引用本文
王建忠, 钟建平, 金法祥, 王华钧, 许文芳, 费迎明, 陈雪芳. 耐药嗜水气单胞菌毒力与六类抗菌药物耐药元件基因研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2018,34(10): 912-919
WANG Jian-zhong, ZHONG Jian-ping, JIN Fa-xiang, WANG Hua-yun, XU Wen-fang, FEI Ying-ming, CHEN Xue-fang. Virulence of resistant Aeromonas hydrophila and six kinds of antibiotic resistance components genes [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2018,34(10): 912-919.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.160
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中国人兽共患病学报
耐药嗜水气单胞菌毒力与六类抗菌药物耐药元件基因研究
王建忠, 钟建平, 金法祥, 王华钧, 许文芳, 费迎明, 陈雪芳
浙江省绍兴市立医院感染科,绍兴市传染病重点实验室,绍兴 312000
通讯作者:金法祥,Email:sxjfx0575@126.com
收稿日期: 2018-05-26
资助项目: 浙江省医药卫生科技计划基金项目(No.2014KYB282)
摘要

目的 了解嗜水气单胞菌毒力基因与耐药基因的分布情况,为嗜水气单胞菌感染的治疗提供参考依据。方法 分离自2014年1月至2017年10月本院内科住院病人的10株嗜水气单胞菌;采用PCR法,对10株嗜水气单胞菌检测3种毒力基因与54种耐药基因,并对检测结果作样本聚类分析。结果 10株耐药嗜水气单胞菌3种重要的毒力基因检测结果, hlyA基因检出率为100.00%, aerA基因检出率为20.00%, rtxA基因无检出。10株耐药嗜水气单胞菌6种β-内酰胺酶基因, blaAQU与 blaMOX基因表达AmpC型β-内酰胺酶,10株中有5株同时检出 blaAQU与 blaMOX基因,1株仅检出 blaMOX基因, 6株AmpC酶三维试验均呈阳性。对10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌3种毒力基因与6类抗菌药物54种耐药元件基因检测结果作UPGMA法样本聚类分析, 10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌可分为A与B二个群。结论 10株耐药嗜水气单胞菌共检出β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类等5类抗菌药物17种获得性耐药基因。7种可移动遗传元件标记基因,有5株检出1~3种可移动遗传元件标记基因。10株耐药嗜水气单胞菌3种毒力基因与54种耐药元件基因同步检测显示,每株至少检出1种毒力基因和2种耐药基因,嗜水气单胞菌对抗菌药物的耐药率上升必须严密监测。

关键词: 嗜水气单胞菌; 耐药基因; 毒力基因; 聚类分析
中图分类号:R378 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)10-0912-08
Virulence of resistant Aeromonas hydrophila and six kinds of antibiotic resistance components genes
WANG Jian-zhong, ZHONG Jian-ping, JIN Fa-xiang, WANG Hua-yun, XU Wen-fang, FEI Ying-ming, CHEN Xue-fang
Department of Infectious Diseases, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing 312000, China
Corresponding author: Jin Fa-xiang, Email: sxjfx0575@126.com
Fund:Supported by the Zhejiang Medical and Health Science and Technology Program Fund Project (No. 2014KYB282)
Abstract

We investigated the distribution of virulence genes and drug resistance genes of Aeromonas hydrophila ( A. hydrophila), providing reference for the treatment of its infection. Samples from inpatients in our hospital were collected from January 2014 to October 2017. By PCR, 10 virulence genes and 54 drug resistance genes were detected in 10 strains of drug-resistant A. hydrophila, and the results were analyzed by sample cluster analysis. Among the 10 strains resistant to A. hydrophila, the detection rate of hlyA gene was 100.00%, the aerA gene detection rate was 20.00%, and no rtxA gene was detected. Six β-lactamase genes of A. hydrophila were detected, blaAQU and blaMOX gene could expressed AmpC β-lactamase, 5 strains were detected simultaneously for blaAQU and blaMOX genes, 1 strain only detected for blaMOX gene, three-dimensional tests in 6 AmpC enzymes were positive. Results UPGMA cluster analysis showed that 10 strains of resistant A. hydrophila and 1 sensitive A. hydrophila could be divided into two groups: A and B. Ten strains of acquired antibiotic resistance genes including β-lactams, aminoglycosides, quinolones, sulfonamides, and chloramphenicol were detected in 10 strains of resistant A. hydrophila. There were 5 strains that detected 1 to 3 mobile genetic element marker genes. Results of 10 virulence genes and 54 resistance element genes of 10 strains of drug-resistant A. hydrophila showed that one virulence gene and two drug resistance genes were detected in each strain. The increase in the resistance rate of A. hydrophila to antimicrobial agents must be closely monitored.

