香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术研究
梅玲玲1, 张俊彦1, 龚璞1, 潘军航1, 占利1, 张云怡1, 杨勇1, 吴嘉南2
1.浙江省疾病预防控制中心, 杭州 310005
Email: llmei@cdc.zj.cn2.浙江大学食品科学与工程学院,杭州 310058
梅玲玲;Email:llmei@cdc.zj.cn
摘要

目的利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便,快速,特异,灵敏的香港海鸥型菌检测方法.方法 根据香港海鸥型菌16S rDNA的保守区域设计特异性引物和探针.用不同浓度,不同温度对反应体系引物浓度,探针浓度及退火温度进行优化.用添加已知量的香港海鸥型菌样本验证方法敏感性;用香港海鸥型菌以及大肠杆菌,沙门菌,副溶血性弧菌,金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性和稳定性.结果 当25 μL反应体系中上,下游引物(10 μmol/L)各为0.6 μL,探针(10 μmol/L)为0.4 μL,模板DNA量为5.0 μL,反应条件:预变性95 ℃ 20 s ,变性95 ℃10 s,退火57 ℃ 40 s,40个循环时,香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系[Ct=-3.538×log(菌浓度)+13.56, r=0.999],方法的最低检测浓度达到36 cfu/mL.23株香港海鸥型菌检测Ct值均小于35,而104株非香港海鸥型菌检测Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线.隔天连续5 d重复试验Ct值变异系数小于3.20件活鲤鱼,18件活草鱼香港海鸥型菌检测率实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法( P <0.01, χ2 =21 .50).且后者所需时间为5 d,前者仅需10 h.结论 TaqMan实时荧光定量PCR法是一种快速简便,特异性强,灵敏度高的香港海鸥型菌检测方法,值得推广应用.

关键词: 香港海鸥型菌; TaqMan-MGB探针; 实时荧光PCR
中图分类号:R378 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2016)02-0160-05
TaqMan-MGB probe fluorescent real-time PCR method for detection of Laribacter hongkonggensis
MEI Ling-ling1, ZHANG Jun-yan1, GONG Pu1, PAN Jun-hang1, ZHAN Li1, ZHANG Yun-yi1, YANG Yong1, WU Jia-nan2
1.Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310005, China
2.Zhejiang University College of Biosystems Engineegring and Food Science, Hangzhou 310058, China
Mei Ling-ling, Email:llmei@cdc.zj.cn
Abstract

A TaqMan-MGB probe fluorescent real-time PCR method was developed for the detection of Laribacter hongkonggensis with high specificity and sensitivity. Primers and probe were designed based on the conservative sequence region of 16S rDNA. Meanwhile, the concentration of both primers and probe in amplification system and annealing temperature were optimized. The sensitivity, specificity and stability of this method were tested. Under the optimal amplification conditions, a strong linear relationship between the Ct and the logarithm of the bacteria concentration was obtained [Ct-3.538 log(concentration of bacteria)+13.56, r=0.999], the detection limitation attained 36 cfu/mL. The Ct of 23 L. hongkonggensis strains were all less than 35, to contrast, the Ct of most of the 104 strains, which belong to other species, were above 35, even no typical amplification curve was detected in some strains. The coefficient of variation of this method was exhibited less than 3 according to repeated experiments that were performed 3 times in 5 days. The detection rate of L. hongkonggensis from either 20 living carps or 18 living grass carps by using fluorescent real-time PCR was significantly higher than that by using traditional detection method( P<0.01, χ2 =21 .50) . The fluorescent real-time PCR method was demonstrated to be specific, sensitive and simple for the detection of Laribacter hongkonggensis.

Keyword: Laribacter hongkonggensis; TaqMan-MGB probe; fluorescent real-time PCR

香港海鸥型菌(Laribacter hongkonggensis)是近20年来医学界发现的首种可致人腹泻, 甚至严重肠胃炎的新的致病菌, 属奈瑟氏科, 为需氧及兼性厌氧, 革兰阴性无芽孢杆菌.该菌最早见报于2001年, 由Yuen等人从一位肝硬化病人的胸腔脓血中分离出(菌株号HKU1)[1].可引起社区性胃肠炎和旅行者腹泻, 其临床表现与沙门菌和空肠弯曲菌引起的病征相似, 多数病人出现水样腹泻, 偶有血便, 目前在香港, 中国大陆, 日本, 瑞士, 非洲及中美洲相继被发现, 淡水鱼已被证实为香港海鸥型菌宿主[2, 3, 4, 5].

