引用本文
张继军, 张芳, 李璐, 刘增加. 甘肃麦积山区媒介及宿主动物中莱姆病螺旋体检测及基因型别研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2015,31(4): 357-360
ZHANG Ji-jun, ZHANG Fang, LI Lu, LIU Zeng-jia. Borrelia burgdorferi infection and their genotypes in ticks and rodents collected from Maijishan region, Gansu Province, China [J]. CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES, 2015,31(4): 357-360  
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中国人兽共患病学报
甘肃麦积山区媒介及宿主动物中莱姆病螺旋体检测及基因型别研究
张继军, 张芳, 李璐, 刘增加
兰州军区疾病预防控制中心, 兰州 730020
刘增加,Email:lzj540125@126.com
摘要

目的 了解甘肃麦积山景区蜱及野鼠体内莱姆病螺旋体感染及其基因分型情况。方法 采用布旗法采集蜱标本,采用夹夜法捕捉野鼠。经种类鉴定后,提取病原体DNA,应用巢式PCR扩增鼠中莱姆病螺旋体5S-23S rRNA间隔区片段,对阳性产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果 共检测4个蜱种1 273只蜱标本,其中若蜱1 126只,成蜱147只,若蜱分组进行处理和检测,共分为67组,其中13组检测到莱姆病螺旋体DNA片段;成蜱15只检测阳性。检测4个鼠种42只野鼠,其中10只检测阳性,不同鼠种阳性率存在差别( χ2=16.93, P=0.00),4个鼠种中以大林姬鼠的阳性率为最高,达到33.33%。基因分型分析结果显示蜱及野鼠标本中莱姆病螺旋体为 B. garinii 及 B. afzelii基因型,其中 B. garinii基因型占78.95%。结论 麦积山景区存在莱姆病螺旋体,并至少有 B. garinii 及 B. afzelii两种基因型。

关键词: 莱姆病螺旋体; 基因型; 限制性片段长度多态性; 蜱; 野鼠
中图分类号:R377 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2015)04-0357-04
Borrelia burgdorferi infection and their genotypes in ticks and rodents collected from Maijishan region, Gansu Province, China
ZHANG Ji-jun, ZHANG Fang, LI Lu, LIU Zeng-jia
Center for Disease Control and Prevention of Lanzhou Command, Lanzhou 730020, China
Corresponding author: Liu Zeng-jia, Email:lzj540125@126.com
Fund:Supported by the Eleventh Five-Year Plan for Medical Science Development of PLA (No.08Z003), the Special Funds for Military Medical Research of Lanzhou Military Command(No.LZ13GY11),Supporting Program for Sci Tech Research of Gansu Province(No.1011FKCA154)
Abstract

We investigated Borrelia burgdorferi infection in ticks and rodents captured in Maijishan region and identified their genotypes in this study. Ticks were collected by dragging a cloth over the vegetation, rodents were collected by snaps. After species identification, DNA of pathogen was isolated from samples and detected by nested PCR targeting 5S-23S rRNA intergenic spacer of Borrelia burgdorferi. Positive samples were further analysed by restriction fragment length polymorphism (RFLP). Results showed that a total of 1 273 ticks including 1 126 nymphal ticks and 147 adult ticks in 4 species; 42 rodents including 4 species were tested for evidence of Borrelia burgdorferi by nested PCR; 15 adult tick samples, 9 rodents samples and 13 groups of nymphal ticks showed positive. The positive rates were different among the different rodent species, with Apodemus agrarius having the highest positive rates. RFLP analysis indicated that Borrelia burgdorferi in samples belonged to the genotype either B. garinii or B. afzelii. It's suggested that Borrelia burgdorferi exists in Maijishan region and there were at least two genotypes.

Keyword: Borrelia burgdorferi; genotype; restriction of fragment length polymorphism (RFLP); tick; rodents

莱姆病(Lyme disease)是一种新发现的蜱传自然疫源性疾病, 其病原体为伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi), 主要通过蜱媒在动物间传播。人被携带病原体的蜱叮咬而感染, 可引起皮肤、神经、心脏和关节等多器官、多系统的损害, 严重者造成终生残疾, 甚至死亡[1]。我国自1986 年首次报道发现莱姆病以来, 血清流行病学调查表明至少在27 个省(市、自治区)的人群存在伯氏疏螺旋体感染, 病原学证实其中18 个省(市、自治区)存在莱姆病自然疫源地, 9种蜱携带伯氏疏螺旋体, 牛、羊、狗、野兔和8 种野鼠有自然感染[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]。莱姆病在我国不仅严重危害着人们的健康, 而且对农、林业经济的发展、国防建设和旅游资源的开发都带来不利的影响。甘肃西部及南部(甘南)地区广泛存在伯氏疏螺旋体感染的人群及疫源地[9], 为了解天水市郊麦积山旅游区是否存在莱姆病, 我们于2013年5月至2014年8月对麦积山景区作了莱姆病调查研究。

