1.2 主要仪器和试剂 PCR仪和Gel Doc 2000凝胶成像系统购于美国Bio-Rad公司；Smart CyclerⅡ实时荧光定量PCR仪购于美国Cepheid公司；7H9液体培养基购于美国Sigma公司；Taq DNA聚合酶、dNTP购于北京天根生物工程公司；细菌RNA提取试剂盒购于美国Omega公司；逆转录试剂盒购于上海东洋纺生物科技有限公司；荧光定量PCR试剂盒购于大连宝生物工程公司；结核分枝杆菌16kD、Hsp65、38kDa单克隆抗体和Ag85B多克隆抗体购于美国Abcam公司,MPT64多克隆抗体购于北京博尔迈生物技术有限公司；β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG购于北京中衫金桥生物技术有限公司；ECL发光试剂盒购于美国Thermo公司。

1.3 结核分枝杆菌的分离培养及鉴定 60株临床分离株均运用鉴别培养基PNB(对硝基苯甲酸)和TCH(噻吩-2-羧酸肼)进行了分支杆菌菌种初步鉴定^{[ 6]},并进一步用PCR法扩增16SrRNA 和MTP40进行MTB复合群鉴定,确定为人型结核分枝杆菌^{[ 7]}。北京/W系结核分枝杆菌经RD105缺失基因检测法进行鉴定确认^{[ 8]}。

1.4 基因克隆及测序 结核分枝杆菌 DNA制备：取适量细菌于500 μL的双蒸水中,85 ℃灭活30 min,8 000 r/min离心5 min,弃上清,加入500 μL TE充分混合,85 ℃水浴30 min,12 000 r/min离心5 min,取上清液于-20 ℃保存备用。通过GenBank查找5个目的蛋白HspX、Hsp65、38 kDa、Ag85B和MPT64对应的编码基因 hspX、 groEL2、 psts1、 fbpB和 mpt64的基因序列,应用primer 5.0软件设计特异性引物(表1), PCR扩增产物经1％ 琼脂糖凝胶电泳验证正确后测序以检测目的基因有无突变。引物合成与基因测序均由上海生工生物技术有限公司完成。

1.5 MTB总RNA的提取及逆转录 取7H9液体培养基中处于对数生长期的菌液3 mL,8 000 r/min离心5 min,PBS洗涤3次,弃上清,按照细菌RNA提取试剂盒说明进行操作。用核酸蛋白仪测定mRNA的浓度和纯度,调整配平每个样本mRNA的量,取等量mRNA用于逆转录。将mRNA先于65 ℃变性5 min,立即置于冰上。逆转录体系为primer mix 0.5 μL,逆转录酶0.5 μL,Buffer 2.0 μL,RNA 1.0 μL,无Rnase H₂O 6.0 μL。37 ℃ 15 min,98 ℃ 5 min,逆转录为cDNA,-20 ℃保存备用。

1.6 实时定量PCR样品检测：应用primer 5.0软件设计5个目的基因和内参基因 Siga的特异性引物(表2)用于实时荧光定量PCR,扩增产物长度为100-300 bp。qRT-PCR反应体系：SYBR Premix 10 μL,H₂O 7 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 2 μL。每个样品重复检测3次。

表1

Tab.1

表1(Tab.1)

表1 基因测序的引物序列 Tab.1 Primer sequences for gene sequencing Primer Sequence (5′- 3′) Amplicon size/bp PCR annealing temperature/℃ hspX F： CGCGGATCCATGGCCACCACCCTTC 453 62 R： CCCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGG groEL2 F：ATGGCCAAGACAATTGCGTA 1 623 53 R：TCAGAAATCCATGCCACCC psts1 F：AAATGAACCTGGTCGAGGAAC 848 60 R：TTTCACGAGAGGTATCCGAAC fbpB F：ATGACAGACGTGAGCCGAA 970 56 R：CGCCTAACGAACTCTGCAG mpt64 F：AAGATCTTCATGCTGGTCACG 678 56 R：CTAGGCCAGCATCGAGTCG

表1 基因测序的引物序列 Tab.1 Primer sequences for gene sequencing

表2

Tab.2

表2(Tab.2)

表2 实时荧光定量PCR引物序列 Tab.2 Primer sequences for qRT-PCR Primer Sequence (5′- 3′) Amplicon size/bp PCR annealing temperature/℃ hspX F：GACAAGGACGTCGACATTA 173 60 R：CCTTGTCGTAGGTGGCCTTA groEL2 F： GTAGTGGCTTACCCGTTCCTG 195 60 R： TGGGCACCGAGTTGGAGT psts1 F： GATGTTCATCAGCCCCTTGT 187 62 R： CTACCCGCTGTTCAACCTGT fbpB F： GAACAACTCACCTGCGGTTT 215 62 R： TCAGGAAGGTTTCCCACTTG mpt64 F： TCGTTTTGCTCTGTTGTTCG 185 62 R： CGTCTGGGCGATGTAATTTT Siga F： TCGAGGTGATCAACAAGCTG 254 62

