目的 分析2007—2013年南京市H3N2亚型流感HA基因分子学特征。方法 选择2007—2013年59株H3N2亚型流感分离株,自行设计HA片段引物扩增分离毒株HA片段并测序, 利用DNAStar、MEGA等软件对HA分子学特征进行分析;结果 发病时间存在明显的季节性;进化树分析2007—2013年分离株按年代分成3个分支;分离株较疫苗株及不同年份之间,发生多个抗原位点及受体结合位点氨基酸的替换;2007—2013年,我市H3N2亚型流感流行情况出现两次波动,可能同基因的突变、重组有关。结论 抗原位点及受体结合位点氨基酸的突变,对流感的防控及疫苗的保护效果产生极大的挑战。
We conducted analysis on the molecular characteristics of haemagglutinin of influenza A (H3N2) from 2007 to 2013 in Nanjing. Influenza A virus were isolated and cultured in MDCK cells, and then PCR amplifications and sequencing of the HA genes were carried out. Data were analyzed by DNAStar, MEGA software. Results showed that the incidence of crowd were under 15 years old. The onset time showed obviously seasonal. The phylogenetic tree of isolates strains from 2007 to 2013 could be divided into three branches; there are some antigen sites and receptor binding sites of amino acid substitutions between isolate strains and vaccine strains; the difference also occurred between isolate strains in different years. There are two waves appear of influenza A (H3N2) virus infection during 2007 to 2013 in Nanjing city, maybe result from genetic mutation and recombination. In conclusions, the amino acid mutations of antigen sites and receptor binding sites could make great challenges for influenza prevention and control and the protection effect of vaccine.
流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病, 包括A、B、C 3种型别。甲型流感病毒常引起大范围流感流行, 其中H3N2亚型自1968年引起流感大流行以来一直是人群中流行的主要亚型之一。流感病毒以其表面抗原频繁变异, 每年引起新的流行。H3N2亚型流感病毒的血凝素基因(HA)编码的血凝素是产生中和抗体的重要抗原, 并在病毒的受体识别和复制中起重要作用。研究表明中和抗体所针对的抗原位点和受体结合位点(RBS)都位于HA蛋白分子的头部重链区(HA1区)。HA1区序列的变异和流感的流行有密切关系, 在流感的抗原性研究和疫苗选择中有重要意义, 研究其分子特征变异在流感的预防控制工作中十分重要。
哨点医院收集流感样病例(ILI)咽拭子, 4 ℃运送至实验室, 提取病毒RNA后, 荧光定量PCR方法进行流感病毒型别鉴定。核酸检测阳性标本, 经MDCK 细胞培养扩增后, 吸取上清液置于-80 ℃保存。应用Mag MAXTM-96 Viral Isolation Kit提取59株H3N2型流感病毒的RNA, SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase Kit将RNA逆转录为互补DNA(cDNA)。自行设计的HA引物PCR扩增HA基因片段, 然后应用QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit Protocol对PCR产物进行纯化, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit荧光标记, AB公司3500测序仪进行测序。
登陆“ 中国疾病预防控制信息系统” , 导出南京市2007年1月1日— 2013年12月31日流感监测数据, 应用SPSS软件进行数据的统计分析。利用生物信息学软件(DNAStar、Bioedit和MEGA)对所测的H3N2流感HA序列进行比对、拼接、构建进化树, 分析比较分离株HA蛋白特征性氨基酸位点的变化情况; 通过BEAST v1.8.0 软件进行BSP(Bayesian skyline plot)模型构建。
2007— 2013年南京市流感网络实验室共监测流感样病例标本14162份, 监测阳性标本665份, 平均检测阳性率4.7%, 其中季节性H3N2亚型356份, 季节性H1N1亚型86份, H1N1(09pdm)亚型30份, B(Yamagata)型45份, B(Victoria)型148份。发病年龄以15岁以下年龄组居多, 占到了42.1%, 60岁以上组最少, 占7.2%; 发病人群中男、女分别占53.5%、46.5%; 每年流感有2个发病高峰, 第1个高峰是冬春季, 第2个高峰是夏季。详见图1。
