结膜吸吮线虫基因组中分泌蛋白的规模预测及分析
郑明辉1, 叶昌林2, 张露菲1, 江楠1, 贺莉芳3, 刘晖1
1.遵义医学院,基础医学院,遵义 563003
2.遵义市公安局新蒲分局,遵义 563003
3.黔南民族医学院高等专科学校,都匀 558000
通讯作者:刘 晖,Email: liuhui6032@sina.com
摘要

目的 在对结膜吸吮线虫基因组数据进行注释的基础上对其中分泌蛋白进行规模预测及分析。方法 联合应用 SignalP、TMHMM、MEME、Protcomp、big-PI Predictor和 SecretomeP 等多种生物信息学软件进行分析,完成了结膜吸吮线虫分泌蛋白组的预测,对其进行 GO 功能富集、KEGG 通路分析、结构域统计以及具有抗原性分泌蛋白预测等分析。结果 结膜吸吮线虫含有约 259个分泌蛋白,其长度多集中在 100-700 aa ;GO 功能分析发现这些分泌蛋白多富集在分泌途径及宿主互作中;KEGG 分析显示分泌蛋白在药物及谷胱甘肽代谢中发挥着重要作用;候选分泌蛋白的结构域分析发现存在最多为糖水解酶结构域;大规模筛选预测到 126 个分泌蛋白具有B细胞表位抗原性的功能。结论 结膜吸吮线虫分泌蛋白多为小型蛋白,推测这些蛋白可能参与糖代谢、抗氧化活性,协助虫体的入侵及其在宿主体内的寄生。

关键词: 结膜吸吮线虫; 分泌蛋白组; 分泌蛋白; 糖代谢
中图分类号:R383.1 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)01-0012-06
Prediction and analysis for secretory proteins from Thelazia callipaeda at Genome Scale
ZHENG Ming-hui1, YE Chang-lin2, ZHANG Lu-fei1, JIANG Nan1, HE Li-fang3, LIU Hui1
1. School of Basic Medicine, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, China
2. Xinpu District Public Security Sub-Bureau, Zunyi Municipal Public Security Bureau, Zunyi 563003, China
3. Qiannan Medical College For Nationalities, Duyun 558000, China
Corresponding author: Liu Hui, Email:liuhui6032@sina.com
Abstract

We conducted prediction and analysis for secretory proteins from Thelazia callipaeda at Genome Scale based on the previous full genome annotation. The software SignalP, TMHMM, big-PI Predictor, MEME, Protcomp and SecretomeP were combined to process the prediction of the secretome of Thelazia callipaeda. The analyses of secretory proteins by GO function enrichment, KEGG pathway, and statistics of domains were performed. Results showed that totally 259 secretory proteins were found in Thelazia callipaeda genome and the amino acid lengths of secretory proteins were mainly concentrated between 100 to 700 aa exclusively. GO function analysis of secretory proteins indicated that they were enriched in the secreting pathways and in the interactions with host. The results of KEGG metabolism secretory proteins suggested that some of them contributed to drug metabolism and glutathione metabolism. And domain analysis suggested that most of them were glycoside hydrolase, contributing to sugar metabolism. Around 126 secretory proteins had antigenicity of B-cell epitope. In summary, we found that secretory proteins in Thelazia callipaeda were most small proteins, which were involved in sugar metabolism and antioxidative activity, facilitating Thelazia callipaeda to invade the hosts and play a key role in the parasitic course.

Key words: Thelazia callipaeda; secretome; secretory protein; sugar metabolism

结膜吸吮线虫(Thelazia callipaeda Railliet and Henry, 1910)[1], 由于其专性寄生于眼部且在亚洲(中国, 印度和日本等)最早被发现, 故又被称为“ 东方眼虫 (Oriental Eye-worm)” , 但结膜吸吮线虫病却没有引起更多临床医生和学者的足够重视。由于其中间宿主冈田绕眼果蝇(Amiota okadai)的分布较为广泛, 猫、犬等家畜传染源又难以得到有效的控制, 加之社会经济的发展及城镇化加速使得结膜吸吮线虫病的防控面临许多新的挑战。随着英国WTSI对包括结膜吸吮线虫在内的50种寄生线虫基因组测序(50-Helminth Genomes)计划的完成, 相关的研究也进入到分子生物学层面, 同时这些研究也将推进病原线虫与宿主互作机制的研究。

