弓形虫感染对THP-1巨噬细胞极化影响的研究
刘学雷1, 王云杰1, 杨宁爱1, 安童童1, 康宇婷1, 贾伟2,3, 苏雅静3, 赵志军2,3
1.宁夏医科大学临床医学院, 银川 750004
2.宁夏医科大学总医院医学实验中心, 银川 750004
3.宁夏临床病原微生物重点实验室, 银川 750004
通讯作者:赵志军,Email:z15815z@163.com
摘要

目的 探讨弓形虫感染对体外诱导的人外周血单核细胞(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)极化特点的影响。方法 用佛波酯(PMA)诱导THP-148 h使之由悬浮的单核细胞诱导为贴壁的巨噬细胞,体外选择不同时间点感染弓形虫,用Diff染色分析弓形虫在细胞内的增殖情况。Western blot检测极化相关蛋白,Q-PCR检测mRNA的表达情况。结果 成功诱导得到贴壁的巨噬细胞模型,感染弓形虫后,M1型巨噬细胞标志性蛋白iNOS 及M2型巨噬细胞标志型蛋白Arg-1 36 h表达量与对照组差异明显( t=10.23, P<0.05)。Q-PCR的结果显示不同的处理组IL-1、IL-12、iNOS和TNF-α逐渐减少,而IL-10、Arg-1呈逐渐增加,到36 h达到顶峰( t=9.587, P<0.05)。结论 弓形虫RH株感染THP-1巨噬细胞后可以在胞内生长增殖,THP-1细胞感染后向M2型巨噬细胞方向极化。

关键词: THP-1; 弓形虫感染; 巨噬细胞极化
中图分类号:R382.5 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)10-0902-06
Effects of the polarization of the macrophage differentiated from THP-1 which infected with Toxoplasma gondii
LIU Xue-lei1, WANG Yun-jie1, YANG Ning-ai1, AN Tong-tong1, KANG Yu-ting1, JIA Wei2,3, SU Ya-jing3, ZHAO Zhi-jun2,3
1. College of Clinical Medical, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China
2. Laboratory Medicine Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China
3. Ningxia Key Laboratory of Clinical and Pathogenic Microbiology, Yinchuan 750004, China
Corresponding author: Zhao Zhi-jun, Email: z15815z@163.com
Abstract

To explore the effect of the polarization of the macrophage differentiated from THP-1 which infected with Toxoplasma gondii, monocytes (THP-1) suspended in the culture medium were induced by phorbol ester (PMA) for 48 h to differentiate into adherent macrophages. In vitro experiment at different T. gondii infection time course and the protozoan proliferation rate was studied by using Diff staining. Western blot and Q-PCR were used to detect the expression level of polarization-related proteins and mRNA. The protein expression level of iNOS in M1 macrophage was significantly lower than that in the control group, and the expression of M2 protein Arg-1 was the highest expressed with the highest level at 36 h. Results of Q-PCR showed that the mRNA expression of IL-1, IL-12, iNOS and TNF-α in different treatment groups gradually decreased, but IL-10 and Arg-1 gradually increased and peaked at 36 h ( t=9.587, P<0.05). T. gondii can proliferate in the macrophages differentiated from THP-1 cells. After T. gondii infection, it will polarize towards M2 macrophages.

Key words: human acute monocytic leukemia cell line; Toxoplasma gondii infection; macrophage polarization

弓形虫是一种专性的胞内寄生虫, 能导致严重弓形虫病, 在世界的不同地理区域有大量的人口感染弓形虫, 在免疫抑制或者怀孕的妇女会产生严重的后果, 例如:流产、产后的畸形以及新生儿的死亡[1, 2]。巨噬细胞是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要细胞模型, 当受到外界环境诸多病原体刺激时表型和功能会发生变化, 这种现象称为巨噬细胞极化[3]。巨噬细胞极化主要分为M1型和M2型, M1型主要分泌促炎因子, M2型主要分泌抑制炎症的因子[4, 5]。弓形虫作为一种严格的细胞内寄生虫, 可侵入所有的哺乳动物的有核细胞。巨噬细胞是人体内重要的免疫细胞, RH株弓形虫感染后会引起巨噬细胞的免疫应答。巨噬细胞作为一种免疫细胞应起到控制弓形虫感染与增殖的作用, 但是有文献已经报道弓形虫可感染大鼠的巨噬细胞并且在内部增殖[6, 7]。弓形虫是否利用巨噬细胞极化而实现感染与增殖很值得我们探究。

