1.1.1 病例 该感染者在2014年广州市登革热暴发流行中被确诊, 于确诊后40 d采集外周血样本10 mL于抗凝采血管中。通过梯度密度离心分离外周单核细胞(PBMC), 储存于液氮中备用。4种型别重组E蛋白为本实验室生产。

1.1.2 主要试剂 常用质粒pMD18-T、pTT-5为实验室保存, 其中pTT-5载体已构建抗体轻重链恒定区, 用于抗体表达; 常用菌株如DH5α 、Top10购自Tiangen公司; 细胞株BHK-21、293Expi购自ATCC; DMEM培养基、胎牛血清、PBS磷酸盐缓冲盐溶液、青霉素、链霉素均购于美国Hyclone公司。样品的核酸和质粒提取试剂购自QIAGEN公司; 羊抗人IgGHRP(Fab specific)购自PIERCE公司; Live/dead-Aqua、CD3-PeCy7、CD20-FITC、CD27-PE、IgG-BV421及链亲和素偶联的APC等染色用荧光抗体购自BD公司, DENV-1 E蛋白生物素化试剂购自Thermo公司。抗体纯化介质购自GE公司; DNA、Protein Marker购自Thermo公司。

1.1.3 Nested-PCR引物 本研究所涉及的引物均由Invitrogen公司合成, 具体引物设计方案参照文献[16]。

1.2.1 单细胞分选 采集2014年广州市登革热暴发流行中被确诊的感染者外周血10 mL, 采用常规Ficoll-Paque密度梯度离心, 获得外周血单核细胞(PBMC)。采用Live/dead、CD3、CD20、CD27、IgG、IgM和DENV-1 E-biotin这6个指标对抗原特异的记忆B细胞进行特异性标记, 经BD AriaⅢ 分选型流式细胞仪进行数据采集和单细胞分选, 用96孔U底细胞板进行细胞收集。

1.2.2 逆转录PCR 在96孔PCR板中进行逆转录操作。配置14 μ L逆转录体系, 各组分加入量为:150 ng随机引物(pd(N)6, GE Healthcare)、0.5 μ L dNTP(Invitrogen)、0.5%Igepal CA-630 (Sigma)、4 U RNAsin (Promega)、6 U Prime RNAseInhibitor (Eppendorf) 和50 U Superscript^○R III reverse transcriptase (Invitrogen), 42 ℃, 10 min; 25 ℃, 10 min; 50 ℃, 60 min; 94 ℃, 5 min。逆转录结束后, 将PCR板保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 Nested-PCR 通过Nested-PCR 对IgH, Igλ 和Igκ 可变区基因进行扩增, 扩增体系为40 μ L, 各组分够成为:cDNA 3.5 mL、20 nmol/L各引物、300 nMdNTP (Invitrogen) 和 1.2 UHotStar^○R Taq DNA polymerase (Qiagen)。Nested-PCR反应条件为:94 ℃, 30 s; 58 ℃(IgH/Igκ ) 或者 60 ℃(Igλ ), 30 s; 72 ℃, 55 s (第一轮PCR) 或者45 s (第二轮PCR); 循环数50。应用2%琼脂糖核酸电泳, 对Nested-PCR产物进行鉴定及回收。

1.2.4 PCR产物纯化和克隆鉴定 Nested-PCR产物片段大小为500 bp, 使用TIANGEN回收试剂盒纯对鉴定为阳性的PCR产物进行回收, 然后克隆至pMD18-T载体。每个PCR产物挑取5个菌斑进行菌液PCR验证, 提取阳性克隆质粒进行基因测序。