寄生虫侵袭宿主成功的重要的标志往往伴随着一系列向宿主释放的蛋白, 并且这些蛋白发挥了重要作用。分泌蛋白( Secretory proteins)是生物体在细胞内合成并分泌到胞外发挥功能的一类蛋白的总称, 且其在许多病理生理过程如生长发育、信号转导中起到了重要作用[2]:如日本血吸虫分泌蛋白中最大的家族是热激蛋白HSP70, HSP90等, 其在宿主-寄生虫的免疫调节中发挥重要作用[3]; 而曼氏血吸虫尾蚴的排泄分泌蛋白抗原则能够在局部皮肤诱导IL-1受体拮抗因子(IL-Ira)来抑制皮肤炎症反应[4]。近年来测序的普及, 尤其是WTSI的“ 50-Helminth Genomes” 计划, 其分泌蛋白组也通过生物信息学预测或实验的方式迅速获得。如Fosunyarko等[5]通过对植物寄生线虫Pratylenchus zeae转录测序的方法鉴定了一系列与其取食位点相关的分泌蛋白类致病因子。寄生虫的分泌蛋白多和其分泌排泄物直接相关, 因此对分泌排泄物中组学的研究也获得了大量有重要功能的分泌蛋白, 特别是蠕虫中排泄分泌抗原的分析:Yatsuda 等[6]在捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)分泌蛋白研究中鉴定到107种蛋白, 其中就包括与亲环素类抗原有较高相似度的新型蛋白分子。

近年来结膜吸吮线虫的局部流行不容忽视。虽然其基因组测序已完成, 但功能基因组研究尚未展开, 更是无分泌蛋白方面的研究报道。结膜吸吮线虫作为一种眼部寄生虫, 由于分子基础研究仍很薄弱, 使得其与宿主之间的分子互作研究也难以深入。因此为了从分子生物学层面研究分泌蛋白在结膜吸吮线虫与宿主互作中的重要作用, 首先从全基因组水平获得其中具有抗原性的分泌蛋白十分必要。本文正是基于前期对结膜吸吮线虫基因组数据进行注释的基础上, 针对分泌蛋白使用标准生物信息学预测流程, 对其中的分泌蛋白进行重新预测和定义。综合使用SignalP等多种生物信息学分析软件在组学水平上进行大规模筛选, 进一步通过提取信息以及结构域数目统计, 完成结膜吸吮线虫中分泌蛋白的 GO 功能富集、KEGG通路以及结构域分析, 其结果有望为下一步靶向性开展结膜吸吮线虫中分泌蛋白的功能研究以及进一步基于分泌蛋白的寄生虫-宿主互作的分子机制提供借鉴。

1 材料与方法
1.1 材料

结膜吸吮线虫(雄性)的基因组序列来源于NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Thelazia+callipaeda+)。其蛋白序列下载自对其基因组预测的蛋白文件。采用blast-2.2.30+进行本地BLAST(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov)、SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、在线软件如, big-PI Predictor(http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html)、 MEME(http://meme-suite.org/)、ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan& group=programs& subgroup=proloc)、SecretomeP 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/)。

1.2 方法

1.2.1 候选分泌蛋白筛选 筛选标准为 ①具有信号肽; ②无GPI锚定位点; ③无跨膜结构域; 本文联合了 SignalP[7]、TMHMM[8]、big-PI Predictor[9]和 Protcomp 等几种软件对结膜吸吮线虫分泌蛋白的预测[10](图1)。对经典分泌蛋白信号肽和跨膜结构域的大规模筛选使用了 SignalP 及 TMHMM两个软件完成, 为了避免预测错误并保持预测敏感性, 软件D值采用了系统默认。此外选用真核生物模型、其他参数默认。随后使用big-PI Predictor 软件对既具有信号肽又含有跨膜结构域(0 或 1)的氨基酸序列的GPI 锚定位点进行预测。最后, 使用 Protcomp 软件对预测蛋白的亚细胞进行定位。经过前述4步筛选、预测得到蛋白基本可认为是经典分泌蛋白。而对于结膜吸吮线虫中无信号肽非经典分泌蛋白的预测, 本文使用SecretomeP 2.0 软件[11]进行筛选(不含信号肽, SecP ≥ 0.5)。

图1 结膜吸吮线虫分泌蛋白组预测分析流程Fig.1 Flow show of analysis and prediction the secretory protein in Thelazia callipaeda