1 材料和方法
1.1 标本的采集

调查点为甘肃省天水市郊麦积山地区, 采样时间为 2013年5月。

1.2 标本的采集

蜱标本采用布旗法, 分类鉴定后保存待用。鼠标本采用夹夜法, 即傍晚时分放鼠夹第2 d清晨收回的方法, 诱捕不同生境下的野鼠。所获标本经鼠种鉴定后现场无菌解剖, 取组织置-20 ℃保存待用。

1.3 细菌DNA的提取

1.3.1 鼠标本中病原体DNA的提取 经鼠种鉴定后, 无菌操作剪取约3 mm3(约500 mg)大小的脾组织, 置灭菌研磨器中加入Trizol, 充分研磨后移入Eppendorf管中; 通过离心分离去除RNA后, 通过2次洗涤(0.1 mol/L柠檬酸钠10%乙醇溶液)后获得DNA沉淀, 然后将其悬于75%酒精中静置10~20 min。2~8 ℃, 2 000× g离心5 min, 然后将DNA沉淀溶于8 mmol/L NaOH溶液中, 4 ℃过夜。最后将提取好的DNA溶于TE(0.01 mol/L, pH 8.0)中, 紫外分光光度计测量DNA浓度及纯度后置-20 ℃备用。

1.3.2 蜱标本中病原体DNA的提取 经蜱种鉴定后, 用75%酒精浸泡20 min后, 用无菌滤纸吸干, 再用生理盐水, 漂洗3次, 用无菌滤纸吸干蜱体表水份后, 置EP管中, 加入DNA提取缓冲液(10 mmol/L Tris, pH 8.0, 2 mmol/L EDTA, 0.1% SDS, 500 μ g of proteinase K/mL) 200 μ L, 用灭菌的枪头进行充分研磨, 后56 ℃孵育2 h, 置沸水中煮10 min 后置-20 ℃保存备用。

1.4 莱姆病螺旋体的检测

采用巢式PCR法, PCR反应总体积为20 μ L, 包括10 × PCR缓冲液2 μ L, 引物浓度均为12.5 μ mol/L, 体积0.4 μ L, dN TP为10 mmol/L, 体积为0.4 μ L, Taq DNA聚合酶0.4 μ L(2.5 U/μ L), 第1轮扩增用2 μ L模板, 第1轮产物1 μ L作为第2轮的模板, 用无菌双蒸水补足20 μ L。第1、2轮扩增的退火温度分别为55 ℃和59 ℃。取PCR产物5 μ L, 用1.5 %的琼脂糖胶电泳, 溴化乙锭染色, 于紫外灯下观察结果。为避免污染引起假阳性反应, 标本制备、反应液制备、扩增实验和产物的电泳及观察均在不同的房间进行; 加样与体系配制移液器分开专用; 同时每次实验都设立空白(水)对照。

1.5 RFLP分析

取阳性标本的PCR产物5 μ L, 用限制性内切酶Mse I (10 000 U/ mL ; New England Biolabs) 于37 ℃酶切9 h, 酶切反应总体积为20 μ L, 其中限制性内切酶MseI 0. 5 μ L, 2 μ L 的10 × NEB缓冲液, 用无菌双蒸水补足20 μ L。酶切后65 ℃灭活20 min, 酶切产物用5 %琼脂糖凝胶进行电泳分离片段。

2 结 果
2.1 蜱中莱姆病螺旋体感染情况

共采集森林革蜱、草原革蜱、达吉斯坦革蜱及青海血蜱4个蜱种1 273只蜱标本, 其中若蜱1 126只, 成蜱147只。将若蜱按不同种类每20只左右为1组进行处理和检测, 共分为67组, 有13组检测到莱姆病螺旋体DNA片段。147只成蜱共包括4个蜱种:森林革蜱、草原革蜱、达吉斯坦硬蜱及青海血蜱, 其中15只检测阳性, 成蜱总阳性率为10.20%, 成蜱中不同蜱种阳性率未见明显差别。

2.2 鼠标本中莱姆病螺旋体感染情况

共捕获大林姬鼠、黑线姬鼠、小林姬鼠及灰仓鼠4个鼠种42只野鼠, 其中10只检测阳性, 总阳性率为23.80%, 不同鼠种阳性率存在差别(χ 2=16.93, P=0.00), 4个鼠种中以大林姬鼠的阳性率为最高, 达到33.33%, 具体见表1。

表1 不同鼠种中莱姆病螺旋体检测结果 Tab.1 Testing results from different rodent species
2.3 阳性标本中莱姆病螺旋体基因型

对15只PCR检测阳性的成蜱标本及10份野鼠标本的5S-23S rRNA 基因间隔区片段进行基因分型, 15份蜱标本中9份标本成功分型, 所有阳性鼠标本均得到预期结果。阳性标本经Mse I 酶切后共产生3种酶切带型:107, 95, 51、107, 57, 51, 38及107, 68, 51, 20, 其中前两种带型属于B. garinii基因型, 后者属于B. afzelii基因型。19份标本中15份属于B. garinii基因型, 占78.95%, 其中:鼠标本9份, 蜱标本6份; 4份为B. afzelii基因型:蜱标本3份, 鼠标本1份。不同基因型在不同标本中的分布见表2。

