新疆北疆地区猪Torque teno病毒的PCR检测和序列分析
施研进, 王礼伟, 屈勇刚, 石家成
杨河子大学动物科技学院 石河子 832003
通讯作者:屈勇刚,Email:quyonggang@shzu.edu.cn
摘要
目的

为了解新疆北疆地区猪群中Torque teno virus(TTV)感染流行情况。方法 以TTV非编码区保守序列设计引物,采用PCR方法对猪源TTV进行检测,挑选部分阳性样品进行序列分析。结果 共检测了该地区109份猪血样,检测结果表明,TTV1的感染率为56.88%(62/109);TTV2的感染率为22.01%(24/109);TTV1和TTV2混合感染率为18.34%(20/109)。同时,获得TTV1序列3个,TTV2序列4个,与参考序列相互比对,新疆北疆地区猪TTV1同源性为89.4%~95.2%;TTV2同源性为81.1%~99.2%。结论 TTV在新疆北疆猪群中广泛存在,说明猪TTV是一个不容忽视的病原。

关键词: Torque teno virus; PCR; 序列分析
中图分类号:R373 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2014)03-0255-04
PCR detection and sequence analysis of porcine Torque teno virus in the northern region of Xinjiang
SHI Yan-jin, WANG Li-Wei, QU Yong-gang, SHI Jia-cheng, YANG Yuan
College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832003, China
Corresponding author: Qu Yong-gang, Email:quyonggang@shzu.edu.cn
Abstract

The porcine Torque teno virus (TTV) infection in the northern region of Xinjiang Uyghur Autonomous Was investigated in this study. PCR method Was used to detect the porcine Torque teno virus infection, in Which the primers Were synthesized according to the untranslated region (UTR) of TTV genome. Part of PCR products Was cloned and sequenced. The sequences Were analyzed With ClustalX. A total of 109 porcine blood samples Were detected. Results shoWed that the TTV1 infection rate Was 56.88% (62/109), the TTV2 infection rate Was 22.01% (24/109), and the co-infection rate of TTV1 and TTV2 Was 18.34% (20/109). Having compared three TTV1 and four TTV2 partial DNA sequences With the reference TTV strains, isolated TTV1 strains Were 89.4%-95.2% homologous to reference TTV1 strains, and isolated TTV2 strains Were 81.1%-99.2% homologous to reference TTV2 strains. It demonstrated that the porcine TTV prevalence Was Widely in the northern region of Xinjiang.

Keyword: Torque teno virus; PCR; sequence analysis
引言

Torque teno virus(TTV)是一种单股环状DNA 病毒, 属圆环病毒科指环病毒属[ 1]。1997年,由日本学者NishizaWa等[ 2]首次发现于输血后表现肝炎的患者血清,故又被称为输血传播病毒。TTV在不同的人群中感染率较高,DNA 阳性率一般在10%以上,高的可达80%左右[ 3, 4]。已经证实,除人类外,猪、牛、羊、猫、狗、家禽等多种动物可以感染TTV[ 5]。目前认为,猪源TTV有TTV1和TTV2两种基因型[ 6]。研究发现,不同国家、不同地区的猪群中均存在TTV感染[ 5, 6, 7]。Segales等对1985-2005年间99个西班牙农场中162份猪血清进行TTV检测,研究发现母猪和商品猪的TTV1感染率分别为34.2 %和30.9%;TTV2的感染率分别为46.6%和62.8%,混合感染率分别为19.8%和24.5%[ 8]。Martinez 等[ 7]采测了欧洲178头野猪样本,检测发现 TTV1阳性率为58%,TTV2 阳性率为66%。我国猪TTV研究起步较晚,2009年,王礞礞等[ 6]首次证实我国猪群存在TTV感染,并获得了TTV1和TTV2全长基因序列。随后,大量研究表明我国猪群普遍存在TTV感染[4,6, 9, 10, 11]。为了了解有关新疆北疆地区猪TTV感染的流行病学,本研究分别以TTV1和TTV2基因组保守序列设计引物,应用PCR检测技术对该地区猪群中TTV感染状况进行调查。

1 材料与方法1.1 血液样品 109份抗凝血液采自新疆北疆地区某生猪屠宰厂。

1.2 主要试剂 血液基因组小量提取试剂盒、PCR扩增试剂2×EsTaq Master Mix、DNA Marker DM2000、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒均为北京康为世纪生物有限公司产品;pMD18-T载体由TAKARA公司生产;感受态大肠杆菌 E. coli DH5α由本实验室制备。

1.3 PCR检测引物设计 根据参考文献[ 11] 设计合成了如下两对引物,分别用于扩增 TTV1 和TTV2 的非编码区序列,其序列见表1

表1 TTV PCR检测用引物序列 Tab.1 Sequence of primers used for TTV PCR detection

1.4 总DNA的提取 根据北京康为世纪生物有限公司血液基因组提取试剂盒说明书操作。其中提取DNA时,每个血液样品加入量为300 μL,加入3倍体积的Buffer GR,其余步骤与操作说明相同。

1.5 PCR扩增 扩增猪TTV1时,引物选用TTV1F和TTV1R;扩增猪TTV2时,引物选用TTV2F和TTV2R(如表1)。PCR反应体系为:2×EsTaq Master Mix10 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、Rnase-free Water 7.6μL、DNA模板2 μL,总反应体系为20 μL。TTV1的反应条件为:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环,最后72 ℃延伸10 min;TTV2的反应条件为:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环,最后72 ℃延伸10 min。

