引用本文
方文, 李天美, 李婷, 陈绍荣, 刘榆华, 罗家军. (2017).肝片形吸虫囊蚴抵抗力观察[J]. 中国人兽共患病学报, 33(9): 809-813
FANG Wen, LI Tian-mei, LI Ting, CHEN Shao-rong, LIU Yu-hua, LUO Jia-jun. (2017).Resistance on Fasciola hepatica metacercariae [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 33(9): 809-813
doi:10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.011  
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中国人兽共患病学报
肝片形吸虫囊蚴抵抗力观察
方文, 李天美, 李婷, 陈绍荣, 刘榆华, 罗家军
云南省大理州血吸虫病防治研究所,大理 671000;

Email:fangwenee@126.com

摘要

目的 观察肝片形吸虫囊蚴经加热、干燥、食用调料等处理后的存活情况。方法 将肝片形吸虫囊蚴经1)加热:微波高火30 s、60 s;沸水10、30 s和1、2、3 min。 2)干燥:室温下自然干燥24、40 h。3)食源调料:蒜汁、酱油、醋以及3种等量混合液浸泡10、20、30 min;38°白酒及饱和盐水各浸泡10、20、30 min。 4)4 ℃下保存10个月。结果 2种加热方式处理后囊蚴全部死亡;放置于玻片上的囊蚴干燥24 h,死亡4只,附着于叶片上的囊蚴干燥40 h,死亡2只;在蒜汁、酱油、醋中浸泡10、20、30 min,囊蚴全部存活;在3种调料的等量混合液、饱和盐水及38°白酒中浸泡10、20、30 min后,均有部分存活,另有一部分囊蚴结构清晰但虫体不动,但也无明显死囊蚴的特征;在4 ℃下保存10个月,仍有存活的囊蚴。结论 常用的调料对囊蚴不起作用,自然干燥1~2 d不能完全杀灭囊蚴,在低温潮湿环境中可较长时间保持活力。沸水加热10 s或微波高火30 s即可杀死囊蚴。

关键词: 肝片形吸虫囊蚴; 温度; 调料; 抵抗力
中图分类号:R373.2 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2017)09-0809-05
Resistance on Fasciola hepatica metacercariae
FANG Wen, LI Tian-mei, LI Ting, CHEN Shao-rong, LIU Yu-hua, LUO Jia-jun
Dali Prefectural Institute of Research and Control on Schistosomiasis, Dali 671000, China
Abstract

We observed the survival situation after treatments of Fasciola hepatica metacercariae by heating, drying and food seasoning. Results showed that after treating with microwave high fire and boiling water, all the metacercariae died. There were four metacercariae died after putting on the slide and dried them for 24 hours, while two died after attaching on the blade for 40 hours.The metacercariae all survived in the garlic, soy sauce, and vinegar liquid for 10, 20 and 30 min; After 10, 20 and 30 min soaking in the same amount of mixed liquor of the three kinds of condiments, saturated brine and the liquor of 38°, part of the metacercariae were survival. The rest of the metacercariae showed clear structures, but the bodies did not move with no obvious characteristic of death of metacercariae. Storing for 4 ℃ in the next 10 months, there was still the survival of metacercariae. In conclusion, the commonly used seasoning had no effect on metacercariae. Natural drying for 1-2 days could not completely kill the metacercariae. A low temperature for a long time could maintain vitality. Heating via boiling water for 10 sec or microwave high fire for 30 s could kill metacercariae.