本研究拟使用人单核细胞系THP-1经佛波酯(PMA)诱导后分化为M0型巨噬细胞, M0型巨噬细胞表达的蛋白偏向M1型巨噬细胞, 这种巨噬细胞模型在国内外已经应用普遍, 因此运用THP-1的细胞模型来研究弓形虫对巨噬细胞的极化是可行的[8, 9]。通过Diff染色、Western blot、Q-PCR等方法研究弓形虫感染THP-1细胞后极化相关蛋白和基因的表达情况。探究弓形虫RH株感染对THP-1巨噬细胞极化的影响。

1 材料与方法
1.1 材料

弓形虫RH株为本实验室保存的; THP-1单核细胞系购自中国科学院上海细胞生物研究所; 佛波酯(PMA)购自索莱宝公司; 胎牛血清购自BI公司; 培养基1640购自GIBCO公司; Trizol购自ambion公司; 反转录试剂盒购自Thermo公司; 荧光定量PCR试剂购自Roche公司; 兔抗人诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体、兔抗人精氨酸酶-1(Arginase-1)抗体、HPR标记山羊抗兔IgG(IgG-HRP)购自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 THP-1细胞复苏以后, 37 ℃、5%CO2的培养箱培养, 使用含有10%胎牛血清的1640培养基培养细胞, 1∶ 3进行传代。

1.2.2 THP-1细胞的诱导 THP-1细胞接种于10 cm培养皿内, 每皿细胞约4× 106个。PMA的浓度保持在100 ng/mL。37℃、5%CO2培养箱培养48 h诱导THP-1细胞为贴壁的巨噬细胞。

1.2.3 弓形虫传代 弓形虫从液氮取出后于37 ℃水浴快速融化, 取250 μ L注入小鼠腹腔内。当小鼠出现蜷缩、背部毛发炸起、腹部膨胀后无痛断颈处死小鼠。用酒精擦拭腹部皮肤, 剪开长约1 cm的腹部皮肤, 吸取PBS注入小鼠腹腔内轻柔腹部使PBS混匀, 然后从中吸取100 μ L注入健康小鼠腹腔内完成第一次弓形虫的传代。传代3次后弓形虫毒力稳定可用于后续实验。

1.2.4 THP-1细胞感染 弓形虫传到3代以后从第四代开始可用于感染。无痛断颈处死发病小鼠, 75%酒精擦拭腹部皮肤, 眼科剪剪开长约1 cm的腹部皮肤, 注射PBS 5mL, 轻柔腹部, 混匀后抽出含有弓形虫的PBS。1 000 r/min, 离心5 min, 弃上清, 加1640冲悬混匀, 计数。THP-1细胞与弓形虫1∶ 1感染。未加弓形虫的作为对照组, 感染弓形虫的设1 h、12 h、18 h、24 h、36 h组, 用于后续实验。

1.2.5 细胞爬片与Diff染色 收集含有THP-1细胞悬液, 800 r/min, 离心5 min; 弃上清, 加2 mL 1640冲悬混匀, 计数。细胞数为1× 106/孔接种于6孔板内 。每孔加10 μ g/mL的 PMA 20 μ L, 使浓度保持在100 ng/mL。诱导48 h后感染弓形虫。然后根据设的不同时间取出爬片, 晾干, 固定, Diff染液A液染30 s后PBS冲洗晾干, B液染15 s后去离子水冲洗晾干。

1.2.6 LPS刺激THP-1细胞 THP-1细胞接种于10 cm细胞培养皿内, 每皿细胞约4× 106个, THP-1经PMA刺激48 h分化为巨噬细胞, LPS浓度分别为10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1000 ng/mL刺激巨噬细胞24 h, 收集细胞, 提取蛋白。Western blot法检测iNOS和Arg-1表达情况。