1.2.2 GO功能富集及KEGG通路分析 1)对分泌蛋白的氨基酸序列的GO功能分析采用 Blast2GO进行, 并利用Fisher模型进行计算。2)对分泌蛋白的KEGG 代谢通路进行富集分析。首先构建本地化BLAST平台。然后使用BioEdit (7.2.6)软件将结膜吸吮线虫数据库格式化。使用blastp模式(E-value=10)将分泌蛋白序列比对到结膜吸吮线虫数据库中。然后, 使用KOBAS软件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)对blast比对结果进行 KEGG通路的差异分析。最后, 通过程序筛选相关信息, 并进行差异倍数计算。通过自编的Python程序提取、统计以及大规模筛选相关信息, 从而完成寄生过程相关的分泌蛋白预测, 并进行结构域的筛选统计。

1.2.3 原位(in vivo)表达谱验证 结膜吸吮线虫分泌蛋白原位表达谱整合自结膜吸吮线虫不同发育阶段差异基因表达谱的研究, 将本文中所得分泌蛋白通过差异基因表达谱进行验证, 进一步确定候选分泌蛋白的原位表达情况。

2 结 果
2.1 结膜吸吮线虫中分泌蛋白的预测

通过前期研究中从头预测结合同源预测的方法在结膜吸吮线虫基因组中共获得6 333个基因, 其中包含了5 186个蛋白。使用方法中的生物信息学流程, 最终在结膜吸吮线虫基因组中找到了259个分泌蛋白(图1)。随后对这些蛋白的氨基酸数目进行统计, 结果表明多数的分泌蛋白长度集中在100-700aa(图2), 占经分泌蛋白总量的 92.66%。进一步利用拟合指数(R2=0.4)对数据分析, 结果显示伴随着蛋白长度的增加, 其蛋白数目越来越少。由此推测, 结膜吸吮线虫中大多数的分泌蛋白质属于小型蛋白, 所含氨基酸数目一般较少。采用Protcomp软件对其中不具有GPI脂锚定位点的蛋白进行亚细胞定位预测, 结果表明其中186个蛋白分泌到胞外, 其余73个蛋白不分泌到胞外(图3)。这些不分泌到胞外的蛋白中, 大都转运到细胞质膜(8%)、细胞质(6%)、内质网(5%)、线粒体(5%)和溶酶体(2%)。另外, 分泌到高尔基体、细胞核、液泡的分泌蛋白占2%。

图2 结膜吸吮线虫中分泌蛋白氨基酸长度分析Fig.2 Analysis of amino acid length of secretory protein in Thelazia callipaeda

图3 结膜吸吮线虫中不具 GPI 脂锚定位点的蛋白质亚细胞定位预测Fig.3 Prediction of location in subcellular of Thelazia callipaeda proteins without GPI

2.2 分泌蛋白功能注释结果

对候选的259个结膜吸吮线虫分泌蛋白序列使用 Blast2GO软件进行 GO 功能分析, 并利用 Fisher 模型进行计算(结膜吸吮线虫基因组作为背景值)。功能富集发现上述蛋白可以被归到几大类酶系中, 其中分布最多的是水解酶(Hydrolases)(图 4), 这说明在本研究中使用的雄性成虫水解酶的活性显著。通过GO功能富集分析发现刺激响应(GO:0050896)的条目(Term)下显著富集了一些分泌蛋白, 其中为显著的两个条目是单生物代谢过程(GO:0044699)和代谢过程(GO:0008152)。为了完成经典分泌蛋白的 KEGG 通路分析, 我们通过BLAST将分泌蛋白序列比对到线虫数据库中(Wormbase)。然后利用在线软件KOBAS对数据进行分析, 得到这些分泌蛋白KEGG 通路的差异富集。其中主要包括信号转导、蛋白质修饰、碳水化合物运输和药物代谢等(图 5 )。由此可知, 在结膜吸吮线虫和宿主互作过程中分泌蛋白很可能发挥了着重要的作用。这一结论也可以通过其KEGG过程的功能富集来支持, 我们发现分泌蛋白中涉及的糖类代谢相关途径多数发生了显著变化:比如, 淀粉与蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)、半乳糖代谢(galactose metabolism)、戊糖和糖醛酸转化途径(pentose and glucuronate interconversions)及 一些 多 糖 的 降 解(other glycan degradation)等途径(图 5)。这也与本研究中发现分泌蛋白中存在种类多样且数量较多的糖基水解酶结构域的结论相吻合。

图4 结膜吸吮线虫中分泌蛋白中的主要酶类Fig.4 Major kinds of enzyme in Thelazia callipaeda secretory proteins

图5 经典分泌蛋白差异 KEGG 通路分析Fig.5 Analysis of different KEGG pathway of classical secretory proteins
* P-value ≤ 0.05 ; * * P-value ≤ 0.01

