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张改, 陈松建, 靳静, 李振江, 王书伟, 黄德海, 李亚辉, 王小亭, 王山梅, 王中全. 噬菌体PF18的生物学特性及其对肺炎克雷伯菌所致小鼠全身感染疗效的初步研究. 中国人兽共患病学报,2016,32(10): 871-875
ZHANG Gai, CHEN Song-jian, JIN Jing, LI Zhen-jiang, WANG Shu-wei, HUANG De-hai, LI Ya-hui, WANG Xiao-ting, WANG Shan-mei, WANG Zhong-quan. Lytic phage PF18 on its characteristics and its effect on the treatment of the systemic infection induced by Klebsiella pneumoniae in mice . CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES,2016,32(10): 871-875  
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中国人兽共患病学报
噬菌体PF18的生物学特性及其对肺炎克雷伯菌所致小鼠全身感染疗效的初步研究
张改1, 陈松建1, 靳静1,2, 李振江1, 王书伟1, 黄德海1, 李亚辉1,2, 王小亭1,2, 王山梅3, 王中全2
1.河南医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室,郑州 451191
2.郑州大学基础医学院病原生物学教研室,郑州 450000
3.河南省人民医院检验科,郑州 450000
通讯作者: 靳静:Email:jing77772006@126.com
基金:河南省科技厅重点科技攻关项目(No.142102310440,No.162102310341); 河南省医学科技攻关计划项目(No.201303199)
摘要

目的 研究新分离噬菌体PF18的生物学特性及其对肺炎克雷伯菌所致小鼠全身感染的疗效。方法 调查PF18的噬菌谱,观察其感染肺炎克雷伯菌临床株F18的噬菌斑形态。电镜下明确其形态分类。提取噬菌体PF18的基因组并进行酶切鉴定。观察PF18尾静脉注射治疗全身感染小鼠的生存状态变化。结果 PF18在F18上可形成直径约为5 mm完全透明且周围有晕环的噬菌斑,电镜显示其属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。PF18感染F18的潜伏期为17 min,爆发量约为200 PFU/细胞。PF18的基因组可被 EcoRI、 BamHI两种限制性内切酶降解,但不能被 HindⅢ, kpnI降解。PF18治疗组小鼠1 d内生存率为100%,1周内生存率可达30%,而无治疗对照组小鼠1 d能全部死亡,差异有统计学意义( P<0.01)。结论 PF18潜伏期短,爆发量大,且治疗肺炎克雷伯菌所致小鼠的全身感染有一定疗效,有望作为对抗多重耐药肺炎克雷伯菌感染的生物抗菌剂,应对PF18进行深入研究。

关键词: 肺炎克雷伯菌; 噬菌体; 生物学特性; 噬菌体治疗; 全身感染
中图分类号:Q939.48 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2016)10-0871-05
Lytic phage PF18 on its characteristics and its effect on the treatment of the systemic infection induced by Klebsiella pneumoniae in mice
ZHANG Gai1, CHEN Song-jian1, JIN Jing1, LI Zhen-jiang1, WANG Shu-wei1, HUANG De-hai1, LI Ya-hui1,2, WANG Xiao-ting1,2, WANG Shan-mei3, WANG Zhong-quan2
1. Department of Pathogen Biology and Immunology, Henan Medical College, Zhengzhou 451191, China
2. Department of Pathogen Biology, Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
3. Department of Laboratory, Henan Province People̓s Hospital, Zhengzhou 450001, China
Corresponding author: Jin Jing, Email: jing77772006@126.com
Fund:Supported by the Key Projects of Science and Technology Department of Henan Provincial Science and Technology Department (Nos.142102310440 & 162102310341) and the Project of Medical Science and Technology Project of Henan Province (No.201303199)
Abstract

