福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法的建立及应用
罗霞, 王建平, 孙强正
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京 102206
孙强正,Email:sunqiangzheng@icdc.cn
摘要

目的 建立福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法。方法 根据福氏志贺菌4av和Yv血清型O抗结构,针对O抗合成基因 wzx、IV型抗原决定基因 gtrIV和MASF IV-1抗原决定基因 opt,建立血清型4av和Yv 的PCR鉴定方法。并应用该方法对126株福氏志贺菌临床分离株进行血清型检测。结果 建立了一种福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法,在一个反应中包括4对引物,Yv血清型PCR扩增为 wzx opt阳性;4av血清型PCR扩增为 wzx opt gtrIV阳性。该方法可将4av和Yv血清型与目前已知的其他福氏志贺菌血清型完全区分。对126株不同血清型福氏志贺菌临床分离株的鉴定结果显示,该方法具有很好的特异性。结论 本研究建立的福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法,可以用于志贺菌检测和监测。

关键词: 福氏志贺菌; Yv血清型; 4av血清型; O抗修饰基因; PCR方法
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2015)06-0501-05
Development of PCR method for molecular serotyping of 4av and Yv of Shigella flexneri targeting on O-antigen modification genes
LUO Xia, WANG Jian-ping, SUN Qiang-zheng
State Key Laboratory for Infection Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: Sun Qiang-zheng, Email:sunqiangzheng@icdc.cn
Abstract

We developed a PCR assay for molecular serotyping of Shigella flexneri serotype 4av and Yv . Based on O-antigen structure of serotype 4av and Yv, primer pairs targeting on O-antigen synthesis gene wzx, the serotype 4-specific IV specific gene gtrIV and MASF IV-1 specific gene opt were designed and included in one PCR assay to develop a molecular method for serotyping serotype 4av and Yv. Total of 126 S. flexneri clinical isolates were typed by this method and was compared with slide agglutination method. Results showed that a multiplex PCR assay was developed, containing four primer pairs in one single reaction could identify serotype Yv the target genes wzx and opt were positive and while 4av target genes, wzx, opt and gtrIV were all positive, being different from the others serotypes of S. flexneri. The PCR assay provides a rapid and specific method for S.flexneri serotype 4av and Yv identification, and could be well used in Shigella detection and surveillance.

Keyword: Shgella flexneri; serotype Yv; serotype 4av; O-antigen modification genes; PCR assay

福氏志贺菌是发展中国家细菌性痢疾的主要致病菌。在中国, 福氏志贺菌导致的病例数占细菌性痢疾的80%以上(http://www.chinacdc.cn/tjsj)。根据O抗结构的差异, 福氏志贺菌分为不同的血清型[1]。近年来, 新的或不能分型血清型不断报道[2, 3]。最近, 一种新的福氏志贺菌O抗修饰方式, PEtN修饰被报道, 它是由一个6.8 kb质粒携带的磷酸乙醇胺转移酶编码基因(O-antigen phosphoethanolamine transferase, opt)介导在O抗四糖骨架的第三(RhaIII)或/和第二鼠李糖(RhaII)的 3和4位碳原子进行磷酸乙醇胺修饰(phosphoethanolamine, PEtN), 导致MASF IV-1抗原表位的出现[4, 5, 6, 7, 8]。这一新的PEtN修饰存在于新发现和命名的血清型Xv、4av和Yv中[4, 5, 6, 7, 8]。鉴定Xv血清型的PCR方法已经建立, 在一个反应中应用3对针对特异性基因(optwzxgtrX)的引物, 可以将Xv血清型与目前已知的其他福氏志贺菌血清型完全区分, 结果稳定特异[9]。因4av和Yv血清型均可以与日本生研IV型单价抗血清发生凝集[5, 6, 7, 8], 过去常被误判定为4a血清型。区别和鉴定4av和Yv的血清型需要单克隆抗体MASF IV-2和MASF IV-1[3, 4, 5, 6, 7, 8]。单克隆抗体MASF价格昂贵, 不易获得; 在特殊情况下(PEtN修饰主要在RhaII), 单克隆抗体MASF IV-1与菌株的凝集弱, 为血清型的判定带来困难。因此建立一种快速、特异的4av和Yv血清型鉴定方法, 对于福氏志贺菌的检测、监测具有重要意义。

