Cps2J)/兼荚膜毒力基因以及毒力基因:溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、毒力相关序列(orf2)、纤连蛋白(fbps)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)等24种毒力基因携带情况。结果 28株人源分离株经综合鉴定均为2型猪链球菌,毒力基因群检测结果显示,除salKR毒力基因以及1株ZJ-31菌株外,96.43% (27/28) 的菌株均携带23种毒力基因;16S rRNA基因测序构建系统发育树,结果显示除来自2018年的ZJ-31菌株单独在另一分枝外,其它菌株同源性极高均在同一分枝。结论 浙江省十几年来散发猪链球菌病的人源分离株大多为2型猪链球菌强毒力株,遗传进化显示近年来已出现个别不同来源分枝群菌株。
2021 Vol. 37 (9): 808-814 [摘要] ( 135 ) [HTML 1KB] [PDF 1874KB] ( 829 )
监测分析
815 姚素霞, 郝瑞娥, 王洋, 张秋香, 杨红霞, 韩吉婷, 秦文彦
2014-2017年山西省沙门氏菌分子分型及耐药性研究
目的 了解山西省食源性疾病主动监测中沙门氏菌的药物敏感性,并对耐喹诺酮类药物的沙门氏菌进行了耐药基因与分子分型研究,为沙门氏菌临床治疗提供科学依据并初步了解沙门氏菌的耐药机制。方法 对 2014-2017年山西省食源性疾病主动监测病例中分离到的沙门氏菌进行血清学分型、药物敏感性试验以及对耐喹诺酮类药物的沙门氏菌进行耐药基因检测及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型。结果 137株沙门氏菌经诊断血清凝集后共分为16个血清型,主要为肠炎沙门氏菌51株、鼠伤寒沙门氏菌47株、其他沙门氏菌39株。 137株沙门氏菌对萘啶酸的耐药率最高,为56.93%;其次为四环素,耐药率为34.31%;对头孢噻肟、庆大霉素及头孢西丁的耐药率较低,分别为8.03%、5.84%及0.73%。对萘啶酸耐药的78株沙门氏菌,进行gyrA基因和parC基因点突变的测定,发现对萘啶酸耐药的沙门氏菌gyrA基因与parC基因检出点突变129个。51株肠炎沙门氏菌的相似度在70.6%~100%, 21株鼠伤寒沙门氏菌的相似度在58.9%~100%。结论 山西省沙门氏菌以肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌为主。本地区沙门氏菌萘啶酸耐药情况最为严重,需要加强对沙门氏菌耐药的监测及喹诺酮类药物耐药机制的研究。
2021 Vol. 37 (9): 815-820 [摘要] ( 126 ) [HTML 1KB] [PDF 2053KB] ( 864 )
821 徐秋芳, 范妤, 张亚军, 张相猛, 卢晓芸, 施怡茹, 徐瑞芳, 潘俊锋, 赵锦江
2014-2020年上海市青浦区HIV抗体筛查和确证试验结果分析
目的 了解辖区近年HIV检测工作情况,为艾滋病检测质量管理和艾滋病防治提供依据。方法 对2014-2020年初筛有反应标本,按照《全国艾滋病检测技术规范(2009年、2015 年和2020年修订版)》要求,分别采用四代酶联免疫吸附试验法(ELISA)、三/四带化学发光法、胶体硒法进行复检,对复检任一方法有反应标本采用免疫印迹法(Western Blot)进行确证。结果 1 374份复检有反应标本进行抗体补充试验,阳性为1 156(84.13%),阴性为148份(10.77%),不确定为70份(5.10%);VCT门诊和医疗机构门诊是发现HIV感染的主要方式,ELISA法和胶体硒法复核有反应确证阳性率为95.12%,胶体硒法两种试剂复核均有反应确证阳性率为90.45%,高于单一ELISA法或胶体硒法复核。确证阳性15~40岁人群占多数(70.76%),其次为50岁以上人群(17.56%);男性∶女性为36.3∶1;确证阳性标本的S/CO比值>不确定标本>阴性标本;不确定标本中,p24和gp160条带出现频率分别为62.86%和52.86%,同时含有gp160、p24条带随访进展为阳性的占62.50%(10/16)。结论 四代ELISA和胶体硒法联合复核能有效降低假阳性率,复检S/CO比值大小和确证条带分布有一定提示作用,对于不确定但条带有两条以上且筛查S/CO比值较高的标本,应及时进行核酸检测等补充试验或者积极跟进随访;加强青壮年和老年男性的艾滋病防病宣教。