Keyword: Fasciola hepatica; metacercariae; temperature; seasoning; resistance

片形吸虫病是一种人兽共患寄生虫病, 以往认为主要是牛、羊等家畜的疾病, 只可偶尔感染人体[1, 2]。但2011年11月至2012年2月, 云南宾川暴发26例大片形吸虫感染[3, 4], 此事件警醒人们:片形吸虫病是与人们的饮食卫生习惯密切相关的、危害严重的食源性(植物源性)寄生虫病。由于食源性寄生虫病的传播和流行是与人们不良的行为方式有关, 因此, 预防感染的关键是开展健康教育活动, 向人们宣传、普及卫生知识, 改变不利于健康的生活方式和饮食、卫生习惯, 从而提高人们的防病意识和自我保护能力[5, 6]。肝片形吸虫病是因食入含有活的肝片形吸虫囊蚴的水生植物等而感染, 引起的损害主要表现在两个方面:一是童虫经小肠、腹腔进入并在肝内移行时造成机械性损伤和化学性刺激, 引起肝组织的炎症反应及肝脓疡, 出现急性症状如高热、腹痛、荨麻疹、肝肿大及血中嗜酸性粒细胞增多等; 二是成虫进入胆管后引起胆管炎症、胆管上皮增生及胆管周围的纤维化[7]。但是, 有关片形吸虫囊蚴对我们日常生活中常见的物理和化学因素的抵抗力的实验研究较少, 本实验通过对肝片形吸虫囊蚴经加热、干燥以及食用调料等处理后, 观察其存活情况, 以指导人们采取正确的烹饪方式, 预防该病的发生。

1 材料与方法
1.1 肝片形吸虫囊蚴的培养

肝片形吸虫虫卵的收集、孵化等参照本室的方法[8]进行, 中间宿主为本实验室饲养的二代小土蜗。虫卵孵育至第15天已有大量毛蚴孵出, 用吸管将毛蚴吸出于烧杯中, 直接倒入养螺盆, 进行随机感染, 连续6 d, 每次感染的毛蚴数量约600~800条。小土蜗喂食干馒头(馒头掰碎、晒干, 酌情加入), 每d用去氯水更换养螺水, 记录水温。感染40 d后, 在养螺盆水面放置鱼腥草叶片和保鲜膜片(裁成大小为2.5× 2 cm), 用来收集囊蚴。

1.2 实验方法

每项实验各取10~20只附着于叶片或保鲜膜上的囊蚴:1)经微波高火30 s、1 min后, 立即将叶片或膜投入冷水中, 以免受高温持续影响; 2) 将盛水的烧杯置于电炉上烧开(当地海拔1 976 km, 水的沸点为95 ℃左右), 用镊子夹住叶片浸入沸水中, 分别经10 s、30 s、1 min、2 min、3 min后取出, 随即放入冷水中; 3) 室内自然干燥:将囊蚴从保鲜膜上取下置于玻片上, 待玻片上的水分蒸发后开始计时24 h; 取附着有囊蚴的叶片, 待叶片表面上的水分蒸发后开始计时, 40 h后置于蒸馏水中, 24 h内在镜下反复观察; 4) 将囊蚴浸泡于饱和盐水(水温24 ℃, 浓度约33%)、38° 白酒、食用醋、酱油(含盐量15%~20%)、蒜汁及3种调料的等量混合液中, 浸泡时间分别为10 min、20 min、30 min, 作用时间到后立即取出叶片或膜, 用蒸馏水反复清洗, 直至清洗液无色、无味, 再放入蒸馏水中, 24 h内镜下反复观察。5) 将囊蚴置于4 ℃下保存10个月, 观察囊蚴的存活情况。

1.3 囊蚴死活判定

实验终止后, 均将最外层囊壁即第一层囊壁去掉, 主要观察第二、三层囊壁及其内幼虫(即后尾蚴)的变化。死囊蚴:囊蚴变黑; 结构不清晰; 囊蚴呈圆形或不呈正圆形、幼虫与囊壁间出现明显空隙、幼虫肠盲管结构模糊不清、排泄囊变黑, 并在24 h内多次观察其内的幼虫仍收缩不动等, 均判定囊蚴死亡。实验终止后, 24 h内反复观察, 囊蚴内幼虫的肠盲管和排泄囊形态清晰, 可活动, 即判定为活囊蚴。

