最早的中和试验是采用接种方式将含病毒的样品接种到试验动物或鸡胚/细胞培养, 以观察病变情况, 但早期中和试验只能初步鉴定出该样品是否具有病毒感染以及较难确定出病毒种类。Simithburn等^[12]采用中和试验在乌干达、苏丹、刚果和肯尼亚等国家对当地人群开展WNV抗体滴度调查, 发现当地人群WNV抗体水平较高(部分地区超过50%)。Andayi等^[13]在东非吉布提市区采用该方法对来自324个家庭的1 045成员进行WNV抗体检测, 结果发现WNV抗体阳性率为0.6%。由于早期NT交叉反应高、特异性差等特点, 目前已被空斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT)替代。Melissa等^[14]采用单克隆抗体对传染WNV-NY2000株的BHK-21-15细胞开展PRNT50检测, 发现单克隆抗体能够与WNV表面抗原特异性结合, 且与其它黄病毒无交叉反应, 较适合于检测健康人群先前是否感染过WNV的血清学调查。近年来, Hofmeister^[15]采用PRNT观察7周龄北美林鸳鸯感染WNV研究, 结果发现感染WNV后的第3 d就能检测到WNV IgM, 第5 d检测到WNV IgG, 提示WNV病毒血症期短但病毒含量高的特点。此外, Gennaro等^[16]采用早期血清中和试验(Serum Neutalization Assay, SN)和PNRT-90两种方法对38份来自克罗地亚的WNV神经性病变病人标本进行 WNV抗体定量比较检测发现, 两者方法无显著差异(P> 0.05), 但SN省时省力, 不需细胞培养, 且使用方便, 更适合WNV感染的早期诊断。

该方法是以免疫酶技术为基础检测人或动物体液中微量物质的一种新型固相免疫测定技术, 是现今测定病毒感染人或动物抗体(IgM/G)应用最广泛的一种检测方法。Escribano-Romero等^[17]在塞尔维亚采用ELISA和NT两种方法对279头圈养猪、318头野猪和91只狍感染WNV检测, 发现ELISA WNV阳性分别为43(15.4%)、56(17.6%)和17(18.7%); 同时采用NT对ELISA阳性标本验证发现阳性只有6(15.4%)、33(59%)和4(23.5%), 说明ELISA检测WNV特异性低。Kolawole等^[18]采用ELISA方法对Ogbomoso地区的城市和农村居民93份血清标本检测WNV的IgM和IgG, 结果显示IgG阳性为19.4%, IgM阳性为12.9%; 与其它黄病毒的交叉试验阳性率为8.6%, 说明ELISA检测WNV抗体敏感性较高, 但特异性不强。Medic等^[19]采用ELISA和PRNT-90比较检测塞尔维亚北部的7个不同地区马科动物血清中WNV感染情况, 共检测252份标本, 结果ELISA IgG阳性为72份(28.6%), 但采用WNV-2型病毒株PRNT-90进行验证阳性仅为48份(19.1%)。此外, Vilibic-Cavlek等^[20]在克罗地亚西北地区搜集了95份临床疑似感染WNV病人标本, 采用ELISA检测其IgM和IgG抗体, 并采用NT进一步验证, 结果显示26份标本为阳性(27.4%), 但采用NT对ELISA检测阳性标本进行验证仅有20份为阳性, 检测吻合率为76.9%。由于WNV的宿主广泛, ELISA检测WNV抗体具有敏感性高, 特异性低的特点, 与黄病毒具有较高的交叉反应, 常需要PRNT进一步验证。近几年来, 针对上述ELISA特异性较低的特点, 不断研发出了适用WNV检测的ELISA技术, 如捕获法ELISA、表位阻断ELISA、竞争法ELISA和生物素微球免疫测定法(b-MIA)等。

利用荧光色素不仅能与抗体球蛋白结合, 也可以与病毒感染的细胞结合, 并可通过显微镜进行观察的原理研发, 可用于检测或定位各种抗原和抗体。Niedrig等^[33]使用IFA和ELISA在南非人间WNF爆发期间收集的200份血清比较研究, 并通过NT进行验证, 结果显示, ELISA特异性为99.5%, IFA的特异性为100%。Malan等^[34]采用IFA对82份WNV血清和16份脑脊液进行WNV IgG 和IgM检测, 并把检测结果与WNV IgG ELISA和Ig M MAC-ELISA结果进行比较, 结果发现不仅IgG IFA与IgG ELISA吻合率为92%, 敏感性为100%, 特异性为90%; IgM IFA与IgM MAC-ELISA吻合率为98%, 敏感性为96%, 特异性100%, 而且认为IFA法在WNV血清学诊断中较ELISA和MAC-ELISA更廉价和敏感。Sanchini等^[35]在2011年的第2次WNV感染血清学诊断的外在质量保证(External Quality Assurance, EQA)的研究中, 对13份WNV阳性的血清标本采用IFA和ELISA比较检测, ELISA的敏感性IgM为54%, IgG为87%; IFA的敏感性IgM为45%, IgG为86%。但对于WNV谱系Ⅱ , IFA比ELISA更敏感, IgM为91%, IgG为77%。特异性方面ELISA中IgM为94%, IgG为64%; 而IFA中IgM为99%, IgG为85%, 在IgG的检测中IFA比ELISA更特异(P< 0.05)。但该方法比NT特异性差, IgG IFA与其它虫媒病毒有广泛的交叉反应, 但IgM IFA则无交叉反应, 常用作临床病例的调查^[33]。

