目前, 多重PCR方法已广泛应用于各类疫病的检测, 针对布鲁氏菌的快速检测也做出了许多研究。杜昕颖^[2]等针对外膜蛋白31 kD、22 kD和2a基因, 建立了能特异地检测标本中布鲁氏菌的多重PCR检测方法。张三东等^[3]根据GenBank上发表的布鲁氏菌omp31、bp26、omp10基因序列, 设计合成3对特异性引物, 成功地建立了布鲁氏菌多重PCR快速检测方法, 在模拟布鲁氏菌阳性牛奶标本中最低可检出细菌数为80 CFU/mL。陈军^[4]等建立了可以鉴别布鲁氏菌6个种的多重PCR方法和用于鉴别感染猪的布鲁氏菌5个生物型的多重PCR方法, 两种方法均具有较好的特异性和重复性。陈思^[5]等建立了一种快速检测牛、羊、猪、犬布鲁氏菌病的多重PCR方法。该方法检测牛、羊、猪、犬布鲁氏菌的灵敏度分别为1.1× 10²、5.1× 10²、3.5× 10²、2.5× 10² CFU/mL。应用该方法检测模拟的布鲁氏菌阳性牛奶样品, 灵敏度达到1.0× 10³ CFU/mL。谢芝勋^[6]等根据牛布鲁氏菌BCSP-31K基因和牛分枝杆菌23S rRNA建立了多重PCR快速检测鉴别这两种病原体的方法。

由此可知, 多重PCR应用灵活性强, 而且操作简便、灵敏度高、可快速检测鉴别多种病原体, 在临床多种病原体混合感染的鉴别诊断上具有独特优势和很高的实用价值。但多重PCR引物设计复杂, 易产生PCR副产物焦磷酸, 且结果不稳定, 这些问题是多重PCR方法需要克服的。

实时荧光定量PCR, 是美国PE公司于1995年研制出的一种核酸定量检测技术, 融合了PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点, 通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化判定目的片段的有无和含量。

曾庆贺等^[7]以16S rDNA片段设计了布鲁氏菌引物及Taqman探针, 构建的布鲁氏菌Taqman荧光PCR检测方法的灵敏度为10²拷贝。李光辉^[8]等以布鲁氏菌编码31 kDa核周质蛋白的BCSP31基因作为靶基因建立了布鲁氏菌Taqman实时荧光定量PCR快速检测方法, 并组装了检测试剂盒, 成为布鲁氏菌病诊断、流行病学调查的有力工具。2010年, 梦茹^[9]等人建立了二重实时荧光定量技术鉴别诊断布鲁氏菌和结核杆菌的方法, 该方法对布鲁氏菌最低检出量为20拷贝, 结核杆菌为50拷贝, 两病原都存在时为100拷贝, 比常规PCR高100倍。利用此方法检测样品的符合率为100%结果证明该试验建立的方法可用于同时检测布鲁氏菌和结核杆菌。高正琴^[10]等建立了运用TaqMan MGB探针检测布鲁氏菌病的实时荧光定量PCR方法。该方法能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA, 最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝, 比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测, 结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本, 而常规PCR只检出37份阳性。Dahouk^[11]等也提出, 实时荧光定量聚合酶链反应可以满足快速、可靠、灵敏、特异、简便和自动化的布鲁氏菌检测系统的迫切需要。

目前, 实时荧光定量PCR方法引物及探针设计困难, 且最佳浓度的确定需要进行长期的摸索。但一旦具备这些条件, 该方法快速, 灵敏度高, 特异性好, 易操作, 重复性好等优势将更好地适用于临床上布鲁氏菌病的早期诊断和流行病学的监测。

