马尔尼菲青霉酸性磷酸酶在宿主氧化杀伤中的作用
黄晓, 张军民, 蒋丽, 王丽, 鲁莎, 蔡文莹
中山大学孙逸仙纪念医院皮肤科,广州 510120
张军民,Email:junminmx@163.com
摘要

目的 探讨马尔尼菲青霉( Penicillium marneffei, PM)酸性磷酸酶( Acid phosphatase, ACP)在宿主氧化杀伤中的作用。方法 在培养基中加入不同浓度H2O2模拟氧化应激环境,于25 ℃和37 ℃震荡培养后检测上清液中 ACP的活性。通过用特定培养基诱导酶分泌、灭活、抑制剂处理的方法获得不同酶活性的 PM分生孢子,建立分生孢子与巨噬细胞共培养模型;利用H2DCFDA标记联合流式细胞术检测巨噬细胞ROS的释放量,CFU及透射电镜观察巨噬细胞对 PM的杀伤情况。结果 PM菌丝相及酵母相均能分泌 ACP,加入H2O2后两相 ACP活性均提高;诱导 PM分泌酸性磷酸酶,巨噬细胞ROS释放量及对菌体杀伤能力被抑制;将酶抑制后,巨噬细胞ROS释放量增加,对菌体杀伤能力增强。结论 PM在氧化应激条件下能通过分泌 ACP抑制巨噬细胞ROS产生,从而抵御宿主的氧化杀伤作用。

关键词: 酸性磷酸酶; 马尔尼菲青霉; 巨噬细胞; 氧化杀伤; ROS
中图分类号:R379 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2015)09-0817-05
Role of acid phosphatase of Penicillium marneffei in the host oxidative damage
HUANG Xiao, ZHANG Jun-min, JIANG Li, WANG Li, LU Sha, CAI Wen-ying
Department of Dermatology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, China
Corresponding author: Zhang Jun-min, Email: junminmx@163.com
Abstract

We investigated the role of acid phosphatase of Penicillium marneffei in the host oxidative damage. Penicillium marneffei were inoculated in liquid medium containing H2O2 at 37 ℃ or 25 ℃. Cell-free supernatants were tested for acid phosphatase activity and enzymatic properties. After pretreated with acid phosphatase inhibitor, Penicillium marneffei conidia were cultivated with macrophages. The levels of ROS generated by macrophages were determined by flow cytometry with the H2DCFA fluorescent prob. The activities of living Penicillium marneffei in the cells were observed by electron microscopy. CFU was used to evaluate the influence of acid phosphatase on the sterilization ability of macrophages. Results showed that both mycelial and yeast phases of Penicillium marneffei expressed acid phosphatase activity. Enzyme activity was improved after exposed to H2O2. After acid phosphatase was inhibited, the amount of ROS was increased comparing with the control group. The capacity of macrophages for phagocytizing and sterilizing conidia was enhanced. It’s suggested that acid phosphatase can prevent Penicillium marneffei from oxidative damage by inhibiting the levels of ROS.

Keywords: Penicillium marneffei; acid phosphatase; macrophage; oxidative damage; ROS

马尔尼菲青霉病是由马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei, PM)感染引起的深部真菌病, 主要累及网状内皮-巨噬细胞系统[1], 常引起全身广泛播散, 病死率高。马尔尼菲青霉是一种温度依赖性双相真菌, 25 ℃条件下呈菌丝相生长, 可产生大量分生孢子; 37 ℃时呈酵母相, 感染人及动物时以酵母形态存在于宿主体内。PM分生孢子可经呼吸道进入宿主体内随即被支气管、肺部的巨噬细胞所吞噬, 以酵母相在巨噬细胞内分裂增殖。巨噬细胞吞噬病原体后可通过呼吸爆发产生大量氧活性簇(ROS)对菌体进行氧化杀伤, 作为一种细胞内病原菌, PM如何抵御巨噬细胞的氧化杀伤作用在细胞内存活目前尚未明确。

酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)是一类广泛存在于微生物及动植物的水解酶, 被认为是许多病原菌的重要毒力因子[2, 3, 4, 5], 主要通过抑制宿主ROS产生发挥其毒力作用。既往有文献报道PM可分泌ACP[6], 然而ACPPM致病性方面的研究尚未见报道。本实验通过研究PM在氧化应激条件下ACP的分泌情况及其酶学性质, 抑制ACP活性后对巨噬细胞ROS产生及杀伤能力的影响, 初步探讨酸性磷酸酶在马尔尼菲青霉抵御巨噬细胞氧化杀伤中的作用, 以明确马尔尼菲青霉在巨噬细胞氧化应激条件下存活的机制。