The purpose of this study is to analyze the biological characteristics of a novel isolated phage PF18 and to observe the effect of the phage on the treatment of the systemic infection induced by Klebsiella pneumoniae clinical isolate in mice. The morphology of PF18 under electron microscope and the plaque of PF18 on the lawn of K. Pneumoniae F18 were observed. The one-step growth curve and the host range of the phage were investigated. The genome of PF18 was extracted and digested with restriction enzyme. The systemic infection of mice were induced by i.p. 107 CFU of K. pneumoniae F18, 108 PFU of the phage PF18 was administered i.v. 2 hours after the infection. The survival time of the mice was observed. The phage PF18 could form clear plaques of approximately 5 mm in diameter surrounded by a wider halo on F18 lawns. PF18 belongs to the Siphoviridae family and the Caudovirales order. The phage exhibited a 17-min latent, approximately 200 PFU/cell burst size when F18 served as its host. In addition, PF18 genome can be digested by EcoRI and BamHI, but cannot be digested by HindⅢ and kpnI, so the genome of PF18 consists of dsDNA. Phage PF18 treatment can significantly improve the survival time of mice.Without treatment, all of the mice with systemic infection induced by K. pneumoniae F18. By contrast, PF18 treated mice resulted in 100% survival rate after 1 days ( P<0.01) and 30% after 7 days ( P<0.001). PF18, a lytic Siphoviridae phage, has a relatively short latent and a large burst size, and can be effective in the treatment systemtic infection of mice caused by K. pneumoniae clinical strain. These characteristics shall increase the posibility of using this phage as an antibacterial agent; thus, it should be further investigated.

Keyword: Klebsiella pneumoniae; phage; characteristics; phage therapy; systemic infection

肺炎克雷伯菌是革兰氏阴性细菌, 属于肠杆菌科克雷伯菌属, 目前在临床上是仅次于大肠杆菌的条件致病菌。肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界、人体皮肤、肠道和呼吸道, 可以引起支气管炎、肠炎、泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。感染多见于住院的年老或体弱患者。病原体往往从上呼吸道吸入, 或通过污染的雾化器、人工呼吸器或各种导管侵入人体, 医务人员的双手在交叉感染中亦起重要作用。肺炎杆菌已成为医院内感染的重要致病菌之一, 在某些国家中占院内感染的首位。因细菌常对多种抗生素耐药, 故本病预后较差, 致全身感染后病死率高(严重病例达50%)[1]。

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌、藻类和螺旋体等微生物病毒的总称, 其中裂性噬菌体能迅速导致细菌的裂解死亡。自1915年英国细菌学家Twort和法裔加拿大细菌学家Felix d’ Herelle发现噬菌体以来, 噬菌体便被应用于细菌性疾病的预防和治疗。由于抗生素的出现, 大量关于噬菌体治疗的研究被中断。但近年来, 由于临床上大量耐药菌株的出现, 很多学者又重新开始对噬菌体进行分离和研究, 以望找到能有效替代或辅助抗生素的更为安全的生物抗菌剂。本课题组从污水中分离出多株能裂解多重耐药的肺炎克雷伯菌的噬菌体[2, 3, 4], 并对其基本的生物学特性、基因组及其治疗感染动物模型的疗效进行了研究。本文对新分离噬菌体PF18的生物学特性及其对小鼠肺炎克雷伯菌全身感染疗效予以报道。

1 材料和方法
1.1 主要试剂

培养细菌的试剂均购自杭州天和微生物试剂有限公司, 培养基和噬菌体保存液SM等均由本实验室参考文献[2]的方法进行配置。TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。限制性内切酶EcoRI、HindIII、BamHI和KpnI均购自TAKARA公司。λ DNA/HindIII Marker和DSTM 2000 Marker均购自东盛生物公司。

1.2 菌株及其鉴定

176株肺炎克雷伯菌、18株铜绿假单胞菌、22株鲍曼不动杆菌、15株金葡菌和20株大肠埃希菌用于噬菌体PF18噬菌谱的调查。菌株鉴定由细菌自动鉴定系统BD Phoenix(Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA)完成。

1.3 噬菌体的分离、增殖和形态观察

按照文献[5]的方法从郑州新郑市龙湖镇鱼塘水中分离, 增殖和纯化噬菌体, 最终得到高浓度的噬菌体SM悬液(1011 PFU/mL), 用0.22 μ m的滤器过滤除菌后置4 ℃保存备用。

将噬菌体PF18的SM悬液在4℃下进行离心浓缩后(40 000 g× 12 h), 用3 %的戊二醛溶液在0 ℃固定30 min, 然后将固定液滴在铜网(300目)上, 自然沉淀10 min, 再用2 %的磷钨酸(w/v, pH 7.2)负染30 s, 干燥后用透射电镜观察噬菌体形态。

