猪链球菌2型中国强毒株05ZYH33ofs基因敲除突变株构建及其生物学特性研究
李敏1,2, 王晶1,2, 史沛举2, 郭静静2, 杜骁杰2, 李先富2, 王长军2, 潘秀珍1,2, 高基民1,
1.温州医学院检验医学院、生命科学学院 温州 325035;
2.南京军区军事医学研究所 南京 210002, Email:limin.keke@163.com
通讯作者:高基民,Email:jimingao@yahoo.com; 潘秀珍,Email:panxiuzhen_2004@163.com
摘要
目的 探究猪链球菌血清浑浊因子ofs基因在强致病性2 型猪链球菌致病过程中的作用。方法 利用同源重组基因敲除方法构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为ofs编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,同源重组筛选ofs基因敲除突变株,通过组合PCR、Southern杂交和DNA 测序对疑似突变株进行验证。生物学功能实验研究比较ofs突变株和野生株05ZYH33在革兰氏染色、菌落溶血活性、生长速率和毒力等方面的差异。结果 组合PCR、Southern杂交和DNA 测序结果均证实ofs基因敲除突变株05ZYH33 Δofs构建成功,体外实验结果显示ofs 基因缺失后菌株在革兰氏染色和菌落溶血活性及形态、生长速率等方面未发生改变,但小鼠毒力实验数据结果表明敲除突变株Δofs的毒力降低。结论 猪链球菌2 型ofs基因与细菌的毒力相关,本实验构建的突变株05ZYH33 Δofs为进一步研究猪链球菌2型的致病机理奠定基础。
关键词: 猪链球菌2型; ofs; 基因敲除; 生物特性; 毒力
中图分类号:R378.1 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2014)03-0223-07
Construction and characterization ofofs gene knock-out mutant ofStreptococcus suis 2 Chinese highly virulent strain 05ZYH33
LI Min1,2, WANG Jing1,2, SHI Pei-ju2, GUO Jing-jing2, DU Xiao-jie2, LI Xian-fu2, WANG Chang-jun2, PAN Xiu-zhen1,2, GAO Ji-min1
1.Department of Medical Laboratory Science, School of Life Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China
2.Institute of Military Medical Sciences, Nanjing Command, Nanjing 210002, China
Corresponding authors: Gao Ji-min, Email: jimingao@yahoo.com; Pan Xiu-zhen, Email: panxiuzhen_2004@163.com
Abstract

To study the functionality of the opacity factor ofS. suis (ofs) in pathogenicity of Chinese virulent strain 05ZYH33, we constructed a gene knock-out mutant ofofs gene based on the principle of homologous recombination. Recombinant gene knock-out vector was constructed consisting ofSpcrcassette with the flanking homology regions of gene ofs. The resulting mutant strains were further confirmed by PCR analysis, Southern hybridization and DNA sequencing. To better assess the role ofofs gene in the virulence of 05ZYH33, gram strain analysis, hemolytic activity, growth characteristics, and experimental infection of mice was adopted. The results suggested that the mutant of 05ZYH33ofs gene was successfully constructed. Analysis of biological characteristics showed that there was no obvious distinction in gram strain analysis, hemolytic activity and growth rates between the mutant and the wild type strain 05ZYH33. Virulence assays with murine model confirmed that the mutant was a low virulent strain. These observations indicate thatofs is critical for the full virulence of 05ZYH33. The construction of the mutant strain 05ZYH33Δofs laid the foundation for the further study on the mechanisms ofS. suis 2 during infection.