由于结膜吸吮线虫寄生在宿主过程中可以持续较长时间, 因此需要较多的能量, 而能量获取显得对结膜吸吮线虫的生存极为重要。测序结果也表明结膜吸吮线虫许多分泌蛋白参与到糖代谢途径中, 为结膜吸吮线虫侵袭宿主及长期的寄生生活提供能量。除基本能量代谢途径外, 许多分泌蛋白还参与到了药物代谢及谷胱甘肽代谢途径, 并且这两个途径发生了显著变化(图 5)。综上, 这都表明结膜吸吮线虫分泌蛋白参与糖代谢途径及对宿主中产生的外源有害物质的代谢可能是其成功侵袭寄主的一个重要机制。

2.3 部分结膜吸吮线虫分泌蛋白具有抗原性

对结膜吸吮线虫基因组的注释分析共找到259个分泌蛋白, 通过DNASTAR软件中的Protean模块预测分析其细胞抗原表位[12], 本研究共发现156个分泌蛋白可能具有较高的抗原性, 其中包括许多参与异源物代谢中的关键酶, 如谷胱甘肽-S-转移酶(Gultathione S transferase), 硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin Peroxidase)等, 其中半胱氨酸[13]则是通过免疫印迹分析发现在华支睾吸虫中重要的抗原候选分子之一。

2.4 结膜吸吮线虫分泌蛋白序列中保守结构域及功能结构域分析

通过MEME软件对结膜吸吮线虫基因组数据中259个分泌蛋白的保守结构域进行分析和信息统计(表1)。统计结果表明, 259个分泌蛋白中有30个存在保守的功能结构域, 其中8个分泌蛋白还具有两个或两个以上的结构域。这些结构域统计结果见表2:其中数目最多的结构域为AT/CCACCA。其次为 AAGCAGC/T、ACTGATAA/T以及AG/CTGG/CTA。另外通过对259个分泌蛋白中所有结构域的筛选, 发现含有的糖基水解酶家族的相关结构域最多, 约占结构域总数的 20%(82个)。

2.5 假定分泌蛋白原位(in vivo)表达情况

本文整合了国家自然科学基金项目(81560336)中结膜吸吮线虫不同发育阶段的原位差异表达谱数据, 从中获得了 356 个结膜吸吮线虫分泌蛋白unigene。通过与这些原位表达的数据进行比对、统计发现, 154 个候选分泌蛋白中的在差异基因表达谱中被检测到, 占所有预测分泌蛋白数的59%(图 6)。In vivo结膜吸吮线虫原位表达谱数据中表达的 356个分泌蛋白; LSPs:本实验预测得到的 259 个经典分泌蛋白。

表1 结膜吸吮线虫分泌蛋白结构域数目 Tab.1 Number of domain in Thelazia callipaeda secretory proteins
表2 结膜吸吮线虫分泌蛋白序列中共有的保守域模体及数目 Tab.2 Conserved Domains in Thelazia callipaeda secretory proteins

图6 结膜吸吮线虫分泌蛋白的原位(in vivo)表达情况Fig.6 In vivo expression of Thelazia callipaeda secretory proteins

3 讨 论

结膜吸吮线虫基因组成功测序及序列发布为其分泌蛋白研究提供了重要的数据参考。目前已知寄生线虫分泌蛋白与其能否寄生成功有密切关系。因此, 在基因组水平研究结膜吸吮线虫的分泌蛋白特点, 将有助于从分子层面了解其致病过程的概况。本文使用的结膜吸吮线虫为雄性成虫, 虽然已经完成了其基因组序列的组装, 但是并没有对其中的基因结构、基因功能做出分析。而目前完成测序的许多寄生虫基因组中, 很多已经首先完成了分泌蛋白及其抗原性的分析, 比如血吸虫[14]、肝片吸虫[15]、钩虫[16]等。由此可见, 在和健康密切相关的寄生虫中分泌蛋白普遍存在, 并且和其寄生过程密切相关。

通过生物信息学方法, 在结膜吸吮线虫中最终获得了259个分泌蛋白。通过对其氨基酸数目的统计, 发现大多数的分泌蛋白长度集中于100~700aa, 属于小型蛋白。另外, 功能富集分析发现, 分泌蛋白在结膜吸吮线虫-宿主互作过程中可能起着非常重要的作用。由于在许多已知寄生线虫研究中发现的分泌蛋白也多为小型蛋白。由此推测, 正是因为结膜吸吮线虫中分泌蛋白多为小型蛋白, 所以其结构较为简单, 因此更加方便其在与宿主的互作中发挥作用。依据预测的蛋白功能, 推测这些蛋白可能参与:①抗氧化活性; ②协助虫体的入侵及在宿主体内的移行。

