Chinese 1型弓形虫在终宿主家猫肠内发育的研究
祝子伏, 董辉, 苏瑞景, 陆瑶瑶, 王梦瑶, 杨玉荣
河南农业大学牧医工程学院兽医病理教研室, 郑州 450000
通讯作者:杨玉荣, Email: yangyu7712@sina.com
摘要

目的 观察研究TgCatCHn4( Chinese 1)株弓形虫在猫回肠上皮细胞发育过程中的虫体形态特点,对小鼠RH株弓形虫急性感染期的病理变化和虫体分布进行探讨。方法 复制弓形虫感染的终末宿主和中间宿主模型,采用石蜡切片H&E染色和IHC染色方法。结果 家猫摄入弓形虫包囊后,可成功排泄弓形虫卵囊(3DPI~10DPI)。回肠病理变化主要表现为吸收细胞脱落和固有层淋巴细胞的坏死,可观察到弓形虫在回肠上皮裂殖生殖和配子生殖各阶段虫体的形态。RH株弓形虫感染的小鼠病理损伤主要表现为肝脏、脾脏和淋巴结的局灶性坏死,坏死灶分布多量速殖子,虫体多以花瓣状、簇状分布。结论 详细探讨了弓形虫感染猫和小鼠后的虫体形态学和对机体的病理损伤特点,为弓形虫在终末宿主和中间宿主的病理诊断和入侵机制研究提供参考依据。

关键词: 弓形虫; RH株; TgCatCHn4株; ; 小鼠; 虫体形态; 病理损伤
中图分类号:R382.5 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)10-0883-05
Research of the development of Chinese 1 strain Toxoplasma gondii in intestinal epithelial cells of cat
ZHU Zi-fu, DONG Hui, SU Rui-jing, LU Yao-yao, WANG Meng-yao, YANG Yu-rong
College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450000, China
Corresponding author:Yang Yu-rong, Email: yangyu7712@sina.com
Abstract

Definitive host and intermediate host of Toxoplasma gondii infection were replicated in this study. The morphology of TgCatCHn4 ( Chinese 1) strains T. gondii development in cat ilem epithelial cells was observed by paraffin section, Hematoxylin-Eosin staining and immunohistochemistry methods. The pathological lesions and the distribution of T. gondii tachyzoites in mice were observed during acute toxoplasmosis induced by RH strains T. gondii.Results showed that after domestic cat ingested cysts of T. gondii, oocysts were shed successfully at 3-10 d post inoculation. Desquamation of absorptive cells and lymphocytes necrosis in lamina propria were observed in jejunum of cat. Multiplicative reproduction of schizonts and gametes of T. gondii were found in the ilem epithelial cells. Multiple focal necroses were observed in liver, spleen and mesenteric lymph nodes of mice induced by RH strains T. gondii. A large number of T. gondii tachyzoites were grew in necrotic lesions. The tachyzoites were crowed together and arranged petal shaped. The lesions induced by T. gondii in cat model and mice model were discussed in this paper, also focus the morphology of T. gondii tachyzoites, schizonts and gametes, this results provide the reference base for pathological diagnosis and invasion mechanism research in definitive host and intermediate hosts.

Key words: Toxoplasma gondii; RH strains; TgCatCHn4 strain; cat; mouse; morphology; lesion