1.2.7 蛋白免疫印迹 Western blot法检测THP-1细胞感染弓形虫后iNOS和Arg-1蛋白的表达情况 收集长在10 cm皿内的对照组、1 h、12 h、18 h、24 h、36 h的细胞(种植、诱导, 感染的方法同前), 提取总蛋白。采用BCA法检测蛋白的浓度。进行10%SDS-PAGE电泳、转模、以及封闭, 分别用兔抗人iNOS和Arg-1(1∶ 2 000)以及兔抗人β -actin抗体(1∶ 2 000)在4 ℃孵育过夜, 二抗孵育(山羊抗兔多克隆IgG抗体, 工作液1∶ 5 000)2 h, 发光液显色后, 凝胶成像系统观察结果。

1.2.8 极化相关因子mRNA表达水平的检测 通过Trizol 法提取细胞的总 RNA, TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA, 通过 SYBR Green 荧光定量 PCR 测定不同时间点细胞中 iNOS 、 Arginase-1等 mRNA 水平表达情况。以 β -actin 作为内参基因, 相对定量使用的方法是 2-Δ Δ Ct。所用引物见表 1

表1 本研究中所用到的引物序列 Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.9 统计学分析 q-PCR数据采用均数± 标准差( x¯± s)表示, 试验重复3次。用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析, 两组数据均数比较采用t检验, 以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 弓形虫体外感染THP-1巨噬细胞

采用Diff染色并在显微镜下观察弓形虫在细胞内的增殖情况。THP-1细胞感染弓形虫以后, 1 h弓形虫已经进入到细胞内, 到18 h细胞内的弓形虫明显增值且感染细胞的数量也增多。24 h感染细胞明显增多且有少部分虫体已破细胞而出, 36 h细胞基本被破坏且虫体都破细胞而出, 仅有少数有细胞形态的细胞残存(图1)。

图1 PMA诱导后在不同时间点感染弓形虫的情况(Diff染色× 1000)^ (A为经PMA诱导后正常的巨噬细胞:B、C、D、E、F分别为感染弓形虫1 h、12 h、16 h、24 h、36 h后的巨噬细胞。红色箭头指示弓形虫)Fig.1 Toxoplasma gondii infection at different time points following PMA induction (Diff staining× 1 000)

2.2 极化相关因子蛋白表达水平的检测

PMA诱导后感染弓形虫以并收集 1 h、12 h、18 h、24 h、36 h蛋白。Western blot检测蛋白的iNOS和Arg-1蛋白的表达情况, 发现与对照组比较, 随着时间的增加iNOS逐渐减少, 36 h表达量最低。Arg-1在对照组、1 h、12 h无表达, 18 h有少量表达, 36 h Arg-1表达量明显高于其他组, 同时检测了不同浓度的LPS对巨噬细胞iNOS和Arg-1表达量的影响。结果显示Arg-1无表达, LPS浓度为100 ng/mL时iNOS的表达量最高(图2、图3)。

图2 PMA诱导组在不同感染时间点下蛋白的表达水平Fig.2 Protein expression level in PMA-induced group at different time points of infection

图3 不同浓度LPS对蛋白表达水平的影响Fig.3 Effect of different concentrations of LPS on protein expression

2.3 极化相关因子 mRNA 表达水平的检测

检测不同时间点M1极化标志因子IL-1、IL-12、TNF-α 和iNOS mRNA以及M2极化标志因子IL-10、TGF-β 、MIP-1和Arg-1 mRNA的相对表达量。PMA诱导并感染后M1极化相关因子随着时间的与对照组相比逐渐降低, 36 h表达量与对照组比较降低最明显(t=3.313, P< 0.05)。M2极化相关因子IL-10和Arg-1的表达量逐渐增加, 到36 h表达量明显高于其他组(t=9.587, P< 0.05)。q-PCR和Werstern Blot的趋势一致(图4)。

图4 PMA诱导后M1型和M2型相关因子mRNA的表达水平^(* :P< 0.05与对照组比较, n=3)。Fig.4 Expression levels of M1 and M2-related factor mRNAs after PMA induction