在本研究中, 我们根据4av和Yv血清型的O抗修饰特征, 针对4av和Yv血清型O抗修饰特异基因gtr IVopt、福氏志贺菌O抗合成基因wzx基因序列, 设计引物, 建立4av和Yv血清型PCR鉴定方法。

1 材料和方法
1.1 材料

1.1.1 菌株 研究中所用福氏4av血清型菌株G1668和Yv血清型菌株HN002作为标准株, 用于PCR鉴定方法的建立。17株其他血清型福氏志贺菌菌株见表1。50株腹泻病相关菌株用于特异性检测:其中宋内2株(I相和II相各一株), 志贺12株(1-12种血清型各一株), 鲍氏18株(1-18种血清型各一株), 肠聚集性大肠杆菌2株, 肠出血性大肠杆菌3株, 肠侵袭性大肠杆菌1株, 肠致病性大肠杆菌1株, 肠产毒性大肠杆菌1株, 尿路致病性大肠杆菌1株, 大肠杆菌K12 2株, 单增李斯特菌1株, 霍乱弧菌1株, 副伤寒杆菌3株, 猪霍乱沙门氏菌1株, 小肠结肠炎耶尔森菌1株。126株福氏志贺菌临床分离株用于检测, 包括1a(4株)、1b(5株)、1c(1株)、1d(8株)、2a(28株)、2b(2株)、3a(4株)、3b(1株)、4a(4株)、4b(4株)、4av(2株)、5a(4株)、5b(1株)、7b(2株)、Xv(18株)、X(18株)、Yv(12株)、Y(6株)、6(2株)(表3)。实验中所用菌株均为本实验室保存。

表1 多重PCR方法与血清凝集方法所鉴定实验菌株的血清型特征 Tab.1 Serological features of S.flexneri reference strains identified by slide agglutination and multiplex PCR methods

1.1.2 主要试剂 多重PCR试剂盒(Qiagen multiplex PCR kit)及PCR产物胶回收试剂盒均为德国Qiagen公司产品。检测用引物由上海生物工程公司合成。福氏志贺菌单价抗血清为日本生研(Denka Seiken)公司产品, 福氏志贺菌单克隆抗体为瑞典Reagensia AB公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养、血清型鉴定及PCR模板制备 志贺菌常规在LB琼脂平板上、37 ℃条件下培养。挑取单菌落进行群抗原和型抗原的血清学鉴定。采用水煮法制备菌株DNA模板用于PCR扩增。

1.2.2 引物设计 gtrIVwzx的扩增引物参考已经发表文章[10], opt扩增引物根据已经公布的基因序列(KC020049)[7], 采用primer 5.0软件设计引物(表2)。为区分Xv血清型, 增加gtrX扩增引物[10]。选择退火温度接近的引物作为备选引物, 以方便PCR扩增同时进行。

表2 实验中所用的引物 Tab.2 Primers used in this study
表3 126株福氏志贺菌临床分离株血清型的多重PCR检测 Tab.3 126 S.flexneri strains tested by multiplex PCR assay

1.2.3 PCR扩增 多重PCR扩增按照试剂盒说明进行。多重PCR反应体系如下:4个基因每条引物终浓度为0.2 μ mol/L、1× PCR Master Mix(多重PCR反应试剂盒提供)、DNA模板3 μ L(1 mmol), 补充蒸馏水至50 μ L。PCR条件为:94 ℃预变性15 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s, 共30 个循环; 最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 PCR扩增产物纯化、测序及序列比对 PCR扩增产物经切胶回收纯化后, 送上海生物工程公司测序。所测序列与目的基因序列进行比对, 以确定扩增产物的正确性。

1.2.5 临床分离福氏志贺菌菌株血清型的PCR检测选取福氏志贺菌不同血清型临床分离菌株共126株, 按照1.2.3方法进行PCR扩增, 根据PCR扩增结果判断菌株血清型, 并与血清凝集鉴定结果进行比较。

