硫氧还蛋白及其在寄生虫的研究进展
杨晓宇1, 王萌1, 张德林1,2
1.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室 甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州 730046
2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州 225009
张德林,Email: zhangdl2005@163.com
摘要

硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一类广泛存在于原核与真核生物体内的氧化还原调节蛋白,与硫氧还蛋白还原酶,NADPH等共同组成硫氧还蛋白系统,参与调节机体抗氧化、抗凋亡等生物学过程。由于Trx系统可以清除寄生虫虫体自身和宿主免疫细胞产生的的活性氧和活性氮,以减少其对虫体的损伤,因此寄生虫Trx的研究日益受到人们的关注。现对Trx的主要生物学功能及在寄生虫上的最新研究进展作一综述。

关键词: 硫氧还蛋白; 生物学功能; 寄生虫
中图分类号:R38 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2015)09-0870-06
Research progress on thioredoxin and parasitic thioredoxin
YANG Xiao-yu1, WANG Meng1, ZHANG De-lin1,2
1.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Key Laboratory of Veterinary Public Health of the Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province,Lanzhou Veterinary Institute, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Lanzhou 730046, China
2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease, Yangzhou 225009, China
Corresponding author: Zhang De-lin, Email: zhangdl2005@163.com
Abstract

Thioredoxin (Trx) is a ubiquitous protein regulator of redox reaction in all livings. It operates together with thioredoxin reductase and NADPH as a general protein disulfide catalytic system, playing an important role in several biological processes, such as anti-oxidation and anti-apoptosis. As parasitic Trx system scavenges reactive oxygen species and reactive nitrogen species produced by parasite itself and host immune cells, study on parasitic Trx has been gradually concerned. In this paper, we summarized the newest research progresses on the biological function of thioredoxin as well as parasitic thioredoxin.

Keywords: thioredoxin; biological function; parasite

硫氧还蛋白系统是一个NADPH依赖性二硫化物还原酶系统, 能够控制细胞氧化还原状态和细胞增殖生存, 在体内广泛分布[1]。主要包括硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx), 硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, TrxR), NADPH和硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase, TrxP)。其中, 硫氧还蛋白(Trx)是一类小分子多功能蛋白质, 广泛存在于原核、真核生物中。它们在进化上相当保守[2], 一般都具有一个相同的二硫化物活性位点序列Cys-Gly-Pro-Cys, 由于这一结构特点, 还原型Trx可与二硫键作用, 还原被氧化的蛋白, 自身变为氧化型Trx, 然后在TrxR及NADPH作用下, 再转变为还原型Trx, 继续发挥氧化还原作用[3]。1964年, Trx作为大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)核糖核酸还原酶的电子供体首次被发现[4]。1967年, 有人在大鼠的肿瘤组织中首次发现哺乳动物Trx, 之后一些细胞因子样分子也被确认为人Trx[5, 6], 其中包括妊娠早期因子、成人T细胞白血病衍生因子(adult T cell leukemia-derived factor, ADF)和类白介素-1细胞素等。

Trx广泛存在于原核和包括人类在内的真核生物体内。不同类型的Trx在不同生物以及细胞内的不同区域分布不同。根据一级结构的不同, Trx主要分为Trx1和Trx2两个家族[7], Trx1位于胞浆和胞核, 含有一个独特的Trx区域, 绝大多数生物的Trx属于Trx1家族; Trx2位于线粒体, 含有一个或多个Trx区域, 1991年首次发现于猪的心脏组织, 被认为是Trx家族的一种线粒体特异性蛋白。近年来研究发现, Trx还与机体内核酸代谢、细胞分化增殖及肿瘤发生等过程相关。因此, Trx及其系统的功能日益受到人们的重视。