表2 阳性标本中莱姆病螺旋体基因型分布情况 Tab.2 Distribution of Borrelia burgdorferi genotypes from positive samples
3 讨 论

莱姆病是一种人兽共患病, 主要通过其传播媒介的吸血活动在动物及人间传播, 现已查到全沟硬蜱、嗜群血蜱、长角血蜱、二棘血蜱、台湾角血蜱、微小牛蜱、粒形硬蜱、森林革蜱等9种蜱携带莱姆病螺旋体。现已证实在我国北方林区全沟硬蜱是主要生物媒介, 南方林区的粒形硬蜱和二棘血蜱是重要的传播媒介。有关西北地区莱姆病螺旋体的主要传播媒介目前尚未定论, 虽然已有相关研究从森林革蜱、草原革蜱体内检测到病原体DNA, 但传播动力学实验不支持其媒介作用, 因此无法准确确定其在疾病传播过程中的地位, 目前尚不清楚西北地区莱姆病螺旋体的主要媒介蜱种。本研究从天水市区麦积山景区进行选点采样, 捕获了大量的不同发育阶段的蜱标本, 不仅从4种成蜱(森林革蜱、草原革蜱、青海血蜱及达吉斯坦硬蜱)体内检测到病原体DNA, 亦从若蜱组(森林革蜱、草原革蜱及青海血蜱)中检测到目的片段, 值得注意的是本研究中, 对青海血蜱是首次从成蜱及若蜱体内同时检测到目的片段, 这在一定程度上可能能说明了该蜱种在甘肃省境内, 至少是在调查点内具有充当传播媒介的潜能, 在今后的工作中我们将对其进行进一步实验验证。

莱姆病螺旋体的储存宿主比较多, 北美东部主要是白足鼠, 其次是花粟鼠、松鼠、地鼠和鹿鼠, 其它啮齿动物也可做为主要贮存宿主, 如稻田鼠、棉鼠、棉小鼠、棉尾兔等。我国已从黑线姬鼠、大林姬鼠、小林姬鼠、花鼠、普通田鼠、白腹鼠、白腹巨鼠、社鼠、黄毛鼠、褐家鼠和华南兔等啮齿动物中分离到莱姆病螺旋体, 从自然种群数量和感染率分析, 我国北方莱姆病主要贮存宿主可能是姬鼠类。本研究捕获的野鼠主要为姬鼠类, 占78.57%, 经检测3种姬鼠(大林姬鼠、黑线姬鼠、小林姬鼠)均携带有病原体DNA, 事实上前期我们在甘肃境内(迭部地区)开展的相关工作亦有类似结果, 本研究中大林姬鼠的阳性率为最高, 达到33.33%, 在一定程度上显示出了大林姬鼠作为贮存宿主的作用, 后期我们将对其重点开展病原体分离工作, 以验证其作为贮存宿主的作用。

不同地域的伯氏疏螺旋体菌株具有遗传多态性和抗原异质性, 目前伯氏疏螺旋体至少分为10个普遍公认的基因型, 其中4个为致病基因型。在我国至少存在4个基因型的伯氏疏螺旋体, 包括3个致病基因型Borrelia burgolorferi sensu stricto (B.b.s.s.), B. garinii (B.g.), B. afzelii (B.a.)和一个非致病基因型B. valaisiana (B.v.)。不同基因型的病原体与地理分布, 传播媒介分布、宿主、临床表现甚至是诊断方法的建立和疫苗研制都密切相关。因此对伯氏疏螺旋体基因型的甄别鉴定对流行病学、临床诊断和治疗以及疫苗研制等多个方面具有重要的指导意义。伯氏疏螺旋体的 5S-23S rRNA 基因间隔区是高变区, 积累了较多的型间变异, 这一片段的PCR/RFLP 分析快速简便, 已广泛用于伯氏疏螺旋体的基因分型。基于该方法, 本研究样本中莱姆病螺旋体有两种基因型, B. garinii(B.g.), 及B. afzelii (B.a.), 这两种基因型是重要的致病基因型, 由此我们可以推断当地居民或游客有受感染的机会, 由于该调查点为重要的旅游景区, 且当地气候温润, 一年四季该地游人如织, 该病应引起当地卫生部门的重视, 相关的人群血清学及流行病学应开展。两种基因型中, B. garinii基因型虽然在数量上占多数, 但不能说B. garinii基因型就是当地的主要基因型, 因为研究中部分标本分型并不成功, 另外本研究中标本数量有限, 而且目前我们尚未从该地分离获得莱姆病螺旋体菌株, 因此也无法建立起基因型与蜱种、野鼠种类间的联系。

The authors have declared that no competing interests exist.

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