Keyword: Streptococcus suis 2; ofs; gene knock-out; biological characteristics; virulence assay
引言

猪链球菌2型( Streptococcus suis 2, S. suis 2)是一种危害全球的人兽共患病病原菌。该病原菌不仅可致猪脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎及心内膜炎等,而且还可感染人,给相关从业者和广大群众的生命安全造成严重威胁[ 1, 2]。但目前 S. suis 2致病的具体机制仍不清楚。对于猪链球菌毒力因子的研究一直是一个热点,目前只有荚膜多糖(CPS)是唯一证明的主要毒力因子[ 3]。其它已知的与 S.suis致病性相关的毒力因子有溶菌酶释放蛋白(muraminidase released protein,MRP)、胞外因子(extracellular factor,EF)、溶血素(suilysin,Sly),二肽酶Ⅳ(Dipeptidyl Peptidase IV)、烯醇化酶(Enolase)以及猪链球菌组氨酸三聚体蛋白(Histidine triad protein of S. suis,Htps)等[ 4, 5, 6, 7, 8, 9] S. suis 2的不同分离株致病性具有很大差异,可能与其毒力因子密切相关。猪链球菌血清浑浊因子(Opacity factor of S. suis,OFS)是猪链球菌中新近鉴定的的一种重要的毒力因子[ 10]。本课题组前期通过对中国强毒株05ZYH33进行生物信息学分析,证实基因组中存在 ofs编码基因(05SSU1663),该基因位于基因组1575793-1578639 bp之间(基因全长2 847 bp),并且对该基因的N-末端功能区域 ofs37 - 683进行了敲除[ 11]。在此基础上,为了进一步研究 ofs S. suis 2致病过程中的作用,我们以强致病株 S.suis 05ZYH33为研究对象,利用同源重组的基因敲除原理构建了 ofs基因全长敲除突变株, 并通过猪链球菌2型感染BALB/c小鼠模型实验证实猪链球菌血清浑浊因子 ofs基因全长缺失株对细菌毒力的影响,为进一步探究 S. suis 2新的致病因子及其致病机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物 文中所用菌株和质粒以及引物见表1表2

表1 实验所用的菌株、质粒 Tab. 1 Bacterial strains, plasmids and primers used in this study

表2 实验所用引物序列 Tab.2 Primers used for PCR amplification and detection

1.1.2 主要试剂和仪器 ExTaq DNA聚合酶、DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、质粒DNA抽提试剂盒均为Takara公司产品;胶回收试剂盒为Promega公司产品,Todd-Hewitt Broth(THB)培养基为Difco公司产品;Gene Pulser XcellTM型电穿孔仪为Bio-Rad公司产品;Biodyne􀆿 B 正电荷尼龙膜(8 cm×12 cm)、CL-XPosureTM X 光胶片(5′×7′)、North2South􀆿DNA 随机引物生物素标记试剂盒、North2South􀆿化学发光杂交检测试剂盒为Pierce公司产品; parafilm 膜和WB506 型杂交袋为上海西唐生物科技有限公司产品;Whatman 3MM 滤纸为Whatman公司产品;显影粉和定影粉为江苏广达摄影材料厂产品;核酸杂交仪为HYBAID公司产品;Ultrospec2000型紫外分光光度计为Pharmacia公司产品。

1.1.3 实验动物 BALB/c小鼠( SPF 级) ,雌性,4周龄,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.2 05ZYH33 ofs基因敲除突变株的构建和鉴定 1.2.1 基因敲除载体的构建 以 S.suis 2 05ZYH33基因组DNA为模板,用引物对LA1 /2、RA1 /2分别扩增 ofs基因的上下游DNA片段LA及RA; 同时以pSET2质粒为模版,用引物Spc1/2扩增壮观霉素抗性基因(spcrcassette)。分别将LA、RA片段连接到 pMD-18T上,将Spc片段到pUC18上。在限制性内切酶 EcoR I和 BamH I及T4DNA连接酶的作用下,将LA连接到pUC18-spc上,再利用限制性内切酶 Sal I和 Sph I及T4DNA连接酶将RA连接到pUC18-LA-spc上,形成一个spcr基因两侧具有与 ofs上下游同源序列同源的基因敲除载体pUC18-LSR(图1),并通过双酶切和测序对其验证。