2021 Vol. 37 (9): 821-825 [摘要] ( 137 ) [HTML 1KB] [PDF 1045KB] ( 809 )
综述
826 蒋小武, 朱乐欣, 艾莎珍
基孔肯雅病毒小鼠感染模型研究进展
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)感染引发的基孔肯雅热是一种主要经伊蚊叮咬而传播的虫媒传染病,近些年已在100多个国家流行或暴发,成为严重威胁全球公共卫生安全的虫媒病毒性传染病。CHIKV感染后可以引起急性发热、皮疹、肌肉疼痛以及慢性关节炎、腱鞘炎等临床症状,严重者可发生病毒性脑炎。小鼠模型作为CHIKV最常用的动物感染模型,在病毒感染机理、宿主抗感染免疫机制以及相关疫苗或药物研发等方面应用广泛。本文拟就国内外关于基孔肯雅病毒小鼠感染模型的最新研究进展作一综述。
2021 Vol. 37 (9): 826-832 [摘要] ( 132 ) [HTML 1KB] [PDF 1126KB] ( 849 )
833 王晓亚, 安彦波, 戴敏高, 赵丽娜, 刘军肖, 牛占丛
艰难梭菌感染与肠道微生态的研究进展
肠道微生态包括肠道微生物及其代谢产物。肠道微生物群分布广、种类多、数量大,在人体作用机制复杂,随着生物学研究技术及分析方法的发展和应用,人们对肠道微生态的认识逐步加深。艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)与肠道菌群失调密切相关,互为因果,艰难梭菌感染亟待解决。本文就艰难梭菌感染的发病机制、高危因素、治疗及其与肠道微生态的相关内容研究进展进行综述,以期增加对肠道菌群与艰难梭菌的认识,提高临床诊治和预防CDI的能力。
2021 Vol. 37 (9): 833-838 [摘要] ( 128 ) [HTML 1KB] [PDF 1116KB] ( 814 )
839 王雅轩, 朱晓雁, 苏建荣
CRISPR/Cas系统在病原体检测方面的研究进展
规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated, CRISPR/Cas)是一种广泛存在于细菌和古细菌内部的特有的适应性免疫系统,用于抵抗外来核酸入侵。目前,该系统被分为6个类型和22个亚型,常见被应用于核酸检测的Cas9、Cas12和Cas13分别属于II型、V型和VI型。根据世界卫生组织的标准,理想的病原体检测方法应该具备灵敏、特异、快速、低成本、易于使用和无需大型设备等特点,而CRISPR/Cas的特性使其在病原体检测方面显示出了巨大的潜力。本文主要总结了Cas9、Cas12、Cas13和Cas14在病原体检测中的应用,并对CRISPR/Cas未来的应用前景进行了展望。
2021 Vol. 37 (9): 839-844 [摘要] ( 143 ) [HTML 1KB] [PDF 1107KB] ( 853 )
调查研究
845 刘丹, 乌兰图雅, 殷旭红, 崔云虹, 王亭富, 阿木日汗, 曹民治, 王国栋, 闫大成, 李纯浦, 高娃
内蒙古大兴安岭林区牙克石段的蜱种及蜱携病原体感染调查