该技术为利用抗表面蛋白(E)抑制禽类红细胞聚集的原理研制而成, 具有廉价, 快速, 无种属特异性, 不需BSL-3实验室条件, 只需抗原制备等优点^[36]。Thompson等^[37]在特立尼达的动物种群中进行虫媒病毒血清学阳性率调查, 采用HIA和表面阻断ELISA方法对58匹当地未接种WNV疫苗的马进行WNV抗体检测, 并通过PRNT复核, 结果显示HIA11例为WNV抗体阳性, 10匹马经HIA检测为阳性(17.2%), 表面阻断ELISA 7例阳性(12.1%), 说明HIA的敏感性比表面阻断ELISA高。Lorono-Pino等^[38]在墨西哥尤卡坦州对于2002年7-9月搜集的252匹马标本采用该方法进行WNV抗体筛选, 根据标准方法和鹅红细胞进行结合, 证实有6匹马感染WNV。Nicolli等^[39]在加拿大的Manitoba省的健康科学中心对2003年5-10月的79名肝移植患者血清进行检测发现, 20名患者为WNVIgG-EIA阳性, 采用HIA对这20份EIA阳性标本验证示只有4份为阳性, 又进行NT和RT-PCR进行验证全部为阴性。说明HIA敏感性较ELISA低, 特异性较NT低。而且, HIA的检测结果受非特异性抑制剂影响, 且与JEV血清复合群和其它黄病毒血清复合群之间存在广泛的交叉反应等限制了该方法的应用^[36]。

根据抗原抗体复合物可与补体结合从而消耗掉反应液中已知浓度的补体, 以补体消耗的量推测出样本中抗原或抗体的含量, 该方法是过去常用的检测方法。Autorino等^[40]对于1998年WNV流行的意大利托斯卡纳地区的159匹马采用该方法进行检测, 并通过PCR证实有123匹马为WNV阳性(78%), 在12匹患病马的标本中经CFT检测均为WNV阳性, WNV抗体滴度为1:4~1:128之间。由于CFT在数据分析和结果判读方面费时费力, 在人类感染WNV的诊断中已很少使用^[41]。

补体依赖的细胞毒(CDC)法, 该方法用于检测马血清中WNV NS1抗体的试验发现它可将WNV感染的马从JEV感染的马中区分开来, 较好地用于WNV感染的血清学诊断^[42]。表面增强拉曼散射(SERS)免疫测定法, 该方法利用涂覆有纳米金的WNV E蛋白作为SERS的反应底物和A/G蛋白一起与拉曼标记孔雀绿共轭结合作为双功能的拉曼标记/抗体结合物, 将涂覆有纳米金的E蛋白与兔的免疫血清共同孵化后, 对夹心免疫复合物进行激光扫描显示出SERS反应信号, 通过特征性集束光谱峰在血清中的显示比例能够最低检测出血清中2 ng/mL的抗体, 与传统的免疫检测方法相比, 它的敏感性是间接ELISA的400倍, 可替代传统的ELISA用于哺乳动物WNV感染的检测^[43]。膜电化学检测法, 该方法通过在纳米多孔氧化铝膜上放置一根感应电极, 研制出了一种能够识别病毒颗粒或者病毒E蛋白的基于膜电化学生物传感器, 并根据IgM抗E蛋白结构域 III 的特点设计出了用于检测WNV颗粒的特异性生物识别探针。它对于病毒蛋白和全病毒颗粒具有高灵敏性, 最低可检测到4 pg/mL, 和 2个颗粒/100 mL^[44]。该方法需样本量少, 能够30 min内完成蛋白质和病毒颗粒的检测, 在宿主感染早期具有良好应用前景。

WNV是现今世界上流行范围最广的虫媒病毒之一, 严重威胁着人类公共健康, 特别是儿童、老年人和免疫功能低下者。针对目前WNF并无特效药物, 以支持疗法为主, 尚无人用疫苗, 预防WNV感染最好的方法仍然是防止蚊子叮咬, 同时最近分离到的病毒株通过细胞培养和动物接种显示WNV毒力正在增强^[45]。尽管我国近年来在WNV流行病学和临床特征的认识方面有了明显提高, 而且在实验室检测方面有新的发展, 但WNV在我国属于新发虫媒传染病, 迫切需要加大力量研发出新的WNV血清学检测技术, 为及时发现WNF输入病例和处置奠定基础。