图1 ofs基因敲除载体构建示意图Fig.1 Construction of gene knock-out plasmid pUC18-LSR

1.2.2 基因敲除突变株的构建和和鉴定 参照Smith等[ 12]的方法制备 S.suis 2 05ZYH33感受态细菌。在22.5 Kv/cm、500 Ω和25 μF电转参数下,将基因敲除载体pUC18-LSR电转化入感受态细菌,电转结束后将菌液涂布于THB平板(含100 mg/mL壮观霉素),37 ℃培养48 h后,挑取单菌落进行培养并取2 μL菌液作模板,用引物对IN1/IN2 (位于 ofs基因的内部)进行PCR初步筛选,并对疑似阳性菌株进行组合PCR和Southern杂交验证。

1.3 生物学特性分析

1.3.1 革兰氏染色分析 分别将突变株和野生型接种THB 培养基(含10%胎牛血清)中于37 ℃培养至 OD600≈0.6, 用接种环取样均匀涂布于载玻片上, 自然晾干后进行常规革兰氏染色,于油镜( 1000 倍)下观察菌落形态。

1.3.2 菌落形态和溶血活性的比较 将突变株△ ofs和野生株 05ZYH33 用三线法分别划线接种于 THB琼脂血平板(5%绵羊血), 37 ℃培养48 h后,观察突变株和野生株在菌落形态和溶血活性方面的差异。

1.3.3 细菌生长速率的比较 取等量( OD600≈0. 008)的突变株和野生株菌液37 ℃振荡培养,每间隔1 h测取 OD600值,直至细菌生长处于稳定期,重复实验3次并绘制生长曲线。

1.3.4 小鼠致病性实验 参照本实验室常规的方法进行[ 13, 14, 15]。30只BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只。将野生株05ZYH33和突变株Δ ofs于37 ℃过夜培养12 h,次日以1∶100的比例接种于新鲜配制THB中生长至 OD600≈0.4,分别经腹腔接种野生株05ZYH33与敲除株Δ ofs 菌液各1 mL (1×108 CFU / 只),阴性对照组注射THB培养基1 mL,及时观察记录小鼠发病及死亡情况。

2 结 果

2.1 05ZYH33 ofs基因敲除载体的验证 对构建好的重组质粒进行PCR(图2)和双酶切验证(图3), 结果与预期一致。对重组质粒的测序结果也显示3个片段LA(1 024 bp)、Spc(1 130 bp)和RA(989 bp)连接测序正确,重组质粒构建成功。

2.2 05ZYH33 ofs基因敲除突变株的初步筛选

用引物对IN1/IN2对挑取的单菌落进行PCR。由于引物对IN1/IN2位于 ofs基因内部(产物大小为915 bp),如果 ofs基因被Spc抗性基因所置换,那么PCR扩增会得到阴性结果,反之则说明 ofs基因未被敲掉。通过这种方法进行初步筛选。在一组菌液PCR扩增中,IN1/IN2引物扩增结果(图4)中3泳道为阴性,选择该株做进一步验证。

图2 PCR扩增产物凝胶电泳Fig.2 Gel electrophoresis of PCR product
1: 1 kb DNA ladder marker; 2: PCR products with LA1/LA2; 3: PCR products with Spc1/Spc2; 4: PCR products with RA1/RA2; 5: PCR products with LA1/Spc2; 6: PCR products with Spc1/RA2; 7: PCR products with LA1/RA2.

图3 pUC18-LSR双酶切鉴定Fig.3 Restriction enzyme digestion of the recombinant plasmid pUC18-LSR
1: 1 kb DNA ladder; 2: Digested by EcoR I and BamH I; 3: Digested by BamH I and Sal I; 4: Digested by Sal I and Sph I; 5: Digested by EcoR I and Sal I; 6: Digested by BamH I and Sph I; 7: Digested by EcoR I and Sph I.