1 材料和方法
1.1 材料

1.1.1 主要试剂

DMEM培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司, 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)购自日本和光纯药工业株式会社, Acid Phosphatase检测试剂盒、Acid Phosphatase 抑制剂(正钒酸钠、酒石酸钠、钼酸钠、氟化钠、β -甘油磷酸钠)均购自Sigma公司, DCFH-DA荧光测定试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司。酸性磷酸酶诱导培养基配制试剂购自广州威佳生物公司(葡糖糖; NaNO3; MgSO4.7H2O; KCl; FeSO4.7H2O; 柠檬酸; 柠檬酸钠)。

1.1.2 菌株来源

马尔尼菲青霉SUMS0152 株(已经形态学及DNA测序鉴定) , 由中山大学孙逸仙纪念医院医学真菌研究中心提供, 分离自一名血液病患儿的血液标本。细胞系:BALB/c小鼠来源的巨噬细胞株RAW264.7购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉, 湖北)。

1.2 方法

1.2.1 PM培养上清及分生孢子制备

PM分别接种于含有2mmol/L H2O2的酸性磷酸酶诱导液体培养基中(配制方法参照文献[7]), 对照管加入等量生理盐水代替H2O2, 25 ℃及37 ℃ , 150 r/ min 振荡培养96 h, 从各培养管中取2 mL菌悬液离心过滤得到上清液, -20 ℃保存备用。PM接种于马铃薯斜面培养(PDA), 25 ℃室温下培养7~9 d, PBS反复冲洗培养基表面, 离心去色素, 生理盐水重悬, 镜下观察为单细胞性分生孢子, 计数4 ℃保存备用。

1.2.2 巨噬细胞培养

无菌操作复苏RAW264.7细胞株, 用含10%小牛血清的DMEM培养基培养2~3 d, EDTA-胰酶消化传代2~3次后转至六孔板, 调整细胞密度为1× 106/mL, 每孔1 mL。根据实验要求分组。

1.2.3 ACP活性检测

以 p-NPP为底物, 将菌悬液50 μ L加入96孔板中再加入等量ACP底物, 混匀, 37 ℃孵育1 h后用0.5N NaOH溶液终止反应, 将反应板放入酶标仪于405波长处测各孔吸光值。根据说明书公式计算其对应的ACP活性(单位为Units/mL)。

1.2.4 PAS染色观察巨噬细胞对PM的吞噬 巨噬细胞与PM共培养1 h制备细胞爬片, 滴加PAS固定液5 min, 水洗待干, 滴加PASI液10 min, 水洗待干, 滴加PASII液室温避光孵育30 min, 流水冲洗数分钟, 苏木素复染1~2 min, 水洗待干, 光学显微镜下观察分生孢子被吞噬情况。

1.2.5 H2DCFDA标记检测巨噬细胞的ROS水平

分为3组, 第1组:未加入分生孢子; 第2组:加入未处理的分生孢子; 第3组:加入预处理的分生孢子。PM分生孢子与RAW264.7细胞共培养2 h(菌与细胞比例5∶ 1), 弃培养液, PBS洗3次, 每孔加入H2DCFDA 工作液(终浓度为5 μ mol/L), 37 ℃, 5%CO2 培养箱中避光孵育30 min, PBS洗2次, 上机检测荧光强度。

1.2.6 CFU检测

ACP对RAW264.7细胞杀伤P.marneffei分生孢子的影响 分组:①空白对照组; ②酶抑制组; 酶抑制组:将分生孢子置于含1 mmol/L正钒酸钠的生理盐水中37 ℃孵育4 h, 空白对照组:未加入抑制剂在同等条件下孵育。PM分生孢子与RAW264.7细胞共培养2 h(菌与细胞比例5∶ 1), PBS洗去未被吞噬的PM, 每孔以4 ℃预冷的无菌双蒸水1 mL裂解细胞, 倍比稀释至1 000倍, 取100 μ L涂SDA平皿培养基, 37℃温箱培养2~3 d, 菌落计数。每孔涂3个复培养皿, 重复实验3次