2 结 果
2.1 福氏志贺菌血清型PCR扩增结果

根据gtrIVoptwzx基因序列设计引物, 以19种福氏志贺菌血清型菌株DNA为模板, 进行单重PCR扩增。结果发现opt基因PCR扩增阳性的为Xv血清型菌株2002017, 4av血清型菌株G1668和Yv血清型菌株HN002; gtrIV基因PCR扩增阳性的有4a血清型菌株8521, 4b血清型菌株51577和4av血清型菌株G1668。测序结果证实扩增产物与已经发表的基因序列一致。除血清6型菌株51579外, 其他18种血清型菌株wzx基因PCR扩增均为阳性。多重PCR扩增发现, 在50 μ L体系中, 每条引物(gtrIVoptwzx)终浓度为0.2 μ mol/L、1× PCR Master Mix、DNA模板为1 mmol, 退火温度为55 ℃时, 扩增效果最好。即4av血清型(G1668)在378 bp、890 bp和782 bp位置有相应扩增条带(图1); 而Yv血清型(HN002)和Xv血清型(2002017)在890 bp和782 bp位置分别有相应扩增条带。由于Xv和Yv血清型PCR扩增均为wzxopt基因阳性, 不能区分。为了将Xv和Yv血清型区分, 我们在体系中加入针对Xv血清型特异基因gtrX的引物。这样Xv血清型optwzxgtrX基因扩增全部阳性, 而Yv血清型只有wzxopt基因阳性, 从而将二者区分(图1)。采用上述4个特异性基因(gtrIVgtrXoptwzx)引物的多重PCR扩增体系, 对福氏志贺菌其他17种血清型(1a、1b、1c、1d、2a、2b、3a、3b, 4a、4b、5a、5b、6、7b、X、Xv和Y)进行多重PCR扩增。结果发现除血清6型外, wzx基因在其他福氏志贺菌血清型扩增均为阳性; 而wzxgtrX基因在1d、2b、3a、5b和X血清型扩增阳性; wzxgtrIV基因在4a和4b血清型扩增阳性; optwzxgtrX基因只在血清型Xv扩增阳性; 6血清型菌株具有独特的O抗合成基因, 不含上述O抗修饰基因, 因此4个基因扩增均为阴性(图1)。这17种血清型的扩增谱与4av和Yv血清型结果均不相同, 从而可以用此方法将4av和Yv血清型与其他血清型区别开来。

2.2 50株腹泻病相关病原菌菌株PCR扩增结果

为检测引物特异性, 采用上述体系对50株其他腹泻病相关病原菌菌株进行多重PCR扩增。结果显示, 在相同的扩增体系和扩增条件下, 50株腹泻病相关病原菌菌株的多重PCR扩增结果均为阴性, 证明引物具有较高特异性。

2.3 126株不同血清型福氏志贺菌临床分离株PCR及血清凝集鉴定结果

对126株福氏志贺菌不同血清型临床分离株(表3)进行多重PCR检测, 结果发现2株4av血清型福氏志贺菌的optwzxgtrIV基因PCR扩增均为阳性, 与4av血清型菌株G1668一致; 血清凝集结果也与多重PCR扩增结果完全一致(表3); 12株Yv血清型菌株的optwzx基因PCR扩增为阳性, 而gtrIV基因PCR扩增为阴性, 与Yv血清型菌株HN002一致。4av与Yv血清型菌株的PCR扩增结果不同, 且4av和Yv血清型与112株其他血清型福氏志贺菌PCR扩增结果均不同(表3)。

图1 福氏志贺菌19个血清型O抗修饰基因多重PCR扩增产物Fig.1 Multiplex PCR products of S. flexneri reference strains of 19 serotypes