1 Trx结构

目前, 人们已经对多个物种的Trx基因及其表达产物进行了较为详尽的研究。大多数物种的Trx氨基酸序列长度在105~110个氨基酸之间, 与E. coli的Trx的序列相似性为27%~69%。E.coli的Trx由5个β 折叠和4个α 螺旋组成, 5个β 折叠构成一个疏水核心, 终末端被4个α 螺旋包围形成球形结构(如图1)。保守的活性位点序列Cys-Gly-Pro-Cys连接第2个β 折叠和第2个α 螺旋, 是第2个α 螺旋的第1个转折点, 这种折叠模式叫做Trx折叠[8]。还原型Trx与蛋白底物X-S2结合后, Cys-32的巯基与X-S2结合形成含有共价键的二硫化物, 然后去质子的Cys-35作用于此二硫键, 释放出被还原的蛋白底物X。Trx高级结构的变化可调节其功能活性, 例如无氧化还原活性的Trx的变异体不能与ASK-l结合, 失去了抑凋亡的作用[9]

图1 大肠杆菌Trx结构图注:红色表示α 螺旋; 黄色表示β 折叠; 蓝色表示活性位点Cys-Gly-Pro-CysFig.1 3D model of E. coil Trx Red represents the α -helix; Yellow for β -folded; Blue represents the active site Cys-Gly-Pro-Cys.

E. coli不同, 人类和其他哺乳动物的Trx1除了催化位点上的2个半胱氨酸残基外, 其活性位点外侧还有3个半胱氨酸残基(Cys-62, Cys-69和Cys-73)[10, 11], 这些结构型残基构型的改变会影响Trx的生物学活性。Trx2特异地存在于线粒体内, 在其N-末端有一个60个氨基酸组成的线粒体定位信号肽和一个保守的Trx催化位点Cys-Gly-Pro-Cys[12, 13], 其中两个半胱氨酸残基在人类Trx2氨基酸序列中分别位于第90、93位。

2 Trx的主要生物学功能
2.1 抗氧化作用

生物体内的氧会形成一些含富余电子的活性氧类(ROS), 如超氧负离子自由基( O2-)、过氧化氢(H2O2)等。ROS与细胞内氧化还原环境调控和细胞信号传导有关, 但浓度过高时, 对机体有很强的破坏作用。

研究表明, Trx抗氧化的主要机制有3个, 首先, Trx可以在机体各个氧化还原系统间起到互相耦合和平衡的轴心作用, 补充和配合其他氧还系统的功能发挥。除了Trx系统外, 谷胱甘肽(GSH)系统、Prx过氧化物酶(peroxiredoxin)等氧化还原系统在协同作用下, 使细胞内的氧还平衡维持在一个相对稳定的水平[14], 且Trx系统还能够帮助GSSG还原成为GSH, 维持机体内部的GSH浓度[15]。其次, Trx是消除细胞内ROS的重要分子。还原型Trx可在TrxP的作用下可直接将ROS清除, 如将O-转化为OH-, 从而降低过量的ROS造成的细胞损伤。研究表明, Trx2在犬大脑中高表达, 可显著减轻缺血造成的中枢神经系统损伤, 反之, 抑制Trx2基因表达的动物个体会因体内ROS过量而死亡[16]。Drechsel 等人对大鼠脑组织线粒体中H2O2进行实时定量测定, 发现当TrxR功能被抑制时, H2O2的消除效率大大降低, 说明Trx-TrxR体系对胞内ROS的消除起到了重要的作用[17]。另外, Trx还可通过直接作用于氧化应激相关蛋白的二硫键, 间接抑制氧化应激反应, 保护细胞免受氧化剂的损伤[18, 19, 20]

2.2 抗凋亡作用

Trx在调节细胞凋亡过程中也起着重要作用。ASK-l是一种在诱导细胞凋亡过程中起中枢作用的蛋白酶, 它可以通过激活促分裂素原活化蛋白激酶p38(p38MAPKs)、c-Jun氨基末端激酶(c-JNK)和胞外信号调节激酶(ERK)来诱导细胞凋亡。ASK-l存在于胞浆和线粒体中, 可从外源和内源两种途径诱发细胞凋亡。Trx是ASK-1的直接抑制剂, 可与ASK1的N-端结合, 形成Trx/ASK1复合物, 使ASK1降解, 阻断ASK1依赖的细胞凋亡。研究证实, Trx1基因或Trx2基因被敲除(沉默)后, 启动ASK-1激活c-JNK依赖的细胞凋亡途径, 发生不可逆转的细胞凋亡[21, 22]