Key words: Aeromonas hydrophila; drug resistance gene; virulence gene; cluster analysis

嗜水气单胞菌是典型的人和动物(含水生动物)共患病病原菌。人肠道感染嗜水气单胞菌可导致腹泻, 嗜水气单胞菌亦可导致人皮肤及软组织感染, 部分免疫力低下者甚至引发败血症和腹膜炎以及腹腔脏器脓肿[1]。近年来国内有关嗜水气单胞菌的临床报道有所增加[2, 3, 4, 5], 嗜水气单胞菌的耐药性虽然远低于革兰氏阴性肠杆菌(如肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌及阴沟肠杆菌), 但部分嗜水气单胞菌临床分离株对常用的抗菌药物有一定的耐药率[1, 2, 3, 4, 5]。近年国内涉及到的嗜水气单胞菌研究注重临床病例报道及耐药性分析[1, 2, 3, 4, 5]。李淑妃等作了嗜水气单胞菌的毒力基因研究[6], 翁幸鐾等作了嗜水气单胞菌的β -内酰胺类和氨基糖苷类药物的耐药基因研究[7]。国内缺乏耐药嗜水气单胞菌的毒力与耐药元件基因的联合检测研究报道。为此, 我们对收集到的10株耐药嗜水气单胞菌进行了3种毒力基因与六类抗菌药物54种耐药元件基因检测, 并以1株对常用抗菌药物敏感的嗜水气单胞菌作为参照株。本研究并对全部基因的检测结果分别作样本聚类分析。

1 材料与方法
1.1 菌株来源

10株耐药嗜水气单胞菌分离自2014年1月至2017年10月本院内科住院病人, 其中血液3例, 腹水4例, 脓液3例。1株对常用抗菌药物敏感的嗜水气单胞菌亦为同期医院分离的菌株。

1.2 药敏试验与AmpC酶三维试验

嗜水气单胞菌13种抗菌药物敏感性试验为K-B药敏纸片法。药敏纸片为英国Oxoid公司产品。10株耐药嗜水气单胞菌敏感试验结果见表1。1株参照株嗜水气单胞菌对该13种抗菌药物均为敏感。本文1、2、5、6、7、9号菌株AmpC酶三维试验呈阳性。

表1 10株嗜水气单胞菌13种抗菌药物敏感性试验结果 Tab.1 Results of susceptibility tests of 13 antimicrobial agents from 10 Aeromonas hydrophila strains
1.3 菌体DNA制备

嗜水气单胞菌菌体DNA制备为非离子去污剂裂解联合蛋白酶K消化法。菌体DNA制备试剂盒裂解液A(非离子去污剂)与裂解液B(蛋白酶K)由无锡市克隆遗传技术研究所提供。挑取单个菌落放入菌体DNA制备试剂盒提供的裂解液A(非离子去污剂)与裂解液B(蛋白酶K)混合液中, 然后55 ℃水浴裂解消化细菌细胞膜60 min, 再95 ℃水浴灭活蛋白酶K活性10 min即为基因检测的模板液。