图4 PCR鉴定Fig.4 PCR analysis
1: 1 kb DNA ladder marker; 2-9: Mutant strains; 10: Positive control (DNA of 05ZYH33);11: Negative control (sterile water).

2.3 05ZYH33 ofs基因敲除突变株的组合PCR鉴定 根据05ZYH33 基因组DNA序列,分别于 ofs编码基因上下游的外侧设计两条引物OUT1(位于LA上游)和OUT2(位于RA下游),引物位置如图5A所示。 ofs基因敲除突变株用引物对OUT1/Spc2、Spc1/OUT2和Spc1/2经PCR扩出大小分别为2 225 bp、2 246 bp和1 130 bp的片段,而在野生菌株05ZYH33中则未见相应片段,以野生株05ZYH33基因组为模版,用引物IN1/IN2能扩出的915 bp的片段,在突变株中未能扩出相应片段。组合PCR的结果(图5B)与以上理论完全一致。同时,用引物对OUT-1 /OUT-2 扩增的PCR 产物(图5C)进行克隆和测序,测序结果亦证明所获得的菌株已经成功发生双向同源重组。

图5 组合PCR鉴定Fig.5 Multiple-PCR analysis
A: Primers design;B: IN1/IN2: 1--05ZYH33, 2--Δ ofs; Spc1/Spc2: 3--05ZYH33, 4--Δ ofs; OUT1/Spc2: 5--05ZYH33,6--Δ ofs; Spc1/OUT2: 7--05ZYH33, 8--Δ ofs;C: OUT-1 /OUT-2: 1--05ZYH33, 2--Δ ofs.

2.4 05ZYH33 ofs基因敲除突变株的Southern鉴定 通过Southern杂交对Δ ofs基因组上的突变基因进行定位分析。使用 ofs基因中间片段(引物IN1/IN2的PCR产物)作为标记探针,用随机引物法进行生物素标记,参照试剂盒说明书进行操作。杂交结果如图 6B所示,基因敲除载体pUC18-LSR 与细菌的染色体重组后可能出现3种情况(如图6A所示),3种情况下杂交带的大小有所不同。在野生株05ZYH33基因组酶切产物中,出现了一条约4.5 kb的 Sca I单酶切片段,与预计酶切片段4.5 kb(等位基因置换)大小相符(图6B,泳道1),而在突变株中未出现条带(图6B,泳道2),说明 SpcR基因已经通过双交换同源重组置换了 ofs编码基因(图6A-I)。在mutant1基因组酶切产物中,出现了一条大约7.2 kb的 ofs探针杂交带,说明mutant1只是发生了5′端同源序列单交换的突变株(图 6B,泳道 3)。结果充分证实 ofs基因在基因水平已被成功敲除。

图6A 同源重组示意图Fig.6 A Homologous recombination schematic diagram
Ⅰ: Double cross-over; Ⅱ: 5′ single cross-over; Ⅲ: 3′ single cross-over.

图6B 突变株Δ ofs的Southern杂交分析Fig.6 B Southern hybridization analysis of mutant Δ ofs
1: 05ZYH33 genome/ ScaI; 2: Δ ofs genome/ ScaI; 3: Mutant1 genome/ ScaI.

2.5 革兰氏染色分析 取生长至 OD600≈0.6的突变株△ ofs和野毒株05ZYH33进行革兰染色,显微镜下观察发现(图7),二者均为典型的革兰阳性菌,菌体形态为圆形或椭圆形,呈链状排列,呈短链状排列,无明显差异。

图7 革兰氏染色分析Fig.7 Gram strain analysis

2.6 菌落形态和溶血活性的比较 将野生株05ZYH33和突变株△ ofs接种于羊血THB 平板并于37℃孵育48 h 后,可见二者均长出灰白色、圆形半透明、湿润、表面光滑的细小菌落(直径为1~2 mm),菌落周围有明显的β-溶血环 (图8)。表明与野生株相比,突变株的菌落形态和溶血活性没有发生明显的变化。