3 讨 论

根据弓形虫对小鼠的致病力, 将其分为高致病力(如Ⅰ 型)和低致病力(Ⅱ 型和Ⅲ 型)虫株[10], 不同虫株感染宿主后引起的免疫反应也会不同。研究表明弓形虫巨噬细胞系, Ⅰ (RH株、SH株等)和Ⅲ 型主要通过释放棒状体激酶ROP16激活STAT6信号通路, 巨噬细胞向M2方向极化, Ⅱ (ME49、QH株等)型主要通过释放致密颗粒抗原GRA15激活NF-κ β 通路使巨噬细胞向M1方向极化[1, 11]。M1型巨噬细胞会释放iNOS(一氧化氮合成酶), M2型巨噬细胞则释放Arg-1(精氨酸酶Ⅰ )。iNOS和Arg-1都可以利用精氨酸分别产生NO和尿素。NO对弓形虫的生长具有杀伤抑制作用, 而弓形虫可以利用尿素产生多胺类物质为自身的增殖提供营养。iNOS和Arg-1分别作为M1和M2型巨噬细胞的标志性蛋白。Zhao等人发现大鼠肺泡巨噬细胞在感染弓形虫RH株后, 高表达Arg-1[12]。弓形虫RH株在感染小鼠骨髓源性巨噬细胞后发现蛋白Arg-1低表达, iNOS高表达[13]

本实验用弓形虫RH株感染经人类THP-1巨噬细胞模型后发现, Arg-1的表达量在对照组和1 h和12 h时无表达, 36 h表达量明显高于其他时间点, 而iNOS的表达量呈逐渐降低的趋势, 36 h表达量明显低于其他组。弓形虫RH株通过分泌ROP16调控宿主与巨噬细胞极化相关的信号通路基因表达, 使巨噬细胞向M2方向极化, 减少iNOS的生成, 降低NO对自身的抑制和杀伤作用, 增加多胺类物质的生成为弓形虫增殖提供物质条件。THP-1体外感染弓形虫RH株, Diff染色的结果我们发现弓形虫在1 h和12 h细胞内的虫体数量较少, 24 h细胞内的虫体数量明显增多, 36 h细胞大多数被破坏, 弓形虫破膜而出。

通过对相关mRNA表达量检测的结果发现M1型巨噬细分泌的IL-1、IL-12、TNF-α 等促炎因子的表达量明显降低, M2型巨噬细胞分泌的IL-10、MIP-1等促炎因子表达量逐渐增加。弓形虫RH株感染后可以通过减少巨噬细胞IL-1、IL-12、TNF-α 等促炎因子的产生, 降低炎症对弓形虫增殖的抑制作用。IL-12可刺激并且激活T细胞, 促使Th0细胞向Th1细胞分化, Th1细胞可以增强吞噬细胞介导的抗感染免疫, 特别是胞内病原菌的感染。弓形虫通过调控IL-12基因的低表达, 使IL-12因子生成减少以此降低宿主细胞对弓形虫的免疫杀伤作用。IL-10又称细胞因子生成抑制因子(CSIF), 已有研究表明IL-10可以抑制TNF-α 的生成从而在抑制炎症的发生和免疫平衡方面发挥重要作用[14]。M2型巨噬细胞分泌的MIP-1作为参与组织损伤修复的因子在弓形虫感染后表达量明显高于对照组, 表明弓形虫感染后会是巨噬细胞向M2型极化。有研究表明TGF-β 可以起到抑制胞内杀伤弓形虫速殖子的作用[15]。TGF-β 作为一种抑制炎症发生和加强组织修复的因子, 巨噬细胞感染弓形虫以后发现1 h mRNA的表达量高于对照组, 在感染早期弓形虫会促进TGF-β 的高表达。Q-PCR的结果证明了弓形虫RH株感染巨噬细胞后会抑制M1型相关因子mRNA的表达, 促进M2型相关因子mRNA高表达。Q-PCR检测iNOS和Arg-1 mRNA的表达量和WesternBlot结果一致。弓形虫RH株会导致巨噬细胞向M2表型偏移。

在以往研究弓形虫调控巨噬细胞的极化中多采用大鼠或者小鼠的巨噬细胞系模型。本研究中采用佛波酯诱导THP-1细胞, 并且成功获得了有悬浮细胞分化为贴壁巨噬细胞的模型; 采用THP-1诱导成巨噬细胞的模型对研究弓形虫RH株对人巨噬细胞的极化调节具有重要意义; 从弓形虫调控巨噬细胞极化的角度为弓形虫病的防治提供一个前期研究基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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