引用本文
顾文珍, 傅燕, 张姝, 胡逢蛟, 潘兴强, 许国章. 宁波市2004-2013年麻疹野病毒分离株的RT-PCR检测与分析. 2014, 30(8): 840-842[GU Wen-zhen, FU Yan, ZHANG Shu, HU Feng-jiao, PAN Xing-qiang, XU Guo-zhang. Wild-type measles viruses isolated in Ningbo,China,2004-2013. 中国人兽共患病学报, 2014, 30(8): 840-842]  
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宁波市2004-2013年麻疹野病毒分离株的RT-PCR检测与分析
顾文珍, 傅燕, 张姝, 胡逢蛟, 潘兴强, 许国章
宁波市疾病预防控制中心,宁波 315010
许国章，Email：xugz@nbcdc.org.cn
基金:宁波市重点科技创新团队计划资助（2012B82018）; 宁波市科技计划项目( 20080C5007));
摘要
目的

分析宁波2004-2013年麻疹野病毒的分子生物学特征。

方法

采用RT-PCR 对宁波2004-2013年分离的麻疹野毒株核蛋白基因碳末端450个核苷酸进行扩增,序列测定后与基因库中麻疹病毒各基因型参考株作比对分析。

结果

宁波2004-2013年分离的31株麻疹病毒均为H基因型,其中6株(包括2004年1株及2005年5株)为H1b亚型,其它均为H1a亚型。基因同源性比对结果显示,31株麻疹病毒与H1a亚型参考株China93-4的同源性为97.1%~100%,与H1b亚型参考株China94-7的同源性为96.7%~100%,与中国疫苗株S191的核苷酸同源性为81.9%~92.4%,氨基酸同源性为87.2%~90.6%。

结论

宁波2004-2013年麻疹病例主要由本土病毒株(H1亚型)传播引起,H1a基因亚型为绝对优势基因亚型,H1b亚型处于相对弱势,H1a亚型5个小分支病毒株引起的多个传播链造成麻疹野病毒在宁波广泛流行。

关键词: 麻疹野病毒; 基因型; 序列分析
中图分类号:R373 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2014)08-0840-03
Wild-type measles viruses isolated in Ningbo,China,2004-2013
GU Wen-zhen, FU Yan, ZHANG Shu, HU Feng-jiao, PAN Xing-qiang, XU Guo-zhang
Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention,Ningbo 315010,China
Xu Guo-zhang,Email:xugz@nbcdc.org.cn
Fund:Supported by the Program for Ningbo Leading Team of Scientific and Technological Innovation (No. 2012B82018); the Project of Ningbo Science and Technology Plan (No. 20080C5007);
Abstract

In this study,we analyzed the genetic characterizations and propagation paths of measles viruses prevalent in Ningbo,China from 2004 to 2013. Measles viruses were isolated from throat swab specimens from 2004 to 2013,and 450 bp fragments of C terminus of nucleoprotein (N) gene were amplified by RT-PCR. Sequence analysis was conducted of all 31 virus strains,and then compared with other measles virus strains published in GenBank. Results showed that all the 31 measles virus isolates belonged to genotype H1,6 strains (one strains in 2004 and 5 ones in 2005) belonged to H1b subtype,and others belonged to H1a subtype. Compared the 31 strains to the China 93-4 and China 94-7,the homology of 450 bp fragments of C terminus of nucleoprotein (N) gene were 97.1%-100% and 96.7%-100%,respectively. The homology of 450 bp fragments of nucleotide and nucleotide (amino acids) compared with S191 were 81.9%-92.4% and 87.2%-90.6%,respectively. It’s suggested that genotype H1 measles virus circulated in Ningbo from 2004 to 2013,and H1a was the predominant epidemic strain,and H1b strain was existed as well. There are five different transmission chains of H1a subtype caused measles co-circulations in Ningbo.

Keyword: measles virus; genotype; sequence analysis
引言

麻疹是一种危害严重、传染性极强的急性呼吸道传染病,又是一种疫苗可预防传染病。但宁波每年都有病例,为探究宁波2004-2013年分离的麻疹病毒的来源,特对分离的31株麻疹病毒进行基因测序和分析。

1 材料与方法
1.1 病毒来源

2004-2013年在宁波市传染病医院就诊病人,采集出疹3 d内的疑似麻疹病人的含漱液标本102份,离心取上清,加入终浓度含1 000 U/mL的青霉素和链霉素、50 U/mL的两性霉素,4 ℃作用2 h后接种在75%淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞(Vero/SLAM)上,37 ℃吸附1 h后弃上清,换含2%胎牛血清的细胞维持液,37 ℃、5%CO2培养,每天观察致细胞病变(cytopathiceffect,CPE),当CPE≥75%时收获冻存,如果没有病变,反复冻融3次,再盲传两代,收集细胞。

1.2 核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)的提取,按照德国QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(74104)按试剂盒说明书提取麻疹病毒RNA。
1.3 引物

研究所用麻疹病毒N基因片段扩增引物根据文献[ 1]设计,序列如下:MN-R,5'-GCCATGGGAGTAGGAGTGGAAC-3'(1113~1134);MN-F,5 '-CTGGCGGCTGTGTGGAC C T G - 3 '(1737~1754)。扩增片段大小为660 bp。