1.2.5 抗体基因序列分析 将测序结果用MEGA 7读取, 并将测序结果正确的序列在IMGT数据库中进行重链以及轻链的家系及突变情况等分析。

1.2.6 抗体的表达及纯化 对纯化得到的重链及轻链可变区分别构建酶连位点, 将来自每个单细胞的抗体可变基因的扩增cDNA克隆到含有人IgG1或Igκ 恒定区的表达载体中, 构建不同轻重链表达克隆, 重组表达IgG1亚型抗体^[20]。使用Lipofectamine^TM 2000转染试剂盒(11668-019, Invitrogen), 用等量的编码重链和轻链的质粒转染293Expi细胞。培养5 d后, 收集含有抗体的细胞上清, 并使用Protein A介质(17-1279-03, GE Healthcare)进行纯化。

1.2.7 抗体结合活性测定 通过不同型别重组E蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA), 对单克隆抗体与不同血清型DENV的结合活性进行检测。包被E蛋白(DENV-1:228-11688, DENV-2:228-11689, DENV-3:228-11690, DENV-4:228-11691; RayBiotech)200 ng每孔于ELISA板, 4 ℃过夜保存。然后每孔中加入200 μ L 5%脱脂奶粉, 37 ℃下孵育2 h进行封闭。呼吸道合胞病毒(RSV)特异性人源单克隆抗体作为阴性对照抗体, 其与待检测单克隆抗体以初始浓度为30 μ g/mL进行4倍倍比梯度稀释, 然后加入100 μ L各浓度, 并在37 ℃下孵育1 h。PBS-Tween洗涤3次, 加入羊anti-人IgG抗体(1∶ 5000, v/v), 37 ℃下孵育1 h, PBS-Tween洗涤3次。加入显色底物, 37 ℃孵育15 min, 终止显色并读取吸光度参数。根据读值, 计算其抗体与抗原的结合活性。

1.2.8 蚀斑减少中和试验(PRNT)测定抗体中和活性 将BHK-21细胞(5× 10⁵细胞/mL, 2 mL培养基)接种于6孔板中, 37 ℃ 5%CO₂条件下培养过夜。然后加入单克隆抗体-病毒混合液于BHK-21细胞单层中, 37 ℃下孵育1 h。弃去培养上清液, 加入800 μ L 1.2%营养甲基纤维素, 37 ℃下培养4~5 d。空斑形成后, 用0.1%结晶紫染色30 min, 观察斑块形成。汇总数据分析不同抗体中和活性。

为了获得天然的轻重链抗体配对, 本研究应用流式细胞分选系统, 实现单个B细胞高效分选。本研究中分析的样本来源于2014年广东省登革热感染者, 应用CD3、CD20、CD27、IgG、IgM及DENV-1 E蛋白等指标实现对PBMC中B细胞亚群的具体分析。记忆B细胞作为体液免疫应答的重要组成, 成熟记忆细胞表面的BCR具有很强的抗原结合能力且长期存在于外周血中, 因此本研究也选择记忆B细胞作为获得DENV抗原特异性单克隆抗体基因的来源。

分析结果表明, 外周血中成熟记忆B细胞(Aqua^-/CD3^-/CD20⁺/CD27⁺/IgG⁺)中DENV E蛋白特异性成熟记忆B细胞占比为0.32%, 如图1。从10 mL外周血的单核细胞中共分选得到110个特异性单B细胞, 用于后续的单细胞PCR。

图1

Fig.1

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	图1 DENV特异IgG+记忆B细胞群分析Fig.1 Analysis of DENV-specific IgG+memory B cells