弓形虫是一种食源性和水源性的人兽共患寄生虫, 可以感染几乎所有的恒温动物[1]。中国和全世界分别约有8 %和30 %的人患有弓形虫病[1, 2], 多数健康人感染弓形虫时没有临床症状, 但对孕妇和免疫功能低下的患者有严重危害[3]。猫科动物是弓形虫的终末宿主, 猫科动物摄入含有活性的弓形虫包囊的肉类食物时, 包囊在猫消化道内经酸性胃蛋白酶作用释放出缓殖子入侵到小肠上皮细胞, 形成裂殖体进行无性生殖和雌、雄配子体进行有性生殖, 可排出数百万个的弓形虫卵囊, 污染水源和土壤, 并且可在自然条件下存活数年, 对人类及其它动物造成危害[4, 5]。流行病学研究发现, 我国弓形虫以Chinese 1(ToxoDB#9)型为主[6], 但其在猫体内的生殖过程尚未见报道。典型的弓形虫基因分型包括3个型, Ⅱ 和Ⅲ 型的致病性较弱, Ⅰ 型虫株毒力最强, 可以在感染后4~15 d引起小鼠急性死亡[7]。本研究选用TgCatCHn4(Chinese 1)株弓形虫的包囊和RH株(Ⅰ 型, ToxoDB#3)弓形虫的速殖子分别感染家猫和Balb/c小鼠, 观察弓形虫在家猫回肠上皮细胞的有性生殖和无性生殖过程的虫体形态、小鼠主要脏器的病理损伤特点及速殖子形态, 以期为弓形虫在终末宿主和中间宿主的病理诊断和入侵机制研究提供参考依据。

1 材料与方法
1.1 弓形虫虫株和抗体

弓形虫RH株受赠于兰州兽医研究所朱兴全教授, TgCatCHn4分离于猫组织[8], 由河南农业大学兽医病理实验室小鼠传代保存。兔抗弓形虫多克隆抗体由美国农业部Dubey实验室馈赠, 小鼠Specific HRP/DAB(ABC)Detection IHC kit 购自abcam公司(货号: ab64264), 按照使用说明书进行操作。

1.2 试验动物及处理

弓形虫检测为阴性的3月龄猫1只, 饲喂感染TgCatCHn4虫株小鼠的大脑和肌肉组织, 每日收集猫粪便, 糖漂法检查粪便中的卵囊[1]。猫在感染TgCatCHn4虫株后10 d(Days Post Inoculation, DPI)时安乐死, 取猫回肠制作组织涂片, 回肠固定于10%的福尔马林溶液中。

选用20只弓形虫检测阴性的雌性性成熟的Balb/c小鼠 (购于河南省实验动物中心)。将小鼠随机分为2组(感染组和对照组, 每组10只小鼠)。小鼠自由采食清洁级饲料, 饮用灭菌水。感染组小鼠每只分别腹腔感染弓形虫RH株1× 105速殖子, 0.2 mL/只。对照组小鼠每只分别腹腔注射灭菌生理盐水, 0.2 mL/只。每日观察并记录小鼠临床症状及死亡情况。对感染组死亡的小鼠和对照组小鼠分别采集肠系膜淋巴结、脾脏和肝脏固定于10%的福尔马林溶液中。

1.3 试验方法

固定的组织运用常规病理学技术制作石蜡切片, 采用苏木素与伊红对比染色法(Hematoxylin-Eosin staining, H& E)观察小鼠各器官和猫回肠的病理损伤及弓形虫发育中各阶段的虫体形态。对小鼠肠系膜淋巴结及猫回肠运用免疫组织化学方法(Immunohistochemistry, IHC)染色, 观察弓形虫虫体的分布。

2 结 果
2.1 猫和小鼠感染弓形虫的临床症状

0~10 DPI, 感染TgCatCHn4株弓形虫的猫, 未见明显异常的临床表现。每日检查猫粪便中的卵囊发现, 3 DPI, 粪便出现弓形虫卵囊; 之后卵囊数量逐渐增多, 6~9 DPI, 卵囊数量均较多; 10 DPI, 摘取新鲜的猫回肠组织。

每日观察感染弓形虫RH株小鼠的精神状况、食欲、饮水和被毛等临床症状。3~4 DPI, 小鼠精神沉郁、喜卧, 采食和饮水量下降。6~9 DPI, 小鼠无采食, 弓背, 呼吸急促、被毛逆立, 100%小鼠死亡, 摘取实验组死亡小鼠和对照组小鼠(9DPI)的肠系膜淋巴结、脾脏和肝脏。