1.4 噬菌体噬菌谱的调查和对不同宿主菌敏感性的测定

参考文献[6]采用滴斑法, 用本实验室现有的菌株对PF18的噬菌谱进行调查, 记录并比较PF18在各宿主菌菌苔表面形成完全透明滴斑区的最小噬菌体浓度, 找出PF18最敏感的宿主菌。

1.5 一步生长曲线的测定

参考文献[2]的方法, 进行一步生长曲线的测定。

1.6 PF18的基因组提取及限制性内切酶作用

将DNaseI、RNaseA与高浓度的噬菌体PF18的悬液(1012 PFU/mL)在37 ℃共同反应1 h, 以降解噬菌体悬液中游离的DNA和RNA。取酶消化过的悬液200 μ L, 参照试剂盒说明书提取噬菌体PF18的核酸。将得到的噬菌体核酸ddH2O洗脱液, 分别用DNaseI、RNaseA和限制性内切酶QuickCutTMEcoRI、QuickCutTMHindⅢ 、BamHI, kpnI于37 ℃进行酶解反应30 min。反应体系为10 μ L(噬菌体核酸ddH2O洗脱液8 μ L、酶1 μ L和10× QuickCut Green Buffer 1μ L)。将酶切产物置于0.8 %含有EB的琼脂糖凝胶中电泳(80 V)2 h。紫外光激发下观察电泳结果。

1.7 F18所致小鼠全身感染的建立

选取24只6~8周龄健康(体重约20 g, SPF 级)的BALB/c 雌性小鼠(购自郑州大学实验动物中心)随机分为3组, 腹腔分别注射100 μ L不同浓度(108、107和106 CFU/mL)的F18新鲜菌液, 定期观察各组小鼠的存活情况, 将引起所有小鼠在24 h内全部死亡的最小菌量作为小鼠全身感染的注射剂量。

1.8 PF18对全身感染小鼠治疗效果的观察

选取16只BALB/c小鼠, 腹腔注射肺炎克雷伯菌建立小鼠全身感染模型, 并随机分为治疗组和对照组。2 h后对治疗组小鼠行尾静脉注射噬菌体PF18悬液(108 PFU/mL, 100 μ L), 对照组仅尾静脉注射生理盐水100 μ L。每天观察小鼠的存活情况, 共观察7 d。

1.9 统计学分析

使用SPSS13.0统计软件(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)对数据进行分析。细菌和噬菌体数目取对数后用( x¯± s)表示, 采用 Kaplan-Meier方法对小鼠的生存曲线进行统计分析, P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 噬菌斑及噬菌谱

PF18在F18菌苔上形成的噬菌斑完全透明, 直径5 mm左右, 周围有厚约5 mm左右的晕。噬菌谱调查显示:PF18可以感染被调查的176株肺炎克雷伯菌中的18株(约占10%), 但不能感染其他属的细菌。PF18是以F18作为宿主菌分离得到的, 所以本实验的后续实验研究均以F18作为PF18的宿主菌。

图1 PF18在宿主菌菌苔上形成的噬菌斑Fig.1 Plaques of K. pneumoniae phage PF18

2.2 电镜下的形态

如图2所示:PF18有一个二十面体立体对称型的头部, 和一个长的尾部, 按照国际病毒分类委员会的分类方法, PF18属于有尾噬菌体目, 长尾噬菌体科。

图2 PF18的电镜图Fig.2 Electron micrographs of phage PF18

2.3 一步生长曲线

以培养时间为横坐标, 以培养体系中总噬菌体活性的对数值为纵坐标绘制一步生长曲线。如图3所示:PF18感染F18的潜伏期大约为17 min, 裂解量约为(200± 13) PFU/细胞。裂解期约为12 min。

图3 PF18的一步生长曲线Fig.3 One-step curve of phage PF18

2.4 PF18基因组类型和酶切图谱

酶切结果显示, 噬菌体PF18 的基因组可被DNaseⅠ 降解, 而不能被RNase A 降解, 提示噬菌体基因组为DNA。从图4中可以看出, 噬菌体PF18的核酸含有EcoRI、BamHI两种限制性内切酶的酶切位点, 但不含有HindIII, kpnI限制性内切酶的酶切位点, 此结果进一步证实噬菌体PF18的核酸类型为dsDNA。

图4 噬菌体PF18的酶切图Fig.4 DNA restriction endonuclease digestion of PF18
1 and 7 are the Marker DL23130 and DL2000, 2, 3, 4, 5 are the banding patters of phage LH-02 DNA digested with HindIII, kpnI, EcoRI and BamHI, respectively. 6 is the genome of PF18