目的 调查内蒙古东部大兴安岭林区牙克石段的蜱种分布及病原体感染状况。方法 2016-2019年,在东部林区蜱活跃高峰期(5-6月)采用布旗法采集游离蜱标本,使用体视显微镜对蜱初步分类;提取蜱全基因组DNA,采用斑点热立克次体、无形体属、埃立克体属、莱姆病螺旋体和新型回归热螺旋体病原体的特异性基因进行PCR检测。结果 本次共采集蜱虫2 786只,通过体视显微镜和基因检测分析,隶属于1科3属4种,分别为全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)、嗜群血蜱(Haemaphysalinae concinna)、日本血蜱(Haemaphysalinae japonica)、森林革蜱(Dermacentor silvarum)。其中,全沟硬蜱(78.6%,2 191/2 786)、嗜群血蜱(15.9%,442/2 786)为本地区的优势蜱种。在大兴安岭林区牙克石段的7个采样地区的蜱中,乌奴耳镇斑点热立克次体检出率最高,为74.2%(222/299);博克图镇无形体属检出率较高,为18.9%(39/206);库都尔镇埃立克体属、莱姆病螺旋体、新型回归热螺旋体的检出率均较高,分别为26.1%(12/46)、76.1%(35/46)、13.0%(6/46)。除新型回归热螺旋体外,其他4种病原体的检出率雄蜱均高于雌蜱(P<0.05);成蜱的无形体、埃立克体、莱姆病螺旋体检出率均高于幼蜱(P<0.05)。大兴安岭林区牙克石段蜱的复合感染率为19.5%(544/2 786)。其中,免渡河镇蜱携2种病原体复合感染率为40.6%(186/458),乌奴耳镇蜱携3种及以上病原体复合感染率分别是47.4%(36/76)、90%(9/10)。结论 大兴安岭林区牙克石段共存在4种蜱,蜱携莱姆病螺旋体最普遍,其中免渡河镇和乌奴耳镇的蜱普遍携带多种病原体,需重点加强该地区蜱媒传染病的监测和预防。
2021 Vol. 37 (9): 845-850 [摘要] ( 157 ) [HTML 1KB] [PDF 1198KB] ( 788 )
疾病防治
851 马琳, 刘东立, 毛凌峰, 王益群, 丁龙, 王安礼
纳米孔测序技术鉴定陕西省首例马尔尼菲青霉菌感染病例
目的 对1例严重感染性疾病进行病原学检测,查明感染来源,为临床诊断治疗提供依据。方法 调查了解患者流行病学史、临床症状及体征,开展一般实验室检测。提取患者血样核酸,利用基于纳米孔测序的宏基因组分析技术,查询病原线索;利用真菌ITS通用引物、马尔尼菲青霉菌PCR以及利什曼原虫、组织荚膜胞浆菌PCR引物进行鉴别;对患者血样进行真菌双相培养确诊。结果 患者曾有不洁同性及异性性交史,常去东南亚地区旅行,临床症状及体征符合HIV感染表现,HIV初筛及确证实验为阳性,利什曼原虫抗体阴性。利用纳米孔测序仪MinION实际测序时间3.5 h,共获得84 000条Reads,序列长度均值7 088.7 base,最长为87 471 base,最短为562 base,总数据量为495 Mb。将basecalling所获数据上传EPI2Me,以WIMP workflow分析,有63 617条为人类基因组数据,13条马尔尼菲青霉菌序列;真菌ITS扩增测序结果鉴定为马尔尼菲青霉菌,马尔尼菲青霉菌PCR结果阳性,组织荚膜胞浆菌PCR阴性;真菌双相培养在25 ℃为霉菌样菌落,37 ℃为酵母样菌落,经鉴定均为马尔尼菲青霉菌。结论 该患者为中国陕西省首次报道的HIV合并马尔尼菲青霉菌感染病例,基于纳米孔测序的宏基因组分析技术可做为临床疑难感染性疾病快速诊断的一种指示方法。
2021 Vol. 37 (9): 851-857 [摘要] ( 126 ) [HTML 1KB] [PDF 2760KB] ( 823 )
858 李胜, 何建, 辛有全, 杨晓艳, 靳娟, 张琪, 杨建国, 熊浩明, 柏吉祥, 代瑞霞
左氧氟沙星和莫西沙星治疗豚鼠实验感染鼠疫的研究
目的 观察左氧氟沙星和莫西沙星治疗豚鼠实验感染鼠疫的疗效。方法 参照《中华人民共和国国家药典》成人剂量,用施新猷的动物折算系数法换算成豚鼠每日每千克体重用药剂量[左氧氟沙星40 mg/(kg·d),莫西沙星32 mg/(kg·d)],用灭菌生理盐水稀释成水剂后,以皮下注射法治疗鼠疫菌141株感染24 h后的实验动物。连续用药9 d后停药,经医学观察9 d后处死,自然死亡及处死动物解剖取脏器进行鼠疫细菌学检验。结果 左氧氟沙星和莫西沙星治疗组实验动物全部存活,存活率均为100%;存活动物处死后,解剖取脏器进行细菌学检验,结果均为阴性。对照组动物于感染后3~5 d全部死亡,并从各脏器中分离到鼠疫菌,均为特异性死亡。结论 左氧氟沙星和莫西沙星对豚鼠实验感染鼠疫的治疗效果均有效,特殊情况下可替代链霉素用于鼠疫的预防和治疗。
