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韦小瑜, 田克诚, 游旅, 唐光鹏, 王定明. 贵州省首例空肠弯曲菌菌血症病例病原鉴定和亚种分型. 2014, 30(8): 875-876[WEI Xiao-yu, TIAN Ke-cheng, YOU Lv, TANG Guang-peng, WANG Ding-ming. Campylobacterjejuni isolated from a patient with bacteremia in Guizhou Province, China . 中国人兽共患病学报, 2014, 30(8): 875-876]  
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贵州省首例空肠弯曲菌菌血症病例病原鉴定和亚种分型
韦小瑜, 田克诚, 游旅, 唐光鹏, 王定明
贵州省疾病预防控制中心,贵阳 550004
基金:
摘要
目的

对贵州省1例菌血症患儿血液中分离的疑似空肠弯曲菌进行鉴定。

方法

运用传统细菌学方法和分子生物学方法,对从菌血症患者血液分离的可疑空肠弯曲菌进行鉴定和亚种分型。

结果

来自菌血症患儿血液的可疑菌株,经传统生化鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种,特异性多重PCR方法鉴定为弯曲菌属空肠弯曲菌,NAP-mPCR方法鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种。

结论

分离自贵州省菌血症患儿血液的菌株确认为空肠弯曲菌空肠亚种,NAP-mPCR方法可将空肠弯曲菌鉴定到亚种水平。

关键词: 空肠弯曲菌; 菌血症; PCR
中图分类号:R378 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2014)08-0875-03
Campylobacterjejuni isolated from a patient with bacteremia in Guizhou Province, China
WEI Xiao-yu, TIAN Ke-cheng, YOU Lv, TANG Guang-peng, WANG Ding-ming
Research Institute of Infectious Disease Control and Prevention, Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550004, China
Fund:Supported by grants from the National Key Program for Infectious Disease of China (No.2012ZX10004-212); the Science Foundation of Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention (No.2013-E2-2);
Abstract

To identify the isolated suspicious strain ofCampylobacterjejuni from the blood of bacteremia patient in Guizhou Province, China, conventional and molecular techniques (specific mPCR and NAP-mPCR) were used to identify suspicious bacteria strains. Results showed thatCampylobacterjejuni suspicious colonies were cultured in bacteremia patient blood samples. The strain was identified asCampylobacterjejuni ssp.jejuni by conventional tests and was identified asCampylobacterjejuni by genus specific mPCR. Then the strain was classified asCampylobacterjejuni ssp.jejuni by subspecies NAP-mPCR. The strain was identified asCampylobacterjejuni ssp.jejuni isolated from the blood of bacteremia patient andCampylobacterjejuni can be identified subspecies by NAP-mPCR.

Keyword: Campylobacter jejuni; bacteremia; PCR
引言

弯曲菌是重要的食源性人兽共患病原菌,可引起人类急性肠炎,并可并发格林巴利综合征、菌血症、活动性关节炎等多种疾病[ 1]。本文从1例新生儿剥脱性皮炎患者的血液中分离出疑似空肠弯曲菌,并进行形态学、系统生化和分子生物学鉴定。

1 材料与方法
1.1 病例

患者为出生11 d的女婴,家住贵州省仁怀市九仓镇,家中生产。患儿出生8 d时出现口周皮肤潮红,渐发展为全身皮肤潮红,面部、四肢、腹部皮肤部分剥脱等症状体征,遂入住遵义医学院附属医院新生儿科,诊断为“新生儿剥脱性皮炎,颅内感染?鹅口疮”。其住院期间最高体温40.6 ℃(肛温),伴四肢抽搐,反应差。实验室检查:WBC13.87×109/L,中性淋巴细胞比例56%,淋巴细胞比例31%,单核细胞比例12%;肝功能ALT54U/L,AST68U/L,总胆红素92.1 umol/L,直接胆红素20 umol/L,肌酸激酶359 U/L,乳酸脱氢酶572 U/L。该医院采用血培养法从患者血液中分离到病原菌,经细菌鉴定仪鉴定为“弗朗西斯菌”,并将菌株送至本室鉴定。

1.2 主要试剂和仪器

哥仑比亚血琼脂基础购自英国OXOID公司,脱纤维羊血购自北京友康基业公司,细菌基因组提取试剂盒购自大连宝生物公司。微需氧培养箱为CB150(Binder,德国);PCR仪为德国80W-Tprofessional Gradient 96;凝胶成像仪为Gel Doc2000型(Bio-Rad,美国);全自动微生物鉴定仪为VITEK2.0(法国,梅里埃)。引物合成由大连宝生物公司完成。

1.3 试验菌和参考菌株

试验菌株分离自“新生儿剥脱性皮炎”患者血液的“弗朗西斯菌“疑似菌株,编号:GZ201201,参考菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供(CJ参考株)。

1.4 传统细菌学方法鉴定空肠弯曲菌

按照WS271-2007标准进行,试验内容包括菌落培养条件、观察菌落生长时间、形态、菌落染色、氧化酶和触酶试验等。

1.5 系统生化鉴定空肠弯曲菌

采用梅里埃VITEK2.0全自动微生物鉴定仪,将试验菌和空肠弯曲菌参考菌株制成菌悬液后,上NH卡进行微生物系统生化鉴定。

1.6 DNA提取

将试验菌和参考菌株接种至哥仑比亚血平板培养48 h后,使用细菌基因组提取试剂盒按照说明书操作步骤提取细菌DNA。

1.7 多重PCR方法鉴定空肠弯曲菌

按照文献[ 2]提供的16sRNA、 mapA引物序列和参数对试验菌和参考菌株核酸进行扩增,以参考菌株核酸作为阳性对照,超纯水作为阴性对照。

1.8 NAP-mPCR方法鉴定空肠弯曲菌亚种

采用文献[ 3]所述NAP-mPCR引物序列和参数对试验菌和参考菌株进行空肠弯曲菌亚种的鉴定,引物序列见表1:

表1 NAP-mPCR用引物 Tab.1 Primers used in NAP-mPCR
2 结果
2.1 试验菌形态、染色及常规生化鉴定结果

试验菌转种至哥仑比亚选择性血平板,37 ℃普通培养箱培养48 h后未见菌落生长,42 ℃微需氧培养箱(85%N2,10%CO2,5% O2)培养48 h后,可见大小约0.5~1 mm、圆形、边缘整齐、无色透明、水滴状、表面光滑湿润、不溶血的菌落;挑选典型菌落进行革兰染色镜检,菌体形态为革兰染色阴性、呈S形或海鸥展翅状、无芽孢的细长弯曲菌;试验菌触酶、氧化酶和马脲酸盐水解试验均为阳性。符合空肠弯曲菌的生长条件、菌落形态和基础生化特征。

2.2 系统生化鉴定结果

将试验菌和空肠弯曲菌参考菌株进行全自动微生物系统生化鉴定,结果显示两种菌均为空肠弯曲菌空肠亚种,鉴定度为99%,见表2:

表2 疑似空肠弯曲菌菌株的系统生化鉴定结果 Tab.2 Identification on suspicious strain of Campylobacter jejuni by VITEK biochemical methods
2.3 多重PCR方法鉴定结果

采用特异性种属多重PCR方法对试验菌株和参考菌株核酸进行扩增,结果显示两种菌均获得857 bp(16sRNA)及589 bp( mapA)两条特异性扩增片断,而阴性对照无条带扩增。

2.4 NAP-mPCR方法鉴定结果

采用NAP-mPCR方法对试验菌和参考菌株核酸进行检测,结果显示两种菌均获得1 454 bp和1 016 bp的两条特异性条带,而阴性对照无条带出现(图1)。

3 讨论

空肠弯曲菌是引起世界食源性疾病的常见病原菌,常引起肠道感染,每1 000个肠道感染的病例就有1.5个会发展为菌血症或败血症,而且0.1%的弯曲菌感染病例,尤其空肠弯曲感染会发展为格林巴利综合征[ 4]。空肠弯曲菌分为两个亚种:空肠亚种和德莱亚种。本试验研究证实从贵州省1例菌血症患儿的血液中分离到空肠弯曲菌,经传统细菌学方法、特异性种属mPCR方法和NAP-mPCR方法鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种。

图1 血培养空肠弯曲菌分离株NAP-mPCR结果Fig.1 NAP-mPCR results of the Campylobacter jejuni strain from blood cultureM: Marker; 1: GZ201201; 2: Reference strain;3: Negative control.

本实验通过观察菌落生长条件和菌落形态、菌落染色、氧化酶、触酶试验及系统生化鉴定将试验菌鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种,提示传统的表型分型仍然可作为空肠弯曲菌分型的手段,但传统的表型分型实验过程需要的菌量较大,耗时较长,且会出现错误的判断结果[ 3]。而PCR方法仅需单个菌落提取核酸进行反应,实验时间短,特异性强,优于传统表型分型方法。本研究中采用基于16sRNA、 mapA两个基因的多重PCR技术将菌血症患者血培养分离菌株鉴定为空肠弯曲菌,该方法亦曾在贵州省腹泻病例空肠弯曲菌的鉴定中得到应用[ 5]。

空肠弯曲菌亚种的表型鉴定主要通过硝酸盐还原试验来判断,但该方法耗时长需1~2 d,所需菌量大,而且会出现错误结果,Miller[ 3]以硝酸盐还原酶(nitrate reductase,nap)位点为基础设计的多重PCR(NAP-mPCR)检测方法,对分离自临床病例、动物和环境的158株空肠弯曲菌空肠亚种和20株空肠弯曲菌德莱亚种研究结果显示,该方法可对空肠弯曲菌空肠亚种(1 454 bp,1 016 bp)和德莱亚种(973 bp或494 bp)进行100%的分型鉴定。本实验中GZ201201和CJ参考株经NAP-mPCR方法检测鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种,与系统生化检测结果完全一致。

最初,本菌株被医院实验室鉴定为“弗朗西斯菌”,与最终鉴定结果不符。因空肠弯曲菌培养条件苛刻,其在不同的培养条件下生长速度、形态大小及菌落革兰染色形态均有不同,在不利于其生长的条件下生长速度缓慢,菌落小,革兰染色出现菌体球形变化,仅少许呈弯曲状,因此导致进行系统生化鉴定时可能会出现选卡错误而识别为其他菌。

弯曲菌是引起儿童肠炎的常见病原菌,其菌血症的发生常发生于免疫缺陷的儿童[ 6]。本例空肠弯曲菌空肠亚种菌血症患者为新生儿,免疫力低下,大片皮肤剥脱,皮肤屏障破坏,全身皮肤感染重,致使病原菌侵入血液引起菌血症。贵州省1988年和2010年均在腹泻病例的病原监测中检出空肠弯曲菌[ 7, 8]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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