目前香港海鸥型菌的检测和鉴定方法采用改良头孢哌酮麦康凯琼脂筛选可疑菌落, 用API 20NE作生化鉴定, 并用纸片法进行药敏实验作进一步确诊[2, 3, 4, 5, 6].操作步骤复杂, 周期长, 不便于快速确诊.本次研究在16S rDNA保守区域序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针, 运用实时荧光PCR技术, 建立了一种快速简便, 特异, 灵敏的香港海鸥型菌检测方法.

1 材料与方法
1.1 试验菌株

23株香港海鸥型菌分离至草鱼或鲤鱼, 所有菌株的API 20NE生化鉴定结果与HKUl菌株一致, 经16S rDNA基因序列分析, 与HKUl株同源性在99.4%~100%[6].痢疾志贺菌CMCC 51570, 宋内志贺菌CMCC 51334, 副溶血性弧菌ATCC 17802, 大肠杆菌ATCC 25922, 阪崎肠杆菌ATCC 51329, 单增李斯特菌CMCC 54002, 大肠杆菌0157:H7 CMCC 43888, 伤寒沙门菌CMCC 50097, 金色葡萄球菌ATCC 25923, 铜绿假单胞菌ATCC 25873, 变形杆菌CMCC 49072, 鸭沙门菌CMCC 50083, 拟态弧菌ATCC 33653购自中国药品生物制品鉴定所和上海汉尼生物公司.13株单增李斯特菌, 25株副溶血性弧菌, 12株大肠杆菌, 18株沙门菌, 22株金色葡萄球菌及1株铜绿假单胞菌由本中心分离自各类食品或腹泻病人粪便.

1.2 主要试剂与仪器

MX3000P荧光定量PCR仪为美国Stratagne公司产品; DNA提取试剂盒, PCR反应试剂(DRR039S)购自宝诚生物工程(大连)有限公司, TaqMan-MGB(FAM)探针, 引物由美国生物系统(ABI)公司合成.改良头孢哌酮麦康凯琼脂干粉, 营养肉汤干粉, 营养琼脂干粉购自北京陆桥技术责任有限公司, 均经质量鉴定合格, 并在有效期内使用.

1.3 引物的设计, 合成

在GenBank检索香港海鸥型菌16S rDNA的保守区域, 并通过NCBI网站BLAST确定与其它物种基因非同源的DNA核酸片段.运用Primer Express3.0软件设计获得1组引物和探针(表1).

表1 引物和探针序列 Tab.1 Parameters of primers and probe used in this study
1.4 Taq Man-MGB探针实时荧光PCR反应条件的优化

1.4.1 引物, 探针的优化

总反应体系为25 μ L, 包括Premix EX Taq(2× ) 12.5 μ L, ROX Reference Dye II(2× )0.2 μ L, DNA模板5 μ L, 上, 下游引物(10 μ mol/L)分别采用0.3 μ L, 0.6 μ L, 0.9 μ L, 1.2 μ L 4种浓度, 探针(20 μ mol/L)分别采用0.2 μ L, 0.4 μ L, 0.6 μ L, 0.8 μ L 4种浓度按矩阵排列方式组合, 在Stratagene Mx3000P 荧光定量PCR仪上进行扩增.反应体系为95 ℃ 预变性20 s.95 ℃ 变性10 s, 57 ℃ 退火及延伸40 s, 40个循环, 于57 ℃ 处采集荧光.根据Ct值和荧光值选择合适的引物, 探针浓度.

1.4.2 退火及延伸温度优化

将退火及延伸温度分别设置为55 ℃ , 56 ℃ , 57 ℃ , 58 ℃ , 60 ℃ , 61 ℃ , 62 ℃ , 63 ℃ , 在荧光定量PCR仪进行实时荧光PCR反应, 根据反应结果选择最佳退火及延伸温度.

1.4.3 模板DNA的制备

1.4.3.1 煮沸法

在普通营养琼脂上挑取1~3个单菌落, 置于100 μ L灭菌dd H2O中, 100 ℃ 加热10 min, 10 000 r/min离心5 min, 吸取上清液置4 ℃ 冰箱保存备用.

1.4.3.2 试剂盒提取法

按试剂盒使用说明书进行.

1.5 灵敏性试验

取香港海鸥型菌新鲜液, 用生理盐水10倍稀释成10-1~10-7, 取10-4~10-74种稀释液采用平板计数法作菌量计数.同时每个稀释度各取1.5 mL菌液, 用热裂解法提取DNA后进行荧光PCR检测.根据计数及PCR结果评价方法的检测灵敏度.