2.2 感染弓形虫猫回肠的病理学变化及虫体形态

眼观, 猫感染TgCatCHn4株弓形虫包囊后, 回肠未见明显异常变化。

显微镜下, 猫粪便可见大量未孢子化的弓形虫卵囊, 大小约11 μ m× 13 μ m(图1A)。回肠黏膜涂片可见肠道上皮细胞、细长的弓形虫裂殖子(6.1 μ m× 1.5 μ m)和未孢子化的弓形虫卵囊(图1B)。病理组织学检查可见回肠肠绒毛顶端凸凹不平, 少量吸收上皮细胞脱落, 绒毛顶端固有层细胞稀疏, 未见明显炎症反应, 细胞浸润和局部血液循环障碍。回肠固有层可见大量弓形虫抗体反应阳性抗原(图1C), 肠绒毛游离端的吸收上皮细胞内可见大量弓形虫裂殖体和大配子(也称雌配子)(图1 D)。

在回肠的肠绒毛中可观察到密集分布的弓形虫, 其中包括无性生殖阶段的裂殖体和有性生殖阶段的配殖体。缓殖子黏附并入侵到肠上皮细胞中, 形成含有多个裂殖子的裂殖体, 裂殖体破裂后, 裂殖子散出可以入侵其它的肠上皮细胞而进行反复裂殖生殖。部分裂殖子侵入上皮细胞发育成配子体, 成熟后大配子与小配子接触受精形成合子进而发育为卵囊, 感染的肠道上皮细胞破裂并释放出尚未孢子化的卵囊随粪便排出体外, 排出后可以在肠绒毛中观察到排出卵囊后剩下的空泡样结构。

本研究中观察到弓形虫在回肠绒毛中各增殖阶段的虫体, 主要分布于肠吸收细胞的细胞核和刷状缘之间, 也有一部分虫体位于固有层, 虫体周围可见透亮的纳虫泡结构(图1D~G)。A型裂殖体, 以单个裂殖子分布于固有层, 横断面直径约2.1 μ m(图1D); B型裂殖体, 多位于吸收细胞细胞浆的纳虫泡或固有层淋巴细胞内, 大小约26 μ m× 17 μ m, 裂殖子呈簇状分布(n=4), 大小约5.8 μ m× 2.9 μ m, 吸收细胞细胞核因受虫体挤压而变形(图1D); C型裂殖体, 多位于吸收细胞细胞或上皮内淋巴细胞, 大小约16 μ m× 10 μ m, 裂殖子因以出芽方式生长常以圆环状分布(n=18)(图1F); D型裂殖体, 多位于吸收细胞或上皮内淋巴细胞, 大小约7.3 μ m× 5.6 μ m, 可见残余体, 裂殖子以花瓣状紧密排列(n=16)(图1E); E型裂殖体, 大小约12 μ m× 8.8 μ m, 残余体消失, 裂殖子以蜂窝状松散分布(图1E)。配子体较大, 大小约20 μ m× 15 μ m, 位于吸收细胞内, 含中央核仁和核仁周围的大量嗜碱性物质(图1G)。小配子(也称雄配子)由小配子体发育而来, 较裂殖子小, 雄配子大小约4.0 μ m× 0.7 μ m(n=16), 围绕中央残体形成雄配子体, 组织学切片未见雄配子尾部的鞭毛(图1H)。大配子由大配子体发育而成, 大小约10.0 μ m× 4.2 μ m, 含中央核仁和大量的嗜酸性的极线, 与雄配子受精形成合子进而发育为卵囊。卵囊呈椭圆形, 嗜酸性, 着色较淡, 大小约7 μ m× 8 μ m(图1-I、J)。