1.4 系列扩增和分析逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase-Chain Reaction,RT-PCR)采用日本TaKaRa one-step RNA PCR kit(AMV)试剂。取5 μL麻疹病毒的RNA提取物作为模板,反应条件如下:50 ℃ 30 min逆转录,94 ℃ 4 min变性后,PCR循环如下:94 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,循环35周,72 ℃延伸10 min。扩增后产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。核苷酸序列测定及分析扩增后产物送上海英骏公司进行序列测定。测序结果的序列处理分析使用了DNAMAN软件,其余参比的代表株序列均来自基因(GenBank)。
2 结果
2.1 病毒分离结果

102份含漱液标本有31份发生细胞融合病变,经过荧光PCR方法检测证实为麻疹病毒,麻疹病毒分离成功率为30.4%,其中2004年3株、2005年5株、2007年3株、2008年10株、2012年2株、2013年8株。

2.2 RT-PCR结果

所有31株病毒经RT-PCR均扩增出N基因碳末端的660 bp的特异性条带。

2.3 N基因末端450个核苷酸系列分析和同源性比较

31株麻疹病毒N基因碳末端450 bp核苷酸序列与GenBank中麻疹病毒各基因型参考株比较发现:2004-2013年宁波分离的31株麻疹病毒基因型均为H1型,其中6株为H1b基因亚型,包括2004年的1株 (NB2004-03)和2005年的所有毒株,其余的25株均为H1a亚型。31株麻疹病毒与H1a亚型参考株china93-4的同源性为97.1%~100%;与H1b亚型参考株china94-7的同源性为96.7%~100%;与中国疫苗株S191的同源性为81.9%~92.4%。与GenBank中录入的江浙沪地区分离株核苷酸同源性较高,与上海分离株同源性为97.8%~99.6%;与江苏省分离株同源性为98.0%~99.3%;与浙江省周边县市区分离株同源性为98.0%~99.3%。

2.4 分离株与疫苗株氨基酸系列比对

31株N基因末端450 个核苷酸翻译的氨基酸与中国疫苗株S191的同源性为87.2%~90.6%,在14个位点31株分离株的氨基酸系列完全相同,但与疫苗株S191不同,具体差异见表1:

表1 宁波麻疹病毒分离株与疫苗株S191N基因羧基末端450个核苷酸翻译的氨基酸系列比对分析 Tab.1 Deduced amino acid sequences of the 450 C-terminus nucleotide sequences of the N gene between strains isolated from Ningbo and S191
3 讨论

自从1963年麻疹减毒活疫苗的广泛使用,麻疹的发病率和死亡率急剧下降,但在疫苗可以预防疾病中依然是引起儿童死亡的第1位原因,在2008年,麻疹病毒世界范围引起164 000名儿童死亡[ 2, 3]。麻疹病毒的基因型别具有地理分布特征,不同地区有不同的本土流行株或优势流行株。监测麻疹病毒的基因特征对分析病毒的起源、基因变异和传播途径,辨别疫苗株和野毒株以及制定巩固消除麻疹成果具有重要意义。

宁波市2004-2013年共分离到31株麻疹病毒,主要集中在2004年、2005年、2007年、2008年、2012年和2013年这6年,这一现象正好与这几年宁波的流行高峰相关。仅2004年和2005年流行株为H1b亚型,其余25株均为H1a亚型,H1a亚型毒株与2009-2011年间江浙沪地区分离的野毒株在系统进化树的分支上比较接近,其核苷酸同源性比较高,与国内相关文献对麻疹毒株基因流行的优势毒株研究的也报道一致[ 4, 5, 6]。31株毒株中,每一年的优势株形成一个小的分支,核苷酸之间的差异为零或者很小。不同年份也有基因系列完全相同的毒株在流行,表明存在同一毒株的持续循环现象;还有同一年份分离的毒株处在不同分支,表明病毒在自然选择及免疫压力下存在一定变异,导致出现较多分支,呈现不同的病毒传播链[ 7]。

徐闻青与严菊英等报道麻疹免疫者产生的中和抗体水平低于自然感染者,疫苗产生的抗体中和野病毒株的能力低于中和疫苗株,这些均说明现用的MV 对当今麻疹病毒流行株的保护作用已下降,但这种保护作用的下降可能仅处于量变过程,并已影响到MV 的免疫持久性[ 8, 9, 10]。宁波31株分离株与中国疫苗株S191的核苷酸在基因水平上存在较大差异,同源性较低,为91.1%~92.4%,翻译的氨基酸的差异性高达9.4%~12.8%,据文献报道,N蛋白上有3个抗原决定簇NP1、NP2、NP3,分别位于122~150、457~476、519~525位氨基酸[ 12]。宁波31株分离株与疫苗株14个不同的氨基酸系列位点,10个位点位于抗原决定簇或附近,这些氨基酸位点的变异均可能导致一定程度的抗原性改变,也从分子水平间接证明现行MV的血清学保护性降低的量变结果,基因和蛋白水平的变化为现用疫苗的持续监测和新疫苗的开发提供了有力的参照。

随着麻疹野毒株N基因的变异,由麻疹疫苗诱导的免疫是否能保护野病毒株的攻击,以及保护年限的多少将是一个重要的研究课题。因此,我们以后要从分子生物学和免疫学上加大对宁波流行的麻疹野毒株的监测,为宁波更好的消灭麻疹和巩固成效提高理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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