1.6 特异性试验

用23株香港海鸥型菌以及痢疾志贺菌, 副溶血性弧菌, 大肠杆菌等13种标准菌株, 13株单增李斯特菌, 25株副溶血性弧菌, 12株大肠杆菌, 18株沙门菌, 22株金色葡萄球菌, 1株铜绿假单胞菌DNA, 通过实时PCR检测来验证方法的特异性.

1.7 重复性试验

对3株香港海鸥型菌, 1株铜绿假单胞菌ATCC 25873和1株大肠埃希菌标准株ATCC 25922连续5 d重复进行实时PCR检测, 通过计算反应Ct值变异系数验证方法的重复性.

1.8 检测方法比较

从市场上采集20件活鲤鱼, 18件活草鱼样品, 香港海鸥型菌常规检验方法按文献[6]方法进行.实时PCR检测样本处理, 用无菌棉纤挑取少量肠中段内容物, 接种于营养肉汤, 37 ℃ 需氧培养8 h后, 吸取1.5 mL, 6 000 r/min 10 min, 取沉淀用热裂解法提取DNA, 用最佳的优化条件进行实时PCR扩增.

1.9 诊断标准

Ct值小于等于35者为阳性, Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线者为阴性, 每次试验均设阴阳性对照.

2 结果
2.1 引物, 探针浓度优化结果

上, 下游引物(10 μ mol/L)采用0.3 μ L, 0.6 μ L, 0.9 μ L, 1.2 μ L, 探针(20 μ mol/L)采用0.2 μ L, 0.4 μ L, 0.6 μ L, 0.8 μ L按矩阵排列方式组合进行实时荧光PCR反应结果, 随着PCR反应体系中探针浓度的增加, 荧光值不断提高, 但Ct值不断增大.上, 下游引物量为0.3 μ L时, Ct值偏大, 在0.6~1.2 μ L范围时, 对Ct值及荧光值影响不明显(图1).

图1 引物, 探针浓度优化结果Fig.1 Optimization of the concentration of the primers and the probe 1: primers 1.2 μ L, probe 0.4 μ L; 2: primers 0.9 μ L, probe 0.4 μ L; 3: primers 0.6 μ L, probe 0.4 μ L.

2.2 退火温度的优化结果

将退火温度分别设置为55 ℃ , 56 ℃ , 57 ℃ , 58 ℃ , 60 ℃ , 61 ℃ , 62 ℃ , 用荧光定量PCR仪进行PCR反应结果, 与退火温度相对应的实时荧光PCR扩增Ct值分别为14.05, 14.91, 12.05, 14.19, 15.14, 15.18, 16.15.其中温度为57 ℃ 时, Ct值最小, 荧光值最高.

2.3 模板DNA提取方法的比较结果

将煮沸法与试剂盒提取法制备的模板进行荧光PCR反应(图2)结果, 煮沸法制备的2份DNA模板Ct值分别为22.70, 24.47, 试剂盒提取法的Ct值依次为15.91, 15.55.两种方法的扩增荧光强度相当.

图2 不同模板DNA提取方法的实时荧光PCR扩增结果Fig.2 Amplification results using fluorescent real-time PCR with template DNA extracted by different methods 1, 2: heating method; 3, 4: DNA extraction kit method.

2.4 灵敏性试验结果

用平板计数法对36 ℃ 培养20 h香港海鸥型菌肉汤计数结果为3.6× 107 cfu/mL.分别取浓度为3.6× 107cfu/mL, 3.6× 106cfu/mL, 3.6× 105cfu/mL, 3.6× 104cfu/mL, 3.6× 103cfu/mL, 3.6× 102cfu/mL, 3.6× 10 cfu/mL 7种浓度菌培养物进行实时荧光PCR扩增结果, Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系, Ct=-3.538× log(菌浓度)+13.56, 相关系数(r)为0.999.方法的最低检测浓度达到36 cfu/mL(图3-1, 图3-2).

图3-1 Taq Man-MGB探针实时荧光PCR反应灵敏性试验扩增结果Fig.3-1 Results of sensitivity tests of TaqMan-MGB probe fluorescent real-time PCR 1-7: concentration of bacteria were 3.6× 107cfu/mL, 3.6× 106cfu/mL, 3.6× 105cfu/mL, 3.6× 104cfu/mL, 3.6× 103cfu/mL, 3.6× 102cfu/mL, 3.6× 10 cfu/mL, respectively.