图1 猫感染TgCatCHn1株弓形虫包囊后回肠黏膜虫体形态和卵囊涂片, 10DPI
A:猫粪便未孢子化的弓形虫卵囊(箭头), 未染色; B:回肠黏膜细胞涂片的裂殖子(粗线箭头)和未孢子化的卵囊(细线箭头), 未染色; C:回肠的弓形虫虫体(箭头), IHC染色; D:回肠弓形虫裂殖体A型(Schizont A, SCa)、B型(SCb)、D型(SCd), HE染色; E:回肠弓形虫裂殖体D型(SCd)、E型(SCe), HE染色; F:回肠弓形虫裂殖体C型(SCc)呈花瓣状, HE染色; G:回肠弓形虫配子体(Gamont, ga), HE染色; H:回肠弓形虫小配子(Microgamete, mi) 和裂殖体D型(SCd), HE染色; I:回肠弓形虫大配子(Macrogamete, ma)和卵囊(Oocyst, oo), HE染色; J:回肠弓形虫大配子(ma)和配子体(ga), HE染色。标尺=50 μ m。
Fig.1 Morphology of Toxoplasma gondii in histological section or smear of ileum of cat, ten days post inoculation with strain of T.gondii TgCatCHn1

2.3 感染弓形虫小鼠的病理学变化及虫体分布

眼观, 感染弓形虫RH株急性死亡的小鼠肠系膜淋巴结形象明显, 高度肿大, 质地软, 颜色乳白色; 肺脏肿大、淤血, 颜色暗红; 脾脏高度肿大, 颜色暗红, 质脆; 肝脏淤血, 肿大, 质脆; 肾上腺明显肿大, 颜色灰白色。

显微镜下, 图2肠系膜淋巴结和脾脏的损伤较为严重, 表现为实质细胞的大量坏死。弓形虫侵入肝脏, 形成多处局灶性坏死灶。肝细胞发生颗粒变性或水泡变性, 肝细胞肿大, 细胞索排列紊乱, 窦状隙变窄。弓形虫位于肝细胞内, 并在其中繁殖, 肝细胞核靠边、变形, 有的导致肝细胞肿胀、破裂、坏死。被寄生的肝细胞可见纳虫泡及多个速殖子(1~10个)的断面, 多个断面聚集一组, 呈簇状分布于纳虫泡内。速殖子嗜酸性, 呈深红色, 断面呈圆形或橄榄球形, 略小于红细胞, 大小约2 μ m× 4 μ m, 速殖子周围可见呈圆形的纳虫泡, 纳虫泡区域H& E染色下未着色。弓形虫引起的坏死区域常见蛋白样网络结构, 未见明显炎性细胞浸润。中央静脉及汇管区小叶间静脉周围可见速殖子。

图2 BALB/c小鼠感染RH株弓形虫后肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结的病理变化及速殖子的分布
A:脾脏坏死灶内分布大量弓形虫速殖子, 多个速殖子聚集呈簇状或花瓣状排列(箭头), HE染色; B:肝脏局部分布多量弓形虫虫体(箭头), HE染色; C:肠系膜淋巴结坏死, 分布多量弓形虫速殖子(箭头), HE染色; D:肠系膜淋巴结的弓形虫(箭头), IHC染色。标尺=50 μ m。
Fig.2 Pathological lesions and the distribution of T. gondii tachyzoites in liver, spleen and mesenteric lymph nodes of BALB/c mice

脾脏被膜下可见含大量弓形虫速殖子的巨噬细胞; 白髓局灶性坏死, 坏死中心可见分布成组的速殖子, 速殖子排列呈簇状或花瓣状; 小梁坏死、溶解, 红髓淡染, 分布多量速殖子。红髓巨噬细胞内有大量呈蜂窝状、花瓣状分布的速殖子, 数量约10~20个。少量单个的速殖子分布于细胞外。网状细胞增生, 未见其他炎性细胞浸润。

肠系膜淋巴结可见多处局限性坏死灶, 坏死灶内淋巴细胞大量坏死, 细胞间分布多量水肿液, 有的部位只残留网状结构。坏死灶内可见大量的速殖子分布, 呈花瓣状或圆环状, 数量约4~15个。嗜中性粒细胞、巨噬细胞和上皮样细胞浸润。IHC染色可见, 弓形虫聚集成团分布于细胞内, 单个弓形虫多分布于细胞间。