抗体轻重链可变区为抗原特异性识别区域, 通过获取该区域基因序列信息实现对抗体的序列进行分析及表达鉴定。已经广泛使用的单细胞PCR技术能够对IgH、Igλ 和Igκ 的可变区基因进行高效扩增。研究中单细胞PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后, 显示在分选得到的110个DENV特异性B细胞中成功调取重链的有55个, 成功率为50%, 轻链的有70个(48个Kappa型, 22个lambda型), 成功率为63.6%。共得到24株抗体轻重链基因配对, 配对成功率为21.8%。采用Gibson装配方法将配对抗体轻重链可变区序列构建到含有人源IgG1或Igκ 恒定区的表达载体中。经过酶切鉴定及序列比对, 最终成功构建24株抗体的表达克隆。配对抗体轻重链表达质粒等量转染到293Expi真核表达细胞, 悬浮培养5 d后收集细胞培养上清。经过酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定, 其中6株为DENV特异性单克隆抗体。通过Protein A介质对IgG1抗体进行纯化, 纯化产物经离心浓缩后进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果如图2, 各抗体的轻重链均可很好的表达, 重链分子量大小为50 kD左右, 轻链分子量大小为25 kD左右, 与正常大小相符合。

图2

Fig.2

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	图2 SDS-PAGE凝胶电泳分析抗体轻重链表达Fig.2 Antibodies were characterized by SDS-PAGE

通过重组E蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA), 对单克隆抗体与不同血清型DENV E 蛋白的结合活性进行了检测, 对EC50进行统计分析。结果如图3, 这6株单克隆抗体具有DENV结合活性, 其均为DENV-1 E蛋白特异性单克隆抗体, 在高浓度下与DENV-2 E 蛋白具有很弱的结合。在6株单克隆抗体中, 4株单抗N-1、N-2、N-3和N-6具有与DENC-1 E蛋白相近的结合活性, EC50分别为0.006 9 μ g/mL、0.006 8 μ g/mL、0.005 4 μ g/mL和0.006 5 μ g/mL。此外, N-4与N-5的结合活性较差, N-5的EC50为2.06 μ g/mL, 这应该与其识别表位的差异性或者抗体成熟度不够有关。

通过蚀斑减少中和试验(PRNT)测定各抗体中和活性, 结果如图4。因为筛选得到的单克隆抗体为DENV-1特异性单克隆抗体, 所以其只对DENV-1病毒具有中和活性, 对其他亚型均无中和能力。普遍认为中和活性与结合活性之间具有一定的相关性, 本研究的中和结果也说明了这一观点。6株抗体中强结合活性的N-1、N-2、N-3和N-6均表现出很强的中和DENV-1病毒的能力, 其PRNT50分别为0.01 μ g/mL、0.014 μ g/mL、0.014 μ g/mL和0.023 μ g/mL。结合活性最差的N-5单克隆抗体PRNT50为21.24 μ g/mL。

图3

Fig.3

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	图3 应用ELISA方法对抗体反应性进行检测Fig.3 Reactivity test of DENV-specific antibodies

图4

Fig.4

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	图4 测定各抗体对不同亚型DENV的中和活性Fig.4 Neutralization test of DENV-specific antibodies

配对抗体轻重链可变区基因序列上传至IMGT数据库进行比对并分析。24株抗体轻重链V区基因与人源抗体原始家系一致性均达到90%以上, 说明调取的抗体基因未出现其他物种基因污染。验证为DENV-1 E蛋白特异性的6株单克隆抗体的轻重链基因序列分析结果见表1, 其重链V基因家系为1-69、5-51和4-30, 轻链V基因家系来源为2-14、3-15、1-51、1-39和1-47。与结合活性结果共同分析可以发现, 高结合活性的N-1、N-2、N-3和N-64株单抗均来源于1-69家系。同时这4株单抗均有相似的CDR3氨基酸序列, 可能识别相同的E蛋白抗原表位, 且通过结合该表位能够高效的抑制病毒对细胞的感染。

表1

Tab.1

表1(Tab.1)

表1 不同抗体的轻重链VDJ基因家系及CDR3氨基酸序列分析 Tab.1 Analysis of VDJ gene family of light and heavy chains with different antibodies, which was accessible from IMGT

表1 不同抗体的轻重链VDJ基因家系及CDR3氨基酸序列分析 Tab.1 Analysis of VDJ gene family of light and heavy chains with different antibodies, which was accessible from IMGT