3 讨 论

除血清型转换型噬菌体介导的福氏志贺菌O抗四糖骨架糖基化和O-乙酰化修饰外, 由质粒携带的opt基因介导的O抗磷酸乙醇胺修饰是新发现的一种福氏志贺菌O抗修饰方式, 这种修饰在Xv、4av和Yv血清型菌株中被发现[4, 5, 6, 7, 8]。进化和结合试验提示Xv、4av和Yv血清型分别可以从X、4a和Y血清型通过获得6.8 kb质粒转化而来, 在RhaIII或/和RhaII 3/4位发生磷酸乙醇胺修饰, 导致MASF IV-1抗原表位的出现[5, 6, 7, 8], 因此Xv、4av和Yv这3种血清型均能与单克隆抗体MASF IV-1发生凝集。4av和Yv血清型均可以与日本生研IV型单价抗血清发生凝集, 在血清学凝集结果判断中容易被误判为血清4型福氏志贺菌[5, 6, 7, 8]; 因此鉴定4av和Yv血清型需要单克隆抗体MASF IV-1和MASF IV-2 [3, 4, 5, 6, 7, 8]

商业化单克隆抗体MASF IV-1和MASF IV-2价格昂贵, 基层疾控部门不易获得, 限制了其应用; 而且血清凝集反应需要分离培养单菌落, 反应结果还受到细菌培养条件和生长状态的影响。因此, 根据福氏志贺菌4av和Yv血清型O抗修饰及其产生机制, 寻找血清型抗原表位特异的分子标识, 发展并建立一种快速、特异的血清型分子生物学鉴定方法, 对于福氏志贺菌4av和Yv血清型的鉴定具有重要意义。我们已经建立了Xv血清型的PCR鉴定方法, 可以在一个多重PCR体系内将Xv血清型与其他18种福氏志贺菌血清型完全区分[9]

本研究建立了针对4av和Yv血清型福氏志贺菌O抗修饰基因wzxoptgtrIV的多重PCR鉴定方法。福氏志贺菌O抗合成基因wzx在除6型外的1~5型、7、X及Y型中存在[11], 可以作为内对照; opt基因决定了MASF IV-1抗原表位的修饰, 这种修饰作用存在于Xv、4av和Yv血清型中[5, 6, 7, 8], 因此opt基因在这3种血清型扩增为阳性; gtrIV基因的糖基化修饰决定了IV型抗原的出现, 这一修饰发生在4a、4av和4b血清型中[12], 因此这3种血清型中gtrIV基因扩增为阳性。从多重PCR扩增结果可以看到, optwzxgtrIV基因扩增全部阳性的只有4av血清型菌株, 而optwzx基因扩增阳性的包括Xv血清型及Yv血清型菌株。为了区分Xv和Yv血清型, 我们又加入了一对针对Xv血清型O抗修饰特异基因gtrX[13]的引物, 在Xv血清型PCR扩增中得到了425 bp的gtrX基因目的条带, 从而成功将二者区分。本研究建立了在一个PCR反应体系内, 用4对引物, 可将4av和Yv血清型与其他17种福氏志贺菌血清型完全区分的分子鉴定方法, 对之前我们建立的多重PCR鉴定福氏志贺菌血清的分子分型方法[10]是一个有益的补充, 完善了福氏志贺菌血清型分子鉴定方法。

本研究建立的福氏志贺菌4av和Yv血清型多重PCR鉴定方法具有良好特异性, 对50株腹泻病相关病原菌菌株(均为非福氏志贺菌属)进行PCR扩增, 结果均为阴性。本研究进一步对126株不同血清型福氏志贺菌临床分离株进行多重PCR检测, 发现12株Yv血清型菌株的PCR扩增结果与Yv血清型菌株HN002一致, 即optwzx基因扩增均为阳性; 2株4av血清型菌株的PCR扩增结果与4av血清型菌株G1668一致, 即optwzxgtrIV基因扩增均为阳性, 与其他福氏志贺菌血清型PCR扩增结果均不同, 可以将4av和Yv血清型与其他福氏志贺菌血清型完全区分。

本研究建立了一种针对4av和Yv血清型福氏志贺菌O抗原鉴定的多重PCR方法, 结果稳定特异。与传统的血清凝集方法相比较, 该多重PCR方法具有判定结果客观、成本低廉、无需昂贵的抗血清也可以实施等优点, 是一种可以在基层实验室开展的高通量检测方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

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