1.4 基因检测

10株耐药嗜水气单胞菌3种毒力基因与6类抗菌药物54种耐药元件基因检测均为PCR法。54种耐药元件基因为参考近年国内外对嗜水气单胞菌耐药基因检测结果[7, 8, 9], 并参照革兰氏阴性杆菌可能存在的耐药元件基因而确定。实验并设1株对13种抗菌药物均为敏感的嗜水气单胞菌作为参照株。3种毒力基因与六类抗菌药物54种耐药元件基因检测项目见表2。本研究共57种基因引物序列委托无锡新吴区新克隆数据分析工作室设计并获授权使用[7, 13]。PCR扩增核心试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。每种毒力与耐药元件基因的PCR扩增体系均为:耐热DNA聚合酶(rTaq DNA pol, 日本Takara公司产品)1单位(0.2 μ L), 与耐热DNA聚合酶配匹的10倍浓度缓冲液2 μ L(日本Takara公司产品); P1引物2 μ L(1.0 μ mol/L), P2引物2 μ L(1.0 μ mol/L); dNTPs 2 μ L (2 mmol/L); 超纯水7 μ L, 菌株 DNA处理液4.8 μ L, 合计总体积20 μ L。热循环为:95 ℃预变性3 min, 然后95 ℃ 0.5 min→ 55 ℃ 1 min→ 72 ℃ 1 min, 重复30周期, 最后一轮72 ℃延长至5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳40 min, 紫外线下凝胶上出现与阳性对照分子量相同的目的条带即判别为阳性。

表2 3种毒力基因与6类抗菌药物54种耐药元件基因检测项目、PCR引物序列及产物长度 Tab.2 Three kinds of virulence genes and six kinds of antimicrobial drugs 54 kinds of resistance element gene detection items, PCR primer sequences and product length
1.5 PCR扩增产物DNA序列测定与分析

本研究抽取部分PCR扩增阳性产物委托铂尚生物技术公司(上海)作DNA序列测定, 测得序列在线BLASTn比对确认(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)。

1.6 基于基因检测结果的菌株分类

10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌3种毒力基因与六类抗菌药物54种耐药元件基因检测结果, 委托无锡新吴区新克隆数据分析工作室作UPGMA法样本聚类分析, 以获得菌株分类结果。

2 结 果
2.1 毒力与耐药元件基因检测

10株耐药嗜水气单胞菌检出毒力基因2种, 耐药元件基因20种。各种基因阳性率见表3。本研究对部分PCR扩增阳性产物作DNA测序分析, 图1~7分别为aerA、blaTEM、blaOXA-1群、aac(3)-Ⅱ 、qnrS、catB及cmlA测序图。

表3 3种毒力基因与6类抗菌药物54种耐药元件基因检测结果阳性率 Tab.3 The positive rate of the detection results of the 54 genes of three virulence genes and six antibiotics

图1 aerA PCR扩增产物测序图(经BLASTn比对确认aerA)Fig.1 aerA PCR amplification product sequencing

图2 blaTEM PCR扩增产物测序图(经BLASTn比对确认blaTEM-1)Fig.2 blaTEM PCR amplification product sequencing

图3 blaOXA-1群 PCR扩增产物测序图(经BLASTn比对确认blaOXA-1)Fig.3 blaOXA-1 group PCR amplification product sequencing

图4 aac(3)-Ⅱ PCR扩增产物测序图(经BLASTn比对确认aac(3)-Ⅱ )Fig.4 aac(3)-II PCR amplification product sequencing

图5 qnrS PCR扩增产物测序图(经BLASTn比对确认qnrS)Fig.5 qnrS PCR amplification product sequencing

图6 catB PCR扩增产物测序图(经BLASTn比对确认catB)Fig.6 catB PCR amplification product sequencing

图7 cmlA PCR扩增产物测序图(经BLASTn比对确认cmlA)Fig.7 cmlA PCR amplification product sequencing

2.2 基因检测结果的菌株分类

对10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌3种毒力基因与六类抗菌药物54种耐药元件基因检测结果作UPGMA法样本聚类分析, 由图8可见, 10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌可分为A与B 2个群。由表4 的为10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌经基因检测结果样本聚类分析后的分类状况。

表4 10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌3种毒力基因与6类抗菌药物54种耐药元件基因检测结果经样本聚类分析后的分类状况 Tab.4 Classification results of the detection results of 10 resistance genes of 10 strains of resistant Aeromonas hydrophila and 1 sensitive Aeromonas hydrophila and 54 antimicrobial elements of 6 antibiotics