2 结 果

感染期间水温为23~27 ℃, 平均25 ℃, 感染后第44 d检获囊蚴。4只小土蜗感染成功, 持续24 d逸出尾蚴并结成囊蚴。

2.1 温度对囊蚴的作用

2.1.1 微波高火30 s和1 min 两组实验各做了2次, 每次各10只囊蚴。结果囊蚴(图2)的变化一致, 即囊蚴颜色变浅、第二层囊壁变薄, 后尾蚴收缩并与囊壁间空隙加大, 呈月牙形, 最宽处约有10 μ m, 幼虫的肠盲管模糊不清, 排泄囊变成黑色一团, 其上有数十颗如葡萄串样的屈光颗粒, 左右对称。随后将观察过的囊蚴放入蒸馏水中保存, 24 h内4~6次吸出反复观察均未发现幼虫活动, 形态与初次观察的结果一致, 未发生改变。

图1 正常囊蚴Fig.1 Metacercaria

图2 微波30 sFig.2 Microwave for 30 s

图3 沸水10 sFig.3 Boiling water for 10 s

2.1.2 沸水10、30 s和1、2、3 min 5组实验各做了2次, 每次各取10只囊蚴, 试验结果相似(图3):囊蚴外形变化不大, 颜色呈黑褐色, 第二层囊壁变薄, 幼虫收缩与囊壁间出现空隙呈月牙形, 在口吸盘对端出现明显的凹陷, 如大脑沟回样。肠管结构消失或呈絮状, 左右两侧的排泄囊呈黑褐色, 其上有数十颗如葡萄串样的屈光颗粒。在随后的24 h 内4~6次反复观察:囊蚴形态均未发生改变, 也未发现幼虫运动。另外, 还观察到一个现象, 即实验所用的囊蚴均是附着在折耳根叶子上, 浸泡于沸水中经不同时间后取出, 所有囊蚴仍附着在叶上, 无一脱落在沸水里。

2.1.3 室内自然干燥 实验期间室温在22~24 ℃之间, 自然干燥、避免阳光直晒。干燥24 h的结果(图4):共有10只囊蚴, 其中4只发黑, 虫体结构不清晰; 6只形态、颜色、结构与正常囊蚴基本一致, 第二层囊壁略呈波浪状, 未发现虫体运动; 保持囊蚴湿润2 h、5 h后再观察, 结果如前; 但17 h后观察形态未发生改变中的4只可见虫体运动。

图4 干燥24 hFig.4 Drying for 24 h

叶片上干燥40 h, 此时叶片尚未完全干枯、略软, 取下囊蚴置玻片上观察, 2只变黑, 虫体结构不清; 8只形态正常, 但未见虫体运动; 保持囊蚴湿润, 5 h后再观察, 可见形态正常中的5只, 其内的虫体可动。随后, 将形态正常的8只囊蚴依次放入人工消化液(38 ℃, 3.5 h)及75%牛胆汁(38 ℃, 1.5 h)中, 孵出1条后尾蚴(图5)。

图5 后尾蚴Fig.5 Excited metacercariae

2.1.4 各种调料作用后囊蚴的变化情况 使用日常生活中常用的调料:醋、酱油、蒜汁及3种的等量混合液, 以及38° 白酒和饱和盐水, 作用时间各为10、20和30 min。结果详见表1。

表1 调料对肝片形吸虫囊蚴的影响 Tab.1 Effect of seasonings on F. hepatica metacercariae

2.1.5 冷藏保存 因醋、酱油和蒜汁作用过的囊蚴, 除了经醋30 min浸泡过的有4只未发现幼虫运动外, 其余全部能活动, 因此各收集于小烧杯中加蒸馏水, 保存于4 ℃下, 10个月后取出观察, 共观察27只囊蚴:所有囊蚴囊壁结构清晰, 而幼虫结构模糊不清的有8只(如图6), 幼虫结构清晰的有13只, 其中1只仍可运动(图7); 另有6只囊蚴因烧杯中水分干涸了约2~3周, 加入蒸馏水1 h后观察, 6只的外形正常, 内部结构清晰和不清晰各有3只, 结构清晰的未发现虫体运动。