表2 实时荧光定量PCR引物序列 Tab.2 Primer sequences for qRT-PCR

1.7 总蛋白的制备 结核分枝杆菌感染巨噬细胞RAW264.7 24 h后,收集细胞,2 000 r/min离心10 min,弃上清,用PBS洗涤3次。按照每10⁶个细胞加入250 μL高效RIPA裂解液(细胞裂解液:PMSF＝100:1),静置30 min。超声破碎1 min,振幅70％,超声1 s,停止1 s。14 000 r/min,4 ℃离心25 min,取上清。用核酸蛋白仪测定蛋白浓度,调整配平每个样本的蛋白量。

1.8 Western blot检测蛋白表达 将蛋白于100 ℃变性5 min,取50 μg蛋白上样,以β-actin为内参进行SDS-PAGE电泳(5％浓缩胶和12％分离胶),通过半干转印法转移至PVDF膜上,于5％脱脂牛奶中封闭2 h,一抗4℃孵育过夜(结核分枝杆菌16 kD单克隆抗体1:2 000稀释, Hsp65单克隆抗体1:100稀释,38 kDa单克隆抗体1:5 000稀释,Ag85B多克隆抗体1:5 000稀释,MPT64多克隆抗体1:1 000稀释,β-actin单克隆抗体1:1 000稀释),TBST洗膜5次,每次10 min,二抗室温孵育1 h(1:5 000稀释),TBST充分洗膜,ECL显色曝光。

1.9 统计学分析 结果运用SPSS17.0软件进行统计学分析,五种重要蛋白在北京/W系和非北京/W系结核分枝杆菌间的比较分析采用 t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 基因测序分析 结核分枝杆菌标准株H37Rv及临床分离株北京/W系与非北京/W系菌株的5个目的蛋白HspX、Hsp65、38kDa蛋白、Ag85B和MPT64对应的编码基因 hspX、 groEL2、 psts1、 fbpB和 mpt64 PCR扩增产物进行测序,在GenBank中进行Blast比对,结果与标准株同源性为100％,未检测到基因突变。

2.2 mRNA水平的相对表达 实时荧光定量PCR的结果采用相对定量法2^-ΔΔCt值比较结核分枝杆菌临床分离株北京/W系与非北京/W系菌株不同基因mRNA的表达量(表3)。校正结果以非北京/W系菌株mRNA的表达量为1,北京/W系菌株与之比较(图1)。结果显示北京/W系菌株38kDa蛋白、Ag85B对应的编码基因 psts1、 fbpB mRNA的表达水平低于非北京/W系菌株,差异有统计学意义( P<0.05)；HspX、Hsp65和MPT64对应的编码基因 hspX、 groEL2和 mpt64 mRNA的表达水平与非北京/W系菌株相比,差异无统计学意义( P>0.05)。

表3

Tab.3

表3(Tab.3)

表3 结核分枝杆菌 mRNA的表达量 Tab.3 The mRNA expression level in MTB Strain Expression levels (x ±s) hspX groEL2 psts1 fbpB mpt64 Beijing/W lineage 0.67±0.18 1.10±0.35 0.86±0.37 0.66±0.22 0.63±0.36 Non-Beijing/W lineage 0.59±0.20 1.01±0.37 1.08±0.41 0.81±0.22 0.72±0.30 H37Rv 0.75 0.89 1.13 0.63 0.86 Comparison betWeen Beijing/W lineage and non-Beijing/W lineage t＝1.60 ( P>0.05) t＝1.01 ( P>0.05) t＝-2.61 ( P<0.05) t＝-3.42 ( P<0.05) t＝-1.30 ( P>0.05)

表3 结核分枝杆菌 mRNA的表达量 Tab.3 The mRNA expression level in MTB

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 北京/W系和非北京/W系MTB mRNA的相对表达水平注：*表示北京/W系与非北京/W系结核分枝杆菌比较差异显著( P<0.05)Fig.1 The mRNA relative expression level in Beijing/W lineage and non-Beijing/W lineage of MTBThe difference betWeen Beijing/W lineage and non-Beijing/W lineage strains is significant ( P<0.05).

2.3 蛋白表达水平 Western blot检测细菌感染巨噬细胞RAW264.7 24 h后结核分枝杆菌临床分离株北京/W系与非北京/W系菌株蛋白HspX、Hsp65、38 kDa蛋白、Ag85B和MPT64的表达水平。结果用Quantity One软件分析条带灰度值,以目的条带的灰度值和对应样本β-actin的灰度值的比值代表蛋白的相对表达量(表4,图2)。

结果显示细菌感染细胞24 h后,北京/W系菌株HspX、Hsp65的表达水平高于非北京/W系菌株,38 kDa蛋白、Ag85B的表达水平低于非北京/W系菌株,差异均有统计学意义( P<0.05),MPT64的表达未见差异( P>0.05)。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 北京/W系和非北京/W系MTB蛋白表达水平的比较注：*表示北京/W系与非北京/W系结核分枝杆菌比较, P<0.05Fig.2 Comparison on expression level of the protein in Beijing/W lineage and non-Beijing/W lineage of MTBThe difference betWeen Beijing/W lineage and non-Beijing/W lineage strains is significant ( P<0.05).