环介导等温扩增(LAMP)是一种在近年来有极大发展的核酸扩增技术, LAMP具有便捷和特异性高的特性, 应用于检测家畜的布鲁氏菌病具有十分重要的意义。

马国瑞等^[12]针对布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的4个区域设计6条引物, 建立并优化了布病LAMP检测方法, 为推广基层用LAMP检测布鲁氏菌病提供了一定的理论依据。潘文等^[13]通过试验发现应用LAMP检测布鲁氏菌基因组DNA的敏感度达10 pg, 且与其他常见的细菌无交叉反应。用该方法检测人工污染牛布鲁氏菌的牛奶样品, 检测敏感性达5.2× 10³ CFU/mL; 还可以直接用于动物组织中布鲁氏菌的检测。蔺国珍^[14]等建立的LAMP方法能从奶样和血样中检出6个种的布鲁氏菌病原, 检出最低限度为9 fg/μ L, 较PCR方法高出10倍。许邹亮^[15]等针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条LAMP特异引物, 用染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂, 63 ℃恒温反应60 min, 根据HNB的颜色变化进行结果判定。结果显示, 本方法最低检出限约为17 fg/μ L。Ohtsuki^[16]等利用BCSP31基因序列设计了检测布鲁氏菌的LAMP方法, 可最低检出10 fg基因组的DNA。张利^[17]等将LAMP方法应用于布鲁氏菌的检测, 并将LAMP方法与荧光定量PCR方法进行了比较。证明LAMP方法可以用肉眼直接判定, 成本大幅下降、便捷性明显提高, 而且不需要专用的仪器(普通水浴锅即可), 因此该方法更适合于农村以及偏远山区, 特别适用于布鲁菌病的基层卫生防疫。不过, LAMP方法也存在一定问题, 首先一个突出的问题就是多重扩增比较困难; 其次相比荧光定量PCR更易受到污染, 从而影响结果。

所以, 对于LAMP方法, 我们要做到引物设计严谨, 试验过程严格无菌, 并且选择最佳染料进行结果的观察。

ELISA检测方法是目前普及速度较快的一种检测方法, 该方法优点很多, 包括灵敏性高、特异性好、操作比较简便、酶标仪直接读数可避免主观判断带来的误差等。

1976年Garin— Bastuji^[18]等首次用ELISA检测布鲁氏菌抗体, 并发现其敏感性比SAT要高10~100倍。左玉柱^[19]等将原核表达并纯化的布鲁氏菌外膜蛋白 BP26作为包被抗原, 采用方阵法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度, 进行条件优化, 建立了牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。该方法对其他相关的牛病病原无交叉反应, 其组内和组间的变异系数均小于10%; 用建立的间接 ELISA 方法对100份临床血清样品进行检测, 与IDEXX公司的同类试剂盒比较, 符合率为93%。贾剑峰^[20]等应用研制的针对羊布鲁氏菌O链M抗原的单克隆抗体2D10和牛布鲁氏菌O链A抗原的单克隆抗体4B8, 建立了用于检测人布鲁氏菌抗原的双抗夹心ELISA方法。经检验该方法与大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森氏菌09及鼠伤寒沙门氏菌不发生交叉反应, 与SAT、分离培养的符合率均为100%。王志明^[21]等筛选出3株抗布鲁氏菌的特异性单克隆抗体5C10、4D2和3E4, 利用单抗5C10建立了检测血清中布鲁氏菌抗体的竞争ELISA(cELISA)方法。张辉^[22]等通过对布鲁氏菌粘附素SP41蛋白进行表达、纯化, 以表达重组蛋白为包被抗原, 建立了检测布鲁氏菌病绵羊血清抗体的间接ELISA方法。通过交叉实验、阻断试验、重复性试验表明, 该方法的重复性好、特异性强, 且阳性检出率高于虎红平板实验和试管凝集实验。酶联免疫吸附试验拥有它独特的快速、方便、通量大、成本低、诊断率高等优势, 特别适合大量检测。但同时它也不可避免地存在着一些缺陷, 如存在交叉反应、易出现假阳性、重复性不好、干扰因素较多、对试剂的选择性高、难于同时分析多种病菌等。

胶体金免疫层析技术是将胶体金标记技术、免疫检测技术和蛋白层析技术相结合的以硝酸纤维膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。该技术已成为当前兽医临床诊断动物疫病最简便、快速、敏感特异的免疫学检测技术之一, 有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。