图6 4 ℃下保存10个月, 结构不清Fig.6 Storing for 10 months at 4 ℃, unclear structure

图7 4 ℃下保存10个月, 幼虫可运动Fig.7 Storing for 10 months at 4 ℃, larval movement

3 讨 论

本次所完成的肝片形吸虫囊蚴抵抗力实验, 是模拟大理地区人们日常生活中经常使用的烹调方法和生活卫生习惯。由于人体感染肝片形吸虫是食入含活的囊蚴的水生植物等蔬菜而致, 这类蔬菜常用来做成凉拌菜, 调料主要是醋、酱油、蒜等, 一般是将佐料调配好后浇在洗净切好的菜上, 现拌现吃。本实验采取用上述调料分别浸泡10、20、30 min , 结果表明这些调料单一和混合都起不到杀灭囊蚴的作用。另外, 人们认为盐水和酒可以杀灭寄生虫卵等微生物, 即将蔬菜清洗干净后, 用盐水浸泡, 或者是在进食时以酒佐餐。本次实验采用浓盐水(33%氯化钠溶液)、15%~20%氯化钠溶液(即为酱油)和38° 白酒分别浸泡10、20、30 min , 结果显示盐水和白酒也不能完全杀灭囊蚴。虽然在饱和盐水中浸泡20和30 min后, 可观察到能活动的囊蚴较少, 但其内的幼虫结构并未破坏, 由于未做动物感染实验, 因此这样的囊蚴是否具有感染性尚不得而知。据吴德孚报道[9], 将囊蚴浸泡于6%氯化钠溶液中6 h, 对囊蚴的平均杀灭率为72.1%, 但是一般用盐水浸泡蔬果的时间不会超过20 min。因此, 无论是低、中、高浓度的盐水均不能杀灭囊蚴。

干燥实验采用两种方式, 一是将囊蚴吸出于玻片上, 室温(22~24 ℃)下自然干燥24 h; 另一种方法是模拟人们常用的蔬菜保存方式, 即将蔬菜储存于室内阴凉处1~2 d或更长时间后食用, 遂将附着有囊蚴的叶片置室温下自然干燥40 h。前者明确死亡的囊蚴有4只, 后者为2只, 表明两种方式也不能完全杀灭囊蚴。据报道[10], 在温度20 ℃和相对湿度为98、75、52、33%的环境下, 肝片形吸虫囊蚴保持感染的时间分别为7、7、4、2个月。由于叶子对囊蚴具有保湿作用, 这就意味着, 在成梱、成堆的蔬菜中, 囊蚴存活的时间会更长。

4 ℃水中保存10个月, 囊蚴形态正常的占59.26%(16/27), 且其中1只囊蚴仍可运动, 表明囊蚴在低温潮湿的环境中可较长时间保持活力。

但是在高温下, 即微波高火30 s或沸水10 s及以上, 囊蚴的形态即可发生明显改变:虫体收缩、肠管结构消失或呈絮状, 排泄囊呈黑褐色。在作用结束后24 h内反复观察, 均未发现虫体运动且形态如初, 表明囊蚴不耐高温。由于本实验只用单张叶片进行实验观察, 若在实际烹饪中, 应延长加热时间, 使所有蔬菜均匀受热, 以防止感染。另外, 附着在叶片上的囊蚴浸泡于沸水中不会脱落在水里, 因此尽管沸水10 s即可杀死囊蚴, 但是如果是吃火锅涮菜时, 安全起见还是要延长加热时间。

总之, 本次实验结果表明, 肝片形吸虫囊蚴对日常生活中使用的调料:醋、酱油、蒜汁、盐, 甚至是白酒均不敏感; 室温下自然干燥1~2 d也不能完全杀灭; 低温(4 ℃)潮湿下 , 可长时间保持活力; 但囊蚴对高温敏感, 微波高火30 s和沸水10 s, 即可杀死。

The authors have declared that no competing interests exist.

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