3 讨 论

弓形虫是一种专性细胞内寄生虫, 几乎能寄生在所有有核细胞中[1]。弓形虫病之所以能广泛流行主要依赖于:广泛的宿主谱, 终末宿主单次感染弓形虫包囊可排泄数百个对环境有抵抗能力的弓形虫卵囊[4]。摄入未充分煮熟的含弓形虫包囊的肉类, 食入被弓形虫卵囊污染的蔬菜、水果和水以及经胎盘垂直传播是人和动物感染弓形虫的主要途径[1]。认识和了解弓形虫缓殖子在猫肠道内的分裂生殖和卵囊的形成过程, 有利于预防弓形虫病和切断弓形虫的传播途径。

我国尚无有关对猫肠道弓形虫无性生殖和有性生殖的虫体形态学和虫体分布位置的研究报道, 有报道PRU虫株缓殖子可感染体外培养的猫肠上皮细胞, 但未见到弓形虫的有性生殖阶段[9]。本试验选用TgCatCHn4(Chinese 1)株弓形虫组织包囊感染猫, 观察到的弓形虫裂殖体、裂殖子、雌雄配子和卵囊的大小和形态, 与Dubey报道一致[1, 10]。Dubey研究发现猫感染有缺陷的T-263弓形虫虫株包囊, 其可在猫肠道内进行无性裂殖生殖, 并形成雌雄配子, 但不能形成卵囊, 可望成为猫弓形虫疫苗的候选虫株[10]。弓形虫缓殖子进入中间宿主只能分化为速殖子, 然而进入终末宿主确可分化为裂殖子、缓殖子和速殖子, 其产生分化差异的机制尚不清晰。研究发现分裂过程的裂殖子表达的表面蛋白(Surface proteins, SRS)与速殖子不同, 可能与裂殖子适应肠道微环境和后期有性生殖有关[11]。本课题在以往研究弓形虫卵囊排出过程发现, 感染后21 d, 猫回肠上皮恢复正常形态, 少见裂殖子和卵囊, 推测裂殖子的增殖并非持续性的。

不同基因型的弓形虫虫株有着不同的毒力, 表现为对不同的宿主的致病性差异[1]。强毒株弓形虫感染常引起小鼠在急性感染期死亡, 尚未形成组织包囊, 而弱毒株感染的小鼠多无临床症状, 多可进入慢性期感染期, 形成组织包囊。体内和体外的致病性研究发现, TgCatHn4是一株弱毒株, 小鼠灌胃感染105个弓形虫卵囊的生存期超过60 d, 也难以检测到组织包囊, 病理损伤几乎观察不到[8]。而RH株弓形虫是Ⅰ 型的强毒株, 有报道腹腔接种103个速殖子可以引起小鼠急性期死亡[12]。王莉发现肝脏和脾脏白髓出现了凝固性坏死, 坏死灶及其附近有弓形虫速殖子聚集[13], 与本试验结果一致。本研究还发现脾脏被膜下及红髓分布的弓形虫速殖子数量远多于白髓, 可能与腹腔感染途径有关。李永念观察到肝细胞的变性、坏死和大量炎性细胞浸润[14], 但本研究未观察到大量炎性细胞浸润。由于早期发表文献年代久远, 病理变化和虫体形态的图片不清, 所以本研究对小鼠感染RH弓形虫急性感染期的病理变化和虫体形态进行展示。研究结果发现, 弓形虫感染后主要引起组织细胞坏死, 坏死处分布多量速殖子, 虫体形态与Dubey报道一致[1]

该研究填补了我国ToxoDB#9弓形虫虫株在终末宿主生殖过程的形态学研究空白, 展示了小鼠感染RH株弓形虫的主要器官病理学变化和在器官中速殖子簇状分布的形态特点。清晰了解弓形虫各增殖阶段(速殖子和裂殖子, 包囊和卵囊)的生物学功能、形态学和分子标记, 对于探讨弓形虫的致病机理, 从终末宿主角度切断弓形虫的传播途径非常重要。

The authors have declared that no competing interests exist.

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