1.3 数据分析

所有数据采用SPSS13.0软件进行统计处理, 数据描述以平均值± 标准差表示, 组间比较采用t检验分析, P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 H2O2对酶活性的影响

PM菌丝相与酵母相均可以分泌ACP, 在H2O2培养基中菌丝相与酵母相ACP活性均明显提高, 差异有统计学意义。说明氧化压力可以促进PM分泌ACP(表1)。

表1 H202PM酸性磷酸酶活性的影响( x¯± s) Tab.1 Effects of H2O2on the acid phosphatase activity of PM( x¯± s)
2.2 共培养体系的建立

将巨噬细胞RAW264.7与PM共培养1 h后, 用PAS染色在光学显微镜下观察巨噬细胞的吞噬情况。在巨噬细胞的胞浆内可看到被PAS染成桃红色的PM分生孢子。说明成功建立了共培养体系(图1)。

图1 PM与RAW264.7共培养, 箭头指示被吞噬的PM分生孢子(光镜, 1 000× )Fig.1 PM conidia are phagocyticed by RAW264.7 after co-culture (original magnification× 1 000), Bar=50 μ m

2.3 流式细胞术检测巨噬细胞内ROS水平

流式细胞术检测巨噬细胞内ROS水平, 结果显示LPS、LPS+酶抑制分生孢子、 LPS+灭活分生孢子、LPS+酶诱导分生孢子组平均荧光强度分别为:167.5± 20.43; 434.0± 14.72; 509.0± 22.30; 41.14± 12.36各组间差异有统计学意义(P< 0.01)。LPS可以刺激巨噬细胞呼吸爆发释放ROS(图2B), 加入经酸性磷酸酶诱导后的分生孢子ROS降低(图2E), 而将酶诱导的分生孢子用抑制剂处理或灭活后ROS升高(分别为图2C、D), 说明酸性磷酸酶可以抑制巨噬细胞ROS产生(图2A为不加荧光的对照组), (图2)。

2.4 CFU检测PM被巨噬细胞杀伤情况

不同酶活性PM与巨噬细胞共培养两小时, CFU检测分生孢子被杀伤情况。结果显示, 酶诱导分生孢子、酶抑制分生孢子组CFU分别为:1.68× 104± 0.15与0.61× 104± 0.15, 两者有统计学差异(P< 0.001)。诱导酸性磷酸酶分泌可以使PM存活率提高, 而该酶被抑制后PM存活率降低, 说明酸性磷酸酶可以抵御巨噬细胞的杀伤作用(图3)。

2.5 电镜下观察PM被巨噬细胞杀伤情况

不同酶活性PM与巨噬细胞共培养2 h, 可见巨噬细胞表面有细长的突起将PM分生孢子捕获及包绕。数量不等的分生孢子被内吞入细胞, 存在于膜包裹的吞噬体内或游离于胞浆。共培养后酶诱导分生孢子形态结构未见明显改变, 可见到完整的细胞壁, 胞内可见脂肪滴(图4-1); 而酸性磷酸酶被抑制的分生孢子可见形态改变, 细胞壁与细胞膜分离、细胞皱缩, 细胞壁与细胞内结构模糊, 呈降解状态(图4-2)。提示酶抑制分生孢子抵御巨噬细胞杀伤能力较酶诱导分生孢子弱, 进一步说明酸性磷酸酶可以抵御巨噬细胞的杀伤作用。

图2 RAW264.7细胞与不同酶活性的PM共培养2 h后, 细胞内ROS的释放量A:对照组; B:LPS; C:LPS+酶抑制分生孢子; D:LPS+灭活分生孢子; E:LPS+酶诱导分生孢子Fig.2 RAW 264.7 was co-cultured with PM conidia of different enzyme activity for 2 h Intracellular ROS generation was assayed by flow cytometry with the H2DCFA fluorescent prob.A: control group; B: LPS; C: LPS+Enzyme inhibited conidia; D: LPS+Enzyme inactivated conidia; E: LPS+Enzyme activated conidia.