HA进化树显示:59株H3N2分离株及2007-2013年WHO推荐疫苗株按年份分成了3个分支, 2007— 2008年分离毒株位于Group 3, 2007年分离毒株同疫苗株A/Wisconsin/672005 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为:97.8%~99.0%和97.0%~98.1%; 2008年分离株同疫苗株A/Brisbane/10/2007 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.7%~99.3%和98.7%~99.1%; 2009— 2010年分离毒株位于Group 2, 2009年分离株疫苗株A/Brisbane/10/2007 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为: 98.3%~98.9%和97.4%~98.3%, 2010年分离毒株同疫苗株A/Peth/16/2009 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为:99.1%~99.3%和99.1%; 2011-2013年分离株位于Group 1, 2011分离株同疫苗株A/Peth/16/2009HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为:98.3%和97.8%; 2012— 2013年分离株同疫苗株A/Victoria/361/2011 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.5%~99.3%和97.6%~98.7%, 见图2。
A/Nanjing/F116/2007等5株2007年分离株同疫苗株A/Wisconsin/67/2005相比, 发生G50E、D122N、S138A、K140I、Q156H、V186G、I223V, A/Nanjing/F31/2007、A/Nanjing/F35/2007同疫苗株相比发生了D122N、S138A、R142G、N144D、Q156H、K173N、 V186G、I223V; 2008年分离株同疫苗株A/Brisbane/10/2007相比发生K173Q、R269K; 2009年毒株同疫苗株A/Brisbane/10/2007相比发生E62K、N144K、K156N、N189K、V213A; 2010年毒株同疫苗株A/Peth/16/2009相比P162S、S214I、I260M、R261Q; A/Nanjing/1481/2011同疫苗株A/Peth/16/2009相比发生33、45、48等11个位点的氨基酸变化; 2012— 2013年分离株同疫苗株A/Victoria/361/2011相比发生33、145、156、186、190、219、270等位点氨基酸的变化; 2011— 2013年毒株同2007— 2010年相比, 发生33、45、48、198、212、278、312等位点氨基酸的变化。具体氨基酸位点的变化, 详见表1。
本研究通过对2007— 2013年南京市流感样病例监测结果分析发现, 我市流感流行具有明显的季节性, 每年有两个流行高峰, 冬春季及夏季, 这同我国北方只存在冬春季一个流行高峰有一定的差异, 同南方省份流感的流行高峰一致[3, 4]; 众所周知冬天由于气候等原因, 容易导致流感的流行; 夏季可能是人们广泛使用空调, 室内外温差较大, 容易引起流感的发生。发病年龄主要分布在15岁以下年龄段, 同李伟等的研究结果一致[5], 符合流感发病的人群分布[6]。
已有的研究表明, 流感病毒HA基因的抗原变异和分子遗传进化最为活跃, 且抗原变异主要发生在HA1区域[7, 8], 该区域包括抗原位点、受体结合位点、潜在糖基化位点, 因此该区域的氨基酸若发生变化, 可能会对病毒的抗原特性、受体结合特性产生影响。H3N2亚型流感HA1蛋白的329个氨基酸位点, 131个位于5个抗原决定簇(A、B、C、D、E)内或者附近[9]。本次研究结果发现, 分离株与相对应的疫苗株相比, 均发生多个抗原位点的变化, 其中2011年同疫苗株相比发生10个位点的氨基酸的变化, 9个是抗原位点; 不同年份之间同样存在抗原位点的氨基酸变化, 从进化树不同年份分离株的分支情况也能说明这一点。H3N2亚型流感病毒的受体结合位点由6个残基(98Y、153W、190E、194L、183H、155T)组成口袋的表面, 134-138残基和224-228残基构成了口袋的右壁和左壁。甲型流感病毒血凝素蛋白与唾液酸细胞受体的结合在病毒感染过程中起到至关重要的作用[10], 且血凝素蛋白的受体结合特性是流感病毒宿主限制性的重要的决定因素[11, 12]。血凝素蛋白结合的特异性与其受体结合位点上的一些氨基酸性质密切相关, 若这些氨基酸发生改变, 将会直接影响流感病毒的受体结合特性, 从而逃避宿主攻击[13]。本次研究结果发现两个受体结合位点的氨基酸变化。以上抗原位点及受体结合位点的氨基酸变化一方面呈现出流感病毒的进化速度之快, 另一方面这些位点的变化定会影响病毒的抗原性及受体结合特性, 对病毒疫苗的保护效果及流感的防控提出了严峻的挑战。
BSP结果显示, 自2007— 2013年, 我市H3N2亚型流感流行情况出现两次波动, 可能同基因的突变, 重组有关。2009年出现一个下降趋势, 可能与当年H1N1(09pdm)亚型流感爆发流行有关, 此时H1N1(09pdm)成为优势毒株。2011年下半年又出现一个上升的趋势。整体呈现2~3年一个波动周期, 符合不同亚型流感交叉成为优势毒株的规律。原因可能是前一年某亚型流感流行之后, 人们体内普遍存在该亚型的抗体, 再加上疫苗的接种, 从而制约了该亚型流感的继续流行。但随着时间的推移, 人们体内的抗体减少, 流感病毒基因不断的进化, 又会引起新的一轮流行或爆发。
The authors have declared that no competing interests exist.
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