图8 溶血活性分析Fig.8 Hemolytic activity analysis

2.7 细菌生长特性比较 在相同的培养条件下绘制野生株与突变株的的生长曲线(图9),从图中可以看出,突变株和野生株的生长速率相近,于接种后3 h左右进入对数生长期,约在培养10 h后进入平台期,并无显著差别。

图9 生长特性比较Fig.9 Growth characteristics analysis

2.8 小鼠致病性实验 观察结果显示,攻毒16 h后野生株注射组死亡9只,突变株死亡5只。24 h后野生株注射组小鼠全部死亡,突变株4只存活。36 h后突变株3只存活。阴性对照组10只状态均良好。持续观察3 d,未见发病和异常情况发生。用Kaplan-Meier生存函数分析方法比较突变株与野生组小鼠的存活率,并绘制生存曲线(图10), P<0.05,说明 ofs基因敲除使得05ZYH33的毒力减弱。

图10 小鼠生存曲线Fig.10 Survival curves for BABL/c mice infection experiments

3 讨 论

猪链球菌血清浑浊因子OFS是新近鉴定的猪链球菌中的一种毒力因子。Baums等[ 10]研究表明OFS具有革兰氏阳性细菌表面蛋白的典型特征: N-末端的信号肽,大的N-末端区域,重复序列和C-末端的LPXTG锚定位点。本研究前期通过生物信息学分析发现, S.suis 2 05ZYH33 中存在 ofs编码基因[ 11]。通过比较OFS与 S. pyogenes的SOF及 S. dysgalactiae的FnBA的序列,发现OFS与SOF及FnBA在序列上有同源性,推测它们在功能上也有相似性。它们属于一类称作微生物表面识别粘附基质分子的组分(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules,MSCRAMMs)的细菌表面配基。广泛存在于哺乳动物的组织液、基质或细胞的外表面,是化脓性链球菌、停乳链球菌黏附和定植到宿主细胞表面的主要介质,因此这些蛋白是链球菌入侵的重要毒力因子[ 16]

S. pyogenes中通过插入失活构建的 sof突变株对小鼠的致病能力降低,在人全血中的存活率也降低[ 17]。用重组的SOF能够起到免疫保护作用,揭示SOF是一种重要的毒力因子[ 18]。以猪为模型的动物实验也证实 ofs的缺失导致2型猪链球菌毒力的降低[ 10]。对于猪链球菌毒力因子的研究一直是热点,荚膜多糖CPS为 S. suis 2 中目前唯一明确的毒力因子。然而并不是所有有荚膜的2型猪链球菌菌株都有致病性。不同的菌株间毒力上存在着差异[ 19, 20]

实验室前期基于基因敲除技术,致力于探索研究新的致病相关基因的功能及其在 S. suis 与宿主相互作用中发挥的作用,构建了多个 S. suis 2毒力相关因子突变株,对它们的致病力强弱及致病机制进行了相关研究,为深入探讨猪链球菌2型致病机制积累了丰富的数据资料。本研究根据同源重组原理构建了中国强毒株05ZYH33 ofs 基因全长敲除突变株,并通过组合PCR、Southern杂交和DNA测序对敲除突变株进行了鉴定。通过一些生物学特性比较显示, Δ ofs基因突变株和野生株05ZYH33在成链形态及链长短、溶血活性、生长特性方面均无明显差异。小鼠毒力实验表明 ofs基因缺失株的毒力较野生株明显降低,与前述报道的结果相似。由此可见,OFS是中国强毒株05ZYH33的一个潜在毒力因子。在此基础上我们还将进一步研究△ ofs突变株与野生株在粘附和抗细胞吞噬方面的差异,以期阐明 ofs基因在猪链球菌2型05ZYH33强致病过程中的作用机制。

The authors have declared that no competing interests exist.

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