图8 10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌3种毒力基因与六类抗菌药物54种耐药元件基因检测结果样本聚类分析
注:(图中数字为耐药嗜水气单胞菌之菌株号, S为参照株)Fig.8 Cluster analysis of the detection results of the resistance genes of 10 strains of resistant Aeromonas hydrophila and 1 strain of sensitive Aeromonas hydrophila and 54 antimicrobial elements of six antibiotics

3 讨 论

嗜水气单胞菌广泛存在于水与土壤等自然界, 人感染嗜水气单胞菌后可导致食物中毒(腹泻)等介水传染病, 皮肤与软组织感染, 严重者可导致败血症等。

嗜水气单胞菌之所以能导致人与动物以及水生动物(鱼、鳝鱼、甲鱼、蛙、大鲵等等)炎症性疾病是因为该菌产多种毒力因子(毒力因子由毒力基因编码)。hlyA基因表达溶血素(hemolysin)可对宿主细胞构成细胞毒性损害。aerA基因表达气溶素(aerolysin), 气溶素对宿主细胞具有溶血性、细胞毒性和肠毒性。aerA基因缺失的嗜水气单胞菌毒力减弱。rtxA基因表达产物能导致宿主细胞凋亡[10]。本文对10株耐药嗜水气单胞菌进行了上述3种重要的毒力基因进行了检测, 结果为hlyA基因检出率为100.00%, aerA基因检出率为20.00%, 而rtxA基因无检出。即本文10株耐药嗜水气单胞菌中, 2株为同时检出hlyA与aerA基因, 8株仅检出hlyA基因(见表4)。Soltan等曾报道了嗜水气单胞菌败血症患者分离株aerA基因检出为4/4(100.00%), hlyA基因检出为2/4(50.00%)。

本文10株耐药嗜水气单胞菌由表2 的13种抗菌药物敏感性试验结果可见, 除对亚胺培南全为敏感外, 对其它种抗菌药物的耐药率在30.00%~80.00%之间, 因而本文菌株的耐药性并不低。

本文10株耐药嗜水气单胞菌共检出6种β -内酰胺酶基因(阳性率详见表3), blaAQU与 blaMOX基因表达AmpC型β -内酰胺酶, 10株中有5株(1、2、5、6、7号菌株)同时检出blaAQU与 blaMOX基因(见表4), 9号菌株仅检出blaMOX基因(见表4), 这6株AmpC酶三维试验均呈阳性。本文10株耐药嗜水气单胞菌共检出5种氨基糖苷类修饰酶基因(阳性率详见表3), 共有6株被检出氨基糖苷类修饰酶基因, 但2株仅检出ant(3″)-Ⅰ , ant(3″)-Ⅰ 型修饰酶仅能灭活链霉素(不能灭活庆大霉素与阿米卡星), 因此本文6株被检出氨基糖苷类修饰酶基因的菌株只有4株菌耐庆大霉素与阿米卡星, 该4株菌同时检出多种修饰酶基因(3、5、9、10号株, 见表4)。本文菌株没有检出16S rRNA甲基化酶基因, 与 Moura等的报道不同[8]。另外, 本文菌株耐喹诺酮基因检出qnrS与qepA, 耐复方新诺明基因sul1与dfrA1, 耐氯霉素基因catB与cmlA。上述3类抗菌药物的耐药基因检出率与耐药率基本一致(见表1和表4)。综上可见, 10株耐药嗜水气单胞菌共检出β -内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类等5类抗菌药物17种获得性耐药基因。这些获得性耐药基因往往由可移动遗传元件介导, 本研究检测了7种可移动遗传元件标记基因, 有5株检出1~3种可移动遗传元件标记基因(见表4)。

1株敏感嗜水气单胞菌没有检出任何耐药元件基因, 仅检出hlyA基因(见表4)。由基因检测结果样本聚类分析显示, 它仅与8号株有较近的亲缘关系。

本文对10株耐药嗜水气单胞菌经3种毒力基因与54种耐药元件基因同步检测显示, 每株至少检出1种毒力基因和2种耐药基因, 这一现象在国内为首次报道。嗜水气单胞菌对抗菌药物的耐药率上升必须严密监测, 国内已发现携带mcr-5基因而耐多粘菌素的嗜水气单胞菌菌株[12]。

The authors have declared that no competing interests exist.

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