2.5 PF18对F18所致小鼠全身感染的疗效观察

对小鼠腹腔注射100 μ L不同浓度的肺炎克雷伯菌F18新鲜培养的菌液, 注射浓度为108 CFU/mL和107 CFU/mL的两组小鼠在24 h内全部死亡, 而注射浓度为106 CFU/mL组小鼠在24 h内有4只死亡, 另4只存活。本研究选择107 CFU/mL作为小鼠肺炎克雷伯菌全身感染模型的注射剂量。

如图5所示:未用噬菌体治疗的全身感染F18的小鼠1 d内全部死亡, 而用噬菌体PF18尾静脉治疗组小鼠1 d内存活率可达100%。但1 d后治疗组小鼠死亡率开始上升, 到第4 d存活率仅为40%。此后, 治疗组小鼠存活率趋于稳定, 7 d仍可保持30%的存活率, 且存活小鼠生存状态良好。两组小鼠存活率差异有统计学意义(P< 0.01)。

图5 PF18治疗感染F18小鼠的生存率Fig.5 Survival curve of mice treated with phage PF18 after K. pneumoniae infection

3 讨 论

20世纪初, d’ Herelle发现噬菌体之后, 就将噬菌体应用于治疗细菌感染并验证了其有效性。后来的实验让人们意识到噬菌体作为抗菌制剂具有一定的应用前景。随着抗生素的大量生产及广泛使用, 加上噬菌体治疗感染在当时缺乏一定的试验标准而遭到欧美一些国家的抛弃。但近年来, 在抗生素的选择压力作用下, 临床上出现了许多耐多重药物的“ 超级细菌” , 给临床治疗造成了极大的困难。随着细菌耐药形式的日渐严峻及人们对于生物安全观念的变化, 加之噬菌体治疗一直在东欧一些国家小范围应用, 越来越多的科学家意识到, 噬菌体有可能成为继抗生素以来的又一抗感染制剂。人们陆续分离得到了很多噬菌体, 并且相继在大肠杆菌[7]、铜绿假单胞菌[8]、粪肠球菌[9]、金黄色葡萄球菌[10]和肺炎克雷伯菌[11]等的动物感染模型中验证了噬菌体治疗细菌感染的有效性。

噬菌体进入机体后, 由于其严格的宿主特异性, 会很快集中在感染灶而消灭病原体。因其增殖能力强, 所以噬菌体杀菌的效率较抗生素要大大提高。同时噬菌体作为一种生物制剂, 在针对病原菌方面具有专一性的优势[12], 只杀灭致病菌, 对正常菌群无影响, 可避免二重感染的发生。据报道[13], 细菌对抗生素的抗性突变为10-6, 细菌对噬菌体的抗性突变率为10-7, 而噬菌体和抗生素联合用药时细菌的抗性突变为10-13。另外, 据Brussow[14]等报道, 地球上存在大约1032个噬菌体, 约是细菌的十倍, 从进化的观点来看, 有可能筛选得到针对临床所有致病性的多重耐药菌或全耐药菌株的裂解性噬菌体, 而成为我们抵抗细菌感染的利器。

本实验室从污水中分离得到了多株肺炎克雷伯菌多重耐药菌株的噬菌体并对其生物学特性展开研究[2, 3, 4], 如前期分离研究的LH-01和LH-02均属于短尾噬菌体, 本文报道的噬菌体PF18属长尾噬菌体。PF18在宿主菌F18上可以形成直径约为5 mm的透明噬菌斑, 表明PF18属于裂解性噬菌体。PF18的噬菌谱较广, 可以感染约10%的肺炎克雷伯菌临床株, 且PF18感染F18的潜伏期短(大约为17 min), 裂解量大(约为200 PFU/细胞), 将其作为一种生物抗菌剂, 可迅速控制感染。正如本研究中, 动物实验结果所示, PF18在治疗由F18引起的小鼠全身感染方面有较好的治疗效果, 与无治疗对照组相比, PF18治疗后可明显延长F18致死性全身感染小鼠的生存期和生存率, 这些均提示PF18具有一定的临床应用前景, 因此, 在未来的研究中, 对新分离噬菌体PF18的治疗特性以及基因组方面展开深入研究将具有重要意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

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