另外, 在我们对结膜吸吮线虫的不同发育阶段差异基因表达谱实验研究中发现:本文预测的189个分泌蛋白在不同的发育阶段有差异表达, 这更是有力的证据证明结膜吸吮线虫寄生宿主过程中, 分泌蛋白可能发挥着极其重要的作用。本文的研究发现, 结膜吸吮线虫分泌蛋白的主要组分之一是脂肪酸结合蛋白, 其他蛋白组份还包含剪接体、 RNA 运输体等。此外参与氨基酸降解的蛋白也占很大比例, 这表明这些蛋白分子在宿主-寄生虫的免疫调节中发挥重要作用。众所周知, 抗原刺激是宿主免疫应答产生、维持及调控的重要始动因素之一。往往不同来源的虫体都含有特异性抗原成分, 因而引起的宿主免疫应答机制和结果也不完全相同。而其中最受关注的是可与宿主免疫系统直接接触的抗原, 如虫体的排泄/分泌抗原, 像在肝片吸虫中发现的具有候选药物靶标性的组织蛋白酶L和华支睾吸虫中的半胱氨酸蛋白。除了免疫学方面的关注外, 还发现血吸虫在小鼠体内寄生时免疫反应产生的一些分子可以促进小鼠自身的生长发育[17]。因此, 采用生物信息学技术大规模分离筛选虫体的分泌蛋白及其表达谱, 可为鉴定可能与诱导宿主免疫应答、免疫调节、免疫逃避等相关的重要抗原分子提供信息, 是了解结膜吸吮线虫与宿主之间的免疫学相互适应的重要途径之一。文中鉴定的其他分泌蛋白还有氨肽酶、烯醇酶等。这些蛋白主要是由一些与结膜吸吮线虫生命代谢、生长发育、免疫调控相关的蛋白组成, 其中硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶是高丰度的分泌蛋白。此外, 还在数据库中鉴定到2种免疫调节相关的蛋白。

作为一种能够在较长时间(2-3年)内寄生在宿主眼部的寄生线虫, 结膜吸吮线虫如何逃避宿主免疫效应、其自身能量代谢过程及如何利用宿主成分这些问题的阐明就显得十分重要。虽然分泌蛋白具有水解一些蛋白类成分的功能的研究已经不少, 但结膜吸吮线虫分泌蛋白在糖代谢途径中的作用却所知甚少。文中通过KEGG 富集分析, 分泌蛋白大量参与了淀粉、蔗糖、半乳糖、戊糖和糖醛酸等多条代谢转化途径以及其他多糖的降解等途径, 且这些代谢发生了显著变化。此外, 本文还发现分泌蛋白中占优势的结构域为糖基水解酶结构域, 这也从另一方面佐证了众多的分泌蛋白参与到糖代谢途径当中, 为结膜吸吮线虫提供所需的能量从而在其入侵及长期寄生的过程发挥作用。

位于N端的信号肽引导核糖体到达内质网从而完成多肽的合成, 因此是分泌蛋白重要特征。而现实中除了经典分泌蛋白, 在动植物中还普遍存在一种不含信号肽的分泌蛋白, 如人的内质网、高尔基体中就存在大量不具有信号肽的蛋白质。虽然目前有学者在寄生虫中鉴定到了一些不具有信号肽的非经典分泌蛋白[18, 19], 但有关研究依然较少。本文通过对结膜吸吮线虫基因中分泌蛋白的全面预测, 鉴定了许多非经典分泌蛋白, 同时结合其表达谱数据更加确定了这些潜在的非经典分泌蛋白。因此, 这些非经典分泌蛋白的生物学意义将随着结膜吸吮线虫基因组及分泌蛋白组的研究的不断加深, 非经典分泌蛋白的功能也会得到很好的诠释。

4 结 论

本研究通过标准的生物信息学分析流程, 第一次系统预测并分析了结膜吸吮线虫基因组中的全部分泌蛋白, 共找到259个分泌蛋白。进一步通过大规模数据分析的方法预测了这些分泌蛋白功能, 结果发现其在结膜吸吮线虫与宿主互作过程中可能起到了重要的作用, 如维持自身生长的能量代谢过程。结合结构域的分析结果, 发现最多的结构域为糖水解酶结构域, 从而佐证了结膜吸吮线虫分泌蛋白在能量代谢中发挥着重要作用这一推测。此外, 还发现这些分泌蛋白中近半数(49%)具有抗原性, 也进一步证实了其在与宿主互作中的重要功能。

The authors have declared that no competing interests exist.

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