图3 RAW264.7细胞与不同酶活性的PM共培养2h后, PM的存活率Fig.3 RAW 264.7 was co-cultured with PM conidia of different enzyme activity for 2 h

图4 A:PM酶诱导分生孢子在巨噬细胞内生存情况 B:PM酶抑制分生孢子在巨噬细胞内生存情况Fig. 4 A:Survival of enzyme activated PM conidia in macrophage were observed by TEM B:Survival of enzyme inhibited PM conidia

3 讨 论

马尔尼菲青霉 (Penicillium marneffei, PM)是青霉属中唯一的温度依赖性双相真菌, 属于机会致病菌。近几年随着肿瘤化疗、器官移植、艾滋病的流行免疫缺陷患者日益增多, 马尔尼菲青霉病发病率逐渐增加。该菌在室温25℃培养时呈菌丝相, 产生分生孢子; 37 ℃培养或感染人体后呈酵母相, 为致病相。PM分生孢子经呼吸道进入宿主体内后被巨噬细胞吞噬, 当宿主免疫系统缺陷时PM不能被完全清除, 可在巨噬细胞内以酵母细胞分裂增殖, 并致全身播散。作为一种细胞内病原体, PM在巨噬细胞内存活并繁殖是其感染宿主的首要条件, 被认为是其致病的关键[8, 9]。既往研究表明, PM在宿主巨噬细胞内能够通过调控异柠檬酸裂解酶(acuD)、铜锌超氧化物歧化酶(sodA)、过氧化氢酶-过氧化物酶(cpeA)、热休克蛋白70(hsp70)等的表达而抵御吞噬细胞的抗真菌活性, 以利于其在宿主细胞内生存[9, 10, 11, 12]

活性氧簇(Reactive oxidative species, ROS)[13]为巨噬细胞内释放的一种炎症介质, 包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子( O2-)、羟自由基(· OH)等。巨噬细胞表面[14, 15]Toll-like受体等活化而引起的炎症反应均可产生ROS, 产生的ROS又进一步促进了炎症反应, ROS是各种炎症反应的强大效应器。在炎症级联反应中ROS可杀灭吞噬细胞内的病原微生物。PM作为一种巨噬细胞内病原菌, 如何抵御巨噬细胞活性氧簇(ROS)的氧化杀伤目前尚未明确[9]

酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)[16]是一类广泛存在于微生物及动植物的水解酶, 被认为是许多病原菌重要的毒力因子[2, 3, 5, 7]。如结核分枝杆菌可分泌一种结构、性质与真菌相似的酸性磷酸酶[4], 该酶可通过降低胞内pH值而减弱免疫细胞的氧化应激, 敲除ACP调控基因结核分枝杆菌毒力下降[5, 17]。弗朗西斯氏菌属[2]、贝氏柯克斯体[3]等分泌的ACP可通过抑制ROS抵御宿主的氧化杀伤。Youngchim等[6]采用定性的方法发现PM也能分泌酸性磷酸酶, 但其与PM致病性的关系尚未见文献报道。

本研究在培养基中加入H2O2模拟体内氧化应激环境, 通过定量的方法检测培养上清液中ACP的活性, 结果显示H2O2能提高ACP的活性, 提示氧化应激条件下可以刺激PM分泌ACP。将PMACP抑制剂预处理后与巨噬细胞共培养两小时后检测巨噬细胞内ROS的水平及其对PM的吞噬杀伤作用, 研究结果发现ACP未被抑制时巨噬细胞内ROS水平较低, 对菌体吞噬杀伤作用较弱; 而ACP被抑制后, 巨噬细胞ROS水平上升, 对PM吞噬杀伤能力增强, 提示巨噬细胞可以通过产生ROS杀伤菌体, 而PM在巨噬细胞内可以通过分泌ACP抑制ROS的产生抵御巨噬细胞的杀伤作用。我们推测巨噬细胞吞噬PM后通过呼吸爆发产生大量活性氧族(ROS)等杀伤菌体, PM在宿主氧化应激环境下可分泌ACP等物质抑制ROS从而抵抗宿主的氧化杀伤; 当宿主免疫力正常时, 巨噬细胞的氧化系统和PM的抗氧化系统处于平衡状态, 病原体被杀死; 相反, 当人免疫缺陷时, PM抗杀伤机制占优势则可引起马尔尼菲青霉病。

我们的研究结果显示, 马尔尼菲青霉在氧化应激条件下可分泌酸性磷酸酶, 抑制该酶后巨噬细胞内ROS水平升高, 对PM的吞噬作用增强, 提示ACP可能通过抑制巨噬细胞活性氧族(ROS)产生抵御宿主的氧化杀伤从而参与PM的致病过程, 具体的机制有待进一步研究阐明。

The authors have declared that no competing interests exist.

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