程婷婷等^[23]以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原, 采用金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物质, 制备胶体金免疫层析试纸条。交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应, 且检测结果与琥红平板试验方法的符合率为92%。朱明东^[24]等建立了GICA快速诊断牛布鲁氏菌病的方法, 结果显示:GICA快速诊断牛布鲁氏菌病最佳血清用量为10 μ L, 检测敏感性和特异性分别达到91.3%和97.3%。张付贤^[25]等用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记胶体金技术制作金标垫, 以亲和层析法纯的BP26蛋白作为检测抗原(T线), 建立检测小鼠布鲁菌感染血清的胶体金试纸条, 可成功鉴别牛布鲁菌S19感染和BP26缺失疫苗株YZ2免疫的小鼠。试纸条检测与布鲁菌属同源性较近的几株细菌的阳性血清, 结果无交叉反应, 且敏感性高于虎红平板凝集试验检测方法, 近似于ELISA方法, 准确性同于ELISA方法, 该试纸条具有鉴别布鲁菌病自然感染和疫苗免疫的应用前景。1999年Zagoskina^[26]等又发表了应用胶体金颗粒标记蛋白多糖布鲁氏菌抗原检测特异性抗体的斑点免疫金渗滤法, 该方法可有效检测被布鲁氏菌感染的牛、兔、人血清。2002年Ismail^[27]等建立了胶体金试纸条检测方法, 对分离培养的25份阳性布鲁氏菌血清进行检测, 23份阳性, 2份阴性, 符合率93%。2003年Clavijo^[28]等发表了对比胶体金试纸条与传统血清学方法检测布鲁氏菌病IgM抗体的试验, 结果对感染布鲁氏菌的133份病人血清, SAT试验检测阳性率92%, ELISA检测阳性率为80.5%, 胶体金试纸条检测的阳性率为93.1%。

胶体金免疫层析技术自诞生以来便以其简便、快速、敏感、特异、成本低、无需设备、仪器, 适用范围广, 结果易于观察判断等优点被广泛应用于兽医临床快速检测和现场诊断上, 显示出了巨大的发展潜力和广阔的应用前景。目前, 该技术已成为多领域研究与应用的热点。然而, 当前的免疫胶体金层析技术还有一些不足之处, 如定量问题、质控指标不一、检测的灵敏度有待于提高等。随着该技术的临床应用, 进一步提高免疫胶体金层析试验的敏感性、特异性, 实现多元检测、定量或半定量检测是未来胶体金免疫层析技术发展的方向。

表1

Table.1

表1(Table.1)

表1 检测方法对比 Table.1 Comparison of detection methods 检测方法 Detection methods 检测靶标 Detection target 敏感性 Sensitive 优点 Advantage 缺点 Disadvantage 分子生物学方法 Methods of molecular biology 多重PCR 抗原 略高 应用灵活性强, 可快速检测鉴别多种病原体, 特异, 灵敏 引物设计困难, 易产生副产物, 结果不稳定 实时荧光定量PCR 抗原 较高 快速, 灵敏度高, 特异性好, 易操作, 重复性好 引物及探针设计困难, 且浓度需要摸索 环介导等温扩增技术 抗原 高 快速, 有效, 简便, 成本低, 灵敏度高于普通PCR10~1000倍, 达到或高于荧光定量PCR 试验本身不需要特殊仪器, 但是观察结果需要特殊仪器, 且需对染料进行挑选 免疫学方法 Methods of immunology 酶联免疫吸附试验 抗体 高 适合大量检测, 成本低, 操作简便, 诊断率较高 易出现假阳性, 重复性不好, 干扰因素较多 胶体金免疫层析法 抗原、 抗体 较高 操作简便、快速, 成本低, 操作要求低, 无需设备、仪器, 适用范围广, 结果易于观察判断 定量问题, 灵敏度问题, 存在带现象, 质控指标不一

表1 检测方法对比 Table.1 Comparison of detection methods