2021 Vol. 37 (9): 858-860 [摘要] ( 147 ) [HTML 1KB] [PDF 1029KB] ( 770 )
861 罗波艳, 聂守民, 安翠红, 孙养信, 常文辉, 戴先红, 范锁平
2020年陕西省一起布鲁氏菌病暴发疫情的调查分析
目的 调查2020年陕西省泾阳县一起家庭布鲁氏菌病(布病)暴发疫情的原因,明确传染源和传播途径,为阻断疫情传播提供科学依据。方法 对报告病例开展布病流行病学调查,并对病例和牲畜进行布病检测和布鲁氏菌分离培养鉴定种型,对结果进行描述和分析。结果 共发现7例确诊病例和6例隐性感染者;确诊病例发病时间为3月18日至5月7日,临床表现以发热为主;经分析,病例发病与食用牛肉无关联(OR=0.48,95%CI:0.08~2.85),与去过首发病例家有关(OR=141.00, 95%CI:17.15~1 159.28);13例病例、2只羊和2只公犬布鲁氏菌抗体检测阳性,血清抗体滴度从1∶100(++)到1∶800(++++)以上;从2例病例、2只羊和1只公犬血液中共分离到5株布鲁氏菌,均为羊种3型,MLVA-16基因型均为(1-5-3-13-2-2-3-2-4-41-8-6-4-3-4-5)。结论 该起布病家庭暴发疫情的原因为公犬叼食了布病阳性羊只的流产物而感染布病,继而人通过与病犬直接接触以及接触被病犬污染的水等生活物质而发病。
2021 Vol. 37 (9): 861-865 [摘要] ( 139 ) [HTML 1KB] [PDF 1633KB] ( 927 )
866 王会玉, 李洪, 许振发, 王妹妹, 莫海花, 周苗, 陈映
多杀巴斯德菌感染的临床研究
目的 分析多杀巴斯德菌感染人的感染途径、临床特征及药物治疗,提高临床对多杀巴斯德菌的认识。方法 通过琼海市人民医院收治的1例猫咬伤致伤口感染多杀巴斯德菌的病例报告,同时通过中国知网数据库和万方数据库等检索工具检索相关文献,结合文献报告的病例特点和本例病例特点进行分析。结果 多杀巴斯德菌可通过猫、狗抓咬伤人而感染,或免疫力低下的人通过密切接触宠物而吸入含多杀巴斯德菌的气溶胶而感染,该菌可引起伤口感染或者全身性症状,如伤口化脓、肺炎、脑膜炎、菌血症等。可选青霉素类或第二、三代头孢菌素或氟喹诺酮类药物治疗。结论 随着人们养宠物的增多,多杀巴斯德菌感染人已成为一种公共卫生问题,微生物室和临床应重视多杀巴斯德菌引起的感染,同时人们也需加强对宠物的管理。
2021 Vol. 37 (9): 866-870 [摘要] ( 125 ) [HTML 1KB] [PDF 15407KB] ( 1167 )
学术资料
871 阚乃鹏
美国《Emerging Infectious Diseases》2021年第7期有关人兽共患病论文摘译
2021 Vol. 37 (9): 871-872 [摘要] ( 114 ) [HTML 1KB] [PDF 300KB] ( 799 )
中国人兽共患病学报
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喜讯:《中国人兽共患病学报》7篇论文入选2015年度和2016年度F5000
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2014年《中国人兽共患病学报》优秀论文
2013年度学报入选F5000证书
《中国人兽共患病学报》开通微信公众平台
本刊2014年度获得中国科协精品科技期刊工程延续项目
《中国人兽共患病学报》荣获“2013年期刊优秀栏目”金奖
 
 
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