2016年冬季福建省多地市相继发生多起疑似病毒性腹泻暴发疫情, 其中3起疫情暴发地所在市疾控中心共送检18份标本, 包括漳州某幼儿园学生病例2份肛拭子、1份呕吐物、1份粪便; 永泰某小学5份发病学生肛拭子、1份粪便; 厦门某幼儿园8份发病学生肛拭子。送检标本均以生理盐水处理成10%悬液, 高速离心后取上清液检测。

2015年中国疾病预防控制中心下发的《诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南》规定, 病毒性腹泻暴发是指7 d内同一学校、托幼机构、医疗机构、养老院、工厂、建筑工地、游轮、社区/村庄等集体单位或场所, 发生20例及以上有流行病学关联的诺如病毒感染病例, 其中至少2例是实验室诊断病例。

病毒核酸提取试剂盒购自天隆公司, 诺如病毒核酸荧光检测试剂盒购自上海之江和江苏硕世公司, 胶回收纯化试剂盒购自QIAGEN公司, 逆转录酶购自Invitrogen公司, Taq DNA聚合酶购自Takara公司, 引物序列由铂尚公司合成, 其他试剂均为分析纯试剂。

1.4.1 病毒RNA提取 取离心后的悬液上清200 μ L, 按照天隆公司的病毒核酸提取试剂盒说明书操作, NP968-S全自动病毒核酸提取仪提取病毒核酸, 吸取核酸置于1.5 mL的离心管, -20 ℃冻存备用。

1.4.2 诺如病毒的检测 按照商品试剂盒说明书采用荧光RT-PCR检测诺如病毒核酸。采用逆转录、多重PCR扩增杯状病毒RNA多聚酶(RdRp)/衣壳蛋白基因片段, 引物组合可同时鉴定诺如病毒(I型和II型)和扎如病毒^[2], 目的片段分别为330 bp、380 bp和435 bp, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.3 基因片段序列测定 为对诺如病毒进行基因亚型鉴定, 采用JV12^[3]/G2SKR引物对扩增诺如病毒多聚酶/衣壳蛋白基因片段, 产物片段为1 110 bp。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定, 阳性产物胶回收纯化后送铂尚公司测序。

1.4.4 序列分析 采用DNAstar软件对扩增产物核苷酸测序结果进行编辑、推导相应的氨基酸序列, 选择本省散发流行地方株及GenBank中收录的参考毒株序列进行分析, 分别针对诺如病毒RNA聚合酶3'端780 bp和衣壳蛋白5'端250 bp核苷酸序列, 采用Mega 6.06版本构建进化树, 选择邻位相连法(Neighbor joining, NJ), bootstrap值设置为1 000次, 核酸替代模型Kimura 2-parameter+G, 比较序列同源性, 分析毒株系统进化特征。

1.4.5 重组分析 采用Simplot软件分析毒株重组位点, 采用200 bp的滑动窗口, 20 bp的滑动步伐。

2016年12月福建省厦门市某幼儿园、漳州市某幼儿园、永泰县某小学分别发 生病毒胃肠炎暴发, 发病例数共计53例(厦门11例、漳州21例、永泰21例), 病例年龄组较小(4~6岁)。发病时间均在48 h内, 临床表现以呕吐为主及不同程度的腹泻和腹痛。这3起暴发疫情均发生于学校, 传播方式为人传人, 发病人群年龄距离较小, 症状较轻以呕吐为主, 无重症和死亡病例。由于疫情早期迅速采取干预措施, 暴发局限于小范围的人群, 未造成大面积扩散。综合流行病学调查和实验室检测结果认为这3起疫情均排除食源性和水源性传播的可能性, 判定为诺如病毒感染引起的人传人聚集性/暴发事件。

送检的18份标本经荧光PCR检测均含GII型诺如病毒核酸; 采用杯状病毒特异分型引物进行扩增, 产物经琼脂糖凝胶电泳分析, 15份标本在380 bp处有特异条带, 判定为诺如病毒GII型(表1)。

表1

Tab.1

表1(Tab.1)

表1 暴发性胃肠炎标本诺如病毒检测结果 Tab.1 Detection results of norovirus collected from viral gastroenteritis outbreaks 来源 source 送检数量 number 送检发生时间 date of inspection 荧光PCR检测结果 results of real time RT-PCR RT-PCR检测结果 results of RT-PCR 厦门 Xiamen 8 2017-1-6 8/8 NV GII(+) 7/8 NV GII(+) 漳州 Zhangzhou 4 2016-12-27 4/4 NV GII(+) 4/4NV GII(+) 永泰 Yongtai 6 2016-12-30 6/6 NV GII(+) 4/6NV GII(+)

表1 暴发性胃肠炎标本诺如病毒检测结果 Tab.1 Detection results of norovirus collected from viral gastroenteritis outbreaks

对阳性标本核苷酸进行测序, 有9份成功测序, NCBI在线提交测序结果进行同源性比对搜索, 结果表明为诺如病毒核苷酸序列片段。

在线软件(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)证实^[4]本轮暴发毒株为诺如病毒重组株GII.P16/GII.2, 毒株间序列高度同源, 相似性介于96.9%~100%暴发毒株的RNA聚合酶核苷酸序列与2016年日本的GII.4悉尼变异株Kawasaki194毒株的同源性最高, 达98%, 属GII.P16; 而衣壳蛋白与2008 年比利时IPH2161-08VG06毒株同源性最高(97.7%-98.8%), 属GII.2。比对分析本轮暴发毒株与我省散发流行毒株, 我省流行的诺如病毒以GII型为主(图1-2)。2016年哨点监测结果表明福建省诺如病毒散发毒株主要为GII.4、GII.6和 GII.3, 仍以2012 Sydney变异株GII.Pe/GII.4为优势流行型别, 并检测到GII.17型, 未检测到GII.2型。采用Simplot软件分析毒株重组位点, 位于ORF1/ORF2交界处735-737bp处(图3)。

图1

Fig.1

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	图1 诺如病毒衣壳蛋白核苷酸片段进化分析(250 bp)Fig.1 Phylogenetic analyses based on partial VP1 genes of norovirus (250 bp)

图2

Fig.2

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	图2 诺如病毒RNA聚合酶核苷酸片段进化分析(780 bp)Fig.2 Phylogenetic analyses based on partial RNA polymerase genes of norovirus (780 bp)

图3

Fig.3

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	图3 Simplot 分析2016年诺如病毒GII.P16/GII.2重组株Fig.3 Simplot analyses of the NoV recombinant GII.P16/GII.2 detected in 2016