图3-2 Taq Man-MGB探针实时荧光PCR反应灵敏性试验扩增结果标准曲线Fig.3-2 Standard curve for sensitivity tests of TaqMan-MGB probe fluorescent real-time PCR X-axle means the concentration of bacteria, Y-axle means Ct value.

2.5 特异性试验结果

对23株香港海鸥型菌分离株以及志贺菌, 副溶血性弧菌, 大肠杆菌, 阪崎肠杆菌, 单增李斯特菌, 沙门菌, 金色葡萄球菌等104株非香港海鸥型菌进行实时PCR反应结果, 23株香港海鸥型菌Ct值均小于35, 而104株非香港海鸥型菌Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线(图4).

图4 不同菌株实时荧光PCR反应结果Fig.4 Amplification results of fluorescent real-time PCR for different bacteria strains

2.6 重复性试验结果

取3株香港海鸥型菌, 1株铜绿假单胞菌ATCC 25873和1株大肠埃希菌标准株ATCC 25922隔天连续5 d重复进行实时PCR检测结果如表1所示.

表2 实时荧光PCR检测的重复性检测结果 Tab.2 Results of repeated experiments of fluorescent real-time PCR

表1可见, 3种细菌均能够正确判定.3株香港海鸥型菌PCR反应平均Ct值分别为14.03, 16.42和21.00, Ct值的变异系数均< 5%.铜绿假单胞菌和大肠埃希菌PCR反应Ct值最小为37.39, 且有6批次扩增曲线成平滑直线.

2.7 检测方法比较结果

对20件活鲤鱼, 18件活草鱼同时采用实时荧光PCR检测技术与常规检测方法进行香港海鸥型菌检测结果, 常规检测方法在2件活鲤鱼, 1件活草鱼分离到香港海鸥型菌.实时荧光PCR检测5件阳性, 33件阴性.经统计学分析实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法(P < 0.01, χ 2=21.50).前者所需时间为5 d, 后者仅需10 h.

3 讨论

香港海鸥型菌(Laribacter hongkongensis)是2001年香港大学发现并命名的食源性致病菌, 为广东淡水鱼输往香港的必检致病菌之一[1, 2, 3, 4, 5].虽然至今尚未出现香港海鸥型菌引起的食源性疾病暴发, 但由于污染源为人群消费量极大的淡水鱼产品, 我国存在暴发香港海鸥型菌食源性疾病的可能性.建立快速, 简便, 特异, 敏感的香港海鸥型菌检测方法对该食源性疾病的预防, 控制和快速诊断具有重要意义.

本次研究针对香港海鸥型菌该菌的16S rDNA保守区域设计特异性引物和TaqMan-MGB探针建立的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR方法避免了常规PCR检测存在假阳性和PCR污染等弊端.实验采用的TaqMan-MGB探针是在TaqMan探针基础上进行了改进, 在探针的3'端增加了MGB(minor groove binder)分子, 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团, 从而大大降低实时荧光PCR反应本底信号.同时MGB的修饰将探针的退火温度提高10 ℃ 左右, 提高了PCR反应过程中的特异性[7].通过反复实验, 最终优化得到的反应体系为Premix Ex TaqTM(2× ) 12.5 μ L, Rox Reference Dye Ⅱ (50× ) 0.5 μ L , 上, 下游引物(10 μ mol/L )0.6 μ L, 荧光探针溶液(20 μ mol/L) 0.4 μ L, 模板 2 μ L, 再用d H2O 补足至25 μ L .PCR 反应条件(两步法):95 ℃ 10 s, 1个循环; 95 ℃ 5 s, 57℃ 20 s, 40个循环, 整个反应过程不到1 h, 检测灵敏度达到36 cfu/mL, 对香港海鸥型菌以及志贺菌, 副溶血性弧菌, 大肠杆菌, 阪崎肠杆菌, 单增李斯特菌, 沙门菌, 金色葡萄球菌等细菌检测具有很好的特异性, 稳定性高.此方法的建立为香港海鸥菌的检测提供了有效的工具.

不同的引物不仅影响方法的特异性, 且影响扩增效率, 选择适合的引物对建立快速, 简便, 特异, 敏感的香港海鸥型菌检测方法致关重要.考虑到TaqMan-MGB探针合成价格较高, 本次试验前期利用SYBR GreenⅠ 荧光染料对3组引物进行筛选, 效果同样明显, 却节约了2条TaqMan-MGB探针合成成本.在DNA模板的制备上, 试剂盒提取法的Ct值虽小于煮沸法, 但考虑到煮沸法操作简便, 快速, 廉价, 且不影响检测结果.因此, 作者认为DNA模板的制备可采用煮沸法.

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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