1.6 PCR产物的鉴定 取 PCR 产物10 μL,用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,通过凝胶成像仪进行观察。

1.7 PCR产物的序列测定 PCR产物经过电泳、切胶后,通过DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化,连接至pMD18-T 载体上,转入感受态细菌DH5α,通过氨苄抗性进行筛选。阳性克隆经菌落PCR进一步鉴定后,保存于50%的灭菌甘油中,送北京华大基因生物技术公司测序。

1.8 基因序列的同源性分析 所获基因序列排序与比较使用Clustal X(verion1.8)、DNAStar,系统进化分析使用Phylip软件包,系统发生树的构建使用邻位相连法(Neighbor-Joining,NJ)。分析使用1 000次replicate。其中所用的参照序列见表2

表2 分析中所用的参照序列 Tab.2 Nucleotide sequence of the reference TTV strains used in this study

2 结 果2.1 PCR检测结果正式试验以前,先选取少量样品进行PCR检测,对PCR检测阳性者进行核酸序列测定和比对分析,确定为TTV核酸序列后作为正式试验的阳性对照。本次试验共检测了109份猪血样,其中TTV1检测出与阳性样品吻合的样品有62份,TTV1的感染率为56.88%(62/109);TTV2检测出与阳性样品吻合的样品有24份,TTV2的感染率为22.01%(24/109);TTV1和TTV2混合感染率为18.34%(20/109)。部分样品的电泳结果见图1图2

图1 TTV1检测结果Fig.1 Results of the porcine TTV1 PCR detection in the northern region of Xinjiang1: Positive control; 2-6: Samples; 7: Negative control; M: marker.

图2 TTV2检测结果Fig.2 Results of the porcine TTV2 PCR detection in the northern region of Xinjiang1, 2, 5, 6, 7: Samples; 4: Positive control;3: Negative control; M: Marker.

2.2 阳性克隆PCR检测结果选取TTV1和TTV2的阳性样品,再次进行PCR扩增,纯化后进行基因克隆,结果克隆得到TTV1基因片段3个,命名为TTV1S、TTV1A1、TTV1A2;克隆得到TTV2基因片段4个,分别命名为TTV2S1、TTV2S2、TTV2A1、TTV2A2,PCR验证正确,并全部正确测序,见表3

表3 用于序列分析的样品及来源 Tab.3 Samples and their sources used for nucleotide sequence analysis in this study

2.3 序列分析结果 通过ClustalX排序后,进行比对分析,所获TTV1和TTV2序列与参照序列的同源性分别为89.4%~95.2%、81.1%~99.2%;所获TTV1序列之间的同源性为94.2%~100.0%,所获TTV2序列之间的同源性为85.5%~99.1%,分别见图3图4。所构建的系统发生树见图5图6

图3 新疆北疆地区猪TTV1与参照序列的同源性比较Fig.3 Nucleotide sequence homology comparison of the porcine TTV1 in the north region of Xinjiang and the reference TTV1 strains

图4 新疆北疆地区猪TTV2与参照序列的同源性比较Fig. 4 Nucleotide sequence homology comparison of the porcine TTV2 in the northern region of Xinjiang and the reference TTV2 strains

3 讨 论

王礞礞等[ 6]对2008-2009年采集自国内7个省份的258份组织样品进行了TTV 感染情况的调查,结果证实在我国的猪群中存在TTV的感染,其中TTV1 感染率为37.6%,TTV2感染率为82.6%,TTV1和TTV2的共感染率为38.4%。随后,訾占超等[ 11]通过双重PCR 检测发现,我国猪群TTV的总体感染率为63.37% (1 261/1 990),其中TTV1感染率为55.88 %(1 112/1 990),TTV2为32.91%(655/1 990),TTV1和TTV2 双重感染率为25.43 %。大量研究证实,我国猪群普遍存在TTV感染,感染情况比较严重。

图5 新疆北疆地区TTV1部分核苷酸序列构建的系统发生树Fig. 5 Phylogenetic tree of partial nucleotide sequence of TTV1 strains isolated from the northern region of Xinjiang

图6 新疆北疆地区TTV2部分核苷酸序列构建的系统发生树Fig. 6 Phylogenetic tree of partial nucleotide sequence of TTV2 strains isolated from the northern region of Xinjiang

通过本研究发现,在新疆北疆地区,猪TTV1的感染率为56.88%(62/109);TTV2的感染率为22.01%(24/109);TTV1和TTV2混合感染率为18.34%(20/109);所获TTV1和TTV2序列与参照序列的同源性分别为89.4%~95.2%、81.1%~99.2%,所获TTV1序列之间的同源性为94.2%~100.0%,所获TTV2序列之间的同源性为85.5%~99.1%。证实新疆北疆地区猪群存在TTV感染。与国内其他研究结果相比较,发现新疆北疆地区猪TTV1的感染率均高于王礞礞、訾占超等的检测结果,说明新疆北疆地区TTV1感染率处于一个较高水平;然而,本研究中的TTV2的感染率和共感染率均低于其他地区,表明本地区TTV2的感染率相对较低。对出现这一现象的原因有待进一步深入研究。

至今尚不明确猪TTV感染会引起何种疾病。虽然,Kekarainen等[ 12] 在研究猪血清中的TTV 病毒时,发现其流行与猪圆环病毒 2型(PCV2)的流行具有一定的关联性,在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪群中,TTV的感染率为97%,在没有被PMWS感染的猪群中TTV的感染率为78%。在流行病学角度提示了猪TTV和PMWS之间存在一定联系。而TTV感染与PMWS的关系,或其致病机理有待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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