除与ASK-1结合, Trx还可以通过以下途径抑制细胞凋亡:①Trx2可与线粒体基质内的细胞色素C (CytC)结合, 抑制凋亡信号的传递, 从而阻止线粒体介导的细胞死亡。研究发现, Trx2缺失体的DT40细胞在培养过程中, 细胞内的ROS不断增多, 并且CytC从线粒体释放, 激活凋亡诱导因子胱冬肽酶9和胱冬肽酶3, 线粒体膜电位下降, 导致细胞凋亡。可见, Trx2在清除线粒体内的ROS及调节线粒体细胞凋亡的信号转导过程中, 都起到了重要作用[23]。②Trx还可以通过核因子κ B (NF-κ B), 调节神经递质介导的细胞凋亡[24, 25]

2.3 生长因子作用

Trx还是一类生长因子, 由淋巴细胞、成纤维细胞等多种细胞产生和分泌, 在细胞增殖和生存过程中起着重要的调节作用。Trx不仅在正常发育过程中对人多核白细胞、单核细胞等多种细胞的分化起调节作用, 还可以做为生长因子刺激T淋巴细胞增殖[26]。有人发现当精子处于发生成熟期时, 精子线粒体内的Trx持续增多, 而在成熟精子中, Trx则较少。Trx参与构成精子的结构蛋白, 有助于精子内二硫键的形成[27]

2.4 对蛋白质的修复与还原作用

Trx可以对蛋白质进行修复与活性调控, 对机体内各种因酶的损伤而受到破坏的体系进行修复。Ritz等用基因敲除的方法验证硫醇氧化剂(如联氨)对E.coli生长的作用, 实验证明, 与对照相比, Trx缺失株E. coli遇到硫醇氧化剂时, 生长受到明显抑制[28]。Trx还可以通过改变具有巯基或氨基的酶的构象影响其所在的反应体系。在光合碳循环中, Rubinsco活化酶、1, 7-二磷酸景天庚酮糖、3-磷酸甘油醛脱氢酶等多个酶都会受到Trx的调控[29]

3 寄生虫Trx研究进展

在有氧条件下, 机体代谢会产生ROS以及与之类似的一氧化氮(NO)等活性氮族分子(RNS), 二者与细胞内氧化还原环境调控和细胞信号传导有关。但浓度过高时, 会对核酸等生物大分子造成损伤, 因此在进化过程中, 机体形成了各种抗氧化机制来抵抗RNS和ROS的破坏作用。大部分原生动物寄生虫是快速复制的需氧生物体, 不但要清除内生性RNS和ROS, 还需要抵抗宿主细胞产生的RNS和ROS, Trx家族就是其主要的抗氧化酶家族之一, 因而寄生虫Trx的作用日益受到人们关注。Trx系统不仅可以清除虫体自身代谢产生的ROS和RNS, 而且在抵抗宿主免疫细胞产生的ROS和RNS的潜在损伤中起着至关重要的作用。

3.1 疟原虫Trx

疟原虫硫氧还蛋白超家族主要有3种Trx和两种硫氧还蛋白样蛋白(thioredoxin like protein, Tlp)。通过保守的活性位点Cys-xx-Cys与蛋白底物的结合, PTrx与PTrxR共同调节蛋白底物的功能活性。PTrxR只能与三种经典的Trx (PTrx1-3)结合, 而不能作用于两种硫氧还蛋白样蛋白(PTlp1-2)[30]。目前, 对于PTrx1的研究最为详尽, 它存在于细胞质中, 有一个活性位点WCGPC[31], 可以直接有效地帮助还原GSSG, 从而作为GSH系统的备用分子[32]; 除了可以清除H2O2等常规的ROS外, PTrx1还可以直接消除叔丁基过氧化氢(tBuOOH), 枯烯氢过氧化物(CHP)等ROS[33]; PTrx1可以还原S-亚硝基来维持抗坏血酸盐, 硫辛酸, 和硫辛酰胺的抗氧化能力; 另外, 通过巯基/二硫键交换, PTrx1还可以特异的作用于S-腺苷甲硫氨酸合成酶和S-腺苷基-L-高半胱氨酸水解酶[34]。PTrx1参与了疟原虫蛋白质合成, 糖酵解, 血红蛋白分解代谢和信号转导等一系列生物学过程。因此, Trx系统对于疟原虫的存活是不可或缺的。

PTlp1-2是一种与PTrx序列相似性极高的蛋白质, 但不能与PTrxR相互作用。研究表明, 胞浆PTlp1具有有活性位点WCGPC并积极参与胰岛素测定, 但不能减少GSSG。 PTlp2是唯一位于线粒体的PTrx, 目前其线粒体氧化还原网络仍有待阐明。

3.2 锥虫Trx

锥虫(Trypanosoma)通过吸血昆虫进行传播, 能够感染循环系统、淋巴及其它器官, 是一种世界性流行的人畜共患寄生虫病。锥虫只有一种Trx, 具备Trx的还原二硫键、抗氧化的经典功能[35, 36, 37, 38, 39]。锥虫Trx等电点(PI=8.5)与其他物种Trx (PI< 6)不同, 在其第26位氨基酸残基上的天冬氨酸被色氨酸替换。研究表明, 锥虫TrxR的功能较弱, 其主要功能被谷胱甘酰亚精胺还原酶(Trypanothione reductase, TR)所取代。TR属黄素氧化还原酶类, 与硫氧还蛋白家族有远缘关系, 在虫体内定位于线粒体的动基体附近, TR只特异存在于锥虫体内, 但不存在于宿主中, 其功能还与谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase, GR)相似。可见, 由于锥虫体内即不具有其他生物强大的GSH/GR体系, TrxR的功能又较弱, TR对于锥虫显得极为重要。

3.3 血吸虫Trx

血吸虫(Schistosoma)成虫主要寄生于人体的肠系膜静脉中, 在不受外界干扰的情况下, 血吸虫可存活30年之久。在发育过程包括成虫阶段, STrx为高丰度表达蛋白, 该蛋白可能是血吸虫与宿主的相互作用中的关键蛋白[40, 41]

2002年, Alger等人从曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)虫卵分泌物中纯化得到硫氧还蛋白(SmTrx), 并证明克隆表达的重组SmTrx能被曼氏血吸虫感染的鼠血清抗体识别, 且制备的抗体能产生循环免疫沉淀, 表明SmTrx具有较好的免疫原性和反应原性, 是理想的免疫诊断抗原候选分子。日本血吸虫(Schistosoma japonicum)大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)是一种由106个氨基酸组成的小分子球状蛋白, 在虫体内广泛分布, 具有保守的活性位点, 是日本血吸虫生长发育过程中的一个非常重要的生理分子[42, 43, 44, 45]。2006年, 韩海渤等人成功构建SjcTrx DNA疫苗及重组抗原蛋白疫苗, 建立小鼠免疫/攻击感染模型, 结果发现小鼠血清中的抗体水平明显升高, 并能诱导强烈的细胞免疫和体液免疫反应, 证明SjcTrx的核酸疫苗和重组蛋白疫苗均能对小鼠有一定的免疫保护力, 由此认为Trx能够作为日本血吸虫疫苗的一个潜在候选因子。2007年, 闻礼永将SjcTrx基因克隆至表达载体pPIczaA, 并在毕氏酵母菌中成功表达, 免疫印迹法检测发现获得的SjcTrx重组蛋白具有较好的免疫反应性, 且与正常小鼠血清和其他几种常见寄生虫感染血清, 均无阳性反应条带[46], 表明SjcTrx重组抗原具有较好的特异性。

4 展 望

Trx是一种在机体内广泛存在的重要的氧化还原平衡调节蛋白质, 具有抗氧化、抗凋亡、调节细胞生长、分化等重要的生物学功能。在原生动物寄生虫的生长、繁殖过程中, Trx不仅要清除自身内生性 RNS和ROS, 还需要抵抗来源于宿主的RNS和ROS对虫体的破坏, 因此, Trx是寄生虫与宿主相互作用的过程中起关键分子之一, 尤其对原虫的存活至关重要, 而且, 锥虫Trx系统比GSH系统更为关键。但是, 目前关于寄生虫Trx的研究相对较少, 不同寄生虫Trx与宿主细胞相互作用的机制等尚不明确, 有待进一步的研究阐明。

The authors have declared that no competing interests exist.

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