中国大陆地区柯萨奇病毒A组4型VP1区基因特征分析
姚学君, 姜仁杰, 管书慧, 刘秀兰
盐城市疾病预防控制中心,盐城 224000
通讯作者:刘秀兰,Email:jsycepi@126.com
摘要

目的 分析中国大陆地区柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CV-A4)流行毒株基因特征和进化规律。方法 利用Mega6.0软件对GenBank核苷酸数据库收录的分离于中国大陆地区CV-A4毒株VP1区基因序列进行分析,构建系统进化树,并计算分离毒株核苷酸和氨基酸同源性。结果 纳入中国大陆地区CV-A4毒株合计116株,中国大陆地区16个省份CV-A4流行毒株潜在的优势基因型为F。与原型株High Point相比,中国大陆地区CV-A4毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为79.9%~84.1%和92.5%~98.7%,收录中国大陆地区CV-A4毒株间核苷酸和氨基酸同源性分别为82.6%~100.0%和91.5%~100.0%。结论 针对中国大陆地区CV-A4毒株流行特征和进化规律,采取有效措施防控手足口病。

关键词: 柯萨奇病毒A组4型; 序列分析; 分子流行病学
中图分类号:R373.2 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)11-1021-05
Genetic characteristics of the VP1 region of coxsackievirus A4 in mainland China
YAO Xue-jun, JIANG Ren-jie, GUAN Shu-hui, LIU Xiu-lan
Department of Acute Disease Prevention and Control, Yancheng City Center for Disease Prevention and Control, Yancheng 224100, China
Corresponding author: Liu Xiu-lan, Email: jsycepi@126.com
Abstract

To analyze the genetic characteristics and evolution of coxsackievirus A4 (CV-A4) strains isolated in mainland China, MEGA 6.0 software was used to analyze the VP1 region of CV-A4 isolates from mainland China by retrieving the GenBank nucleotide database. Besides, the phylogenetic tree was constructed and the homology of nucleotide and amino acids were calculated. A total of 116 Chinese CV-A4 isolated strains were included in this study. The results showed that the majority of Chinese CV-A4 virus strains isolated from 16 provinces belonged to genotype F. Comparing with the prototype strain High Point, the homology of nucleotide sequences and amino acid sequences of VP1 region of 116 Chinese isolates were 79.9%~84.1% and 92.5%~98.7%, respectively; moreover, the nucleotide and the amino acid homology of VP1 gene of 116 Chinese CV-A4 isolates among themselves ranged from 82.6% to 100. 0% and ranged from 91.5% to 100.0%, respectively. This study suggests that effective measures should be taken to prevent hand-foot-and-mouth disease according to the tendency of molecular epidemiology and genotype distribution of CV-A4 strains isolated in China.

Keyword: coxsackievirus A4; sequence analysis; molecular epidemiology

柯萨奇病毒A组4型属于小RNA病毒科肠道病毒属成员, 是导致手足口病发病的常见病原体[1]。文献资料报道显示CV-A4感染还可引起急性迟缓性麻痹、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎等多种疾病[2, 3]。近年来由于手足口病病原谱发生变化, 非EV71和非CV-A16病毒感染引起手足口病比例有所增加, 其中CV-A4感染占肠道病毒感染病例数的构成比约为1%[4]。此外, 国内关于CV-A4毒株基因型研究报道相对较少, 本研究通过检索GenBank核苷酸数据库收录的中国大陆地区CV-A4分离毒株VP1区核苷酸全长序列, 采用分子流行病学方法综合分析国内CV-A4毒株流行状况, 绘制系统进化树, 分析核苷酸和氨基酸序列同源性, 以期全面探索CV-A4毒株基因特征, 为手足口病防控提供科学数据。

1 材料与方法
1.1 材料来源

通过GenBank核苷酸序列数据库搜索“ Human Coxsackievirus A4” VP1区基因序列信息, 搜索截止日期2017年11月20日, 共计检索出国内研究人员上传具有完整VP1区基因核苷酸序列(915 bp)分离毒株116株。

1.2 研究方法

1.2.1 系统进化树分析 使用DNA Star和Mega6.0软件对CV-A4毒株VP1区核苷酸序列信息进行病毒基因型别鉴定分析; 采用Clustal W法进行多重比对, 采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树; 外部参考株选取CV-A4毒株原型株High Point, 系统进化树构建可靠性采用Bootstrap法, 循环次数为1 000。

1.2.2 核苷酸和氨基酸序列分析 使用Mega6.0软件比较分析核苷酸和氨基酸序列同源性, 用配对比较和Kimura双参数法测算分离毒株核苷酸和氨基酸差异率以及不同基因型间同源性, 结果采用核苷酸和氨基酸相似百分数表示。

2 结 果
2.1 CV-A4毒株核苷酸序列筛选结果

本次研究共获取GenBank核苷酸数据库里具有完整基因VP1区核苷酸序列的毒株116株, 对检索到CV-A4毒株地区分布研究显示, 毒株分离来源于16个省份, 主要为山东(43株, 占37.1%)、四川(18株, 占15.5%)、北京和上海(各9株, 各占7.8%), 依次为深圳(8株, 占6.9%)、湖南(7株, 占6.0%)、云南和重庆(各4株, 各占3.4%)、吉林(3株, 占2.6%)、江苏、广东、海南和宁夏(各2株, 各占1.7%)、河南、安徽和陕西(各1株, 各占0.9%)。

2.2 CV-A4毒株时间分布

中国大陆地区116株CV-A4毒株序列分离时间为1996-2016年, 主要分布在2006-2016年, 其中2011年毒株最多, 为22株, 占分离毒株总数的19.0%, 依次为2010年和2012年均分离到毒株17株, 均占14.7%; 不同时间分离毒株数目情况见图1。

图1 中国大陆地区不同年份CV-A4毒株分布趋势Fig.1 Time Distribution profile of CV-A4 isolates in mainland China

2.3 CV-A4毒株基因型分布

采用MEGA6.0软件构建系统进化树, 分析结果显示中国大陆地区16个省份分离获取CV-A4毒株以基因型F为流行优势株, 具体基因型分布如下:D型2株, E型5株, F型109株, 分别占中国大陆地区CV-A4分离毒株总数的1.7%、4.3%和94.0%(图2)。基因型D为四川于2006年和2007年各分离毒株1株; E型为山东于1996— 2003年分离毒株4株和吉林于2006年分离毒株1株; F型为中国各地区2006— 2016年分离获取。

图2 中国大陆地区CV-A4流行毒株系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on VP1 complete sequence of CV-A4 isolates in mainland China

2.4 核苷酸和氨基酸同源性分析

采用MEGA6.0软件对中国大陆分离株与各基因型核苷酸和氨基酸同源性比较分析, 结果显示116株分离株间核苷酸序列同源性为82.6%~100.0%, 氨基酸序列同源性为91.5%~100.0%; 与CV-A4毒株原型株High Point核苷酸和氨基酸同源性分别为79.9%~84.1%和92.5%~98.7%; 与其余基因型毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为76.4%~100.0%和86.9%~100.0%(表1)。

表1 中国大陆地区分离株与各基因型参考株同源性比较分析 Tab.1 Homology analysis of nucleotide acid and amino acid sequences of VP1 gene between CV-A4 isolates and reference strains from GenBank

2.4.1 各年份间分离株核苷酸和氨基酸同源性分析 对中国大陆地区116株CV-A4毒株依照不同年份进行分组, 利用MEGA6.0软件计算不同年份间核苷酸和氨基酸同源性, 结果显示中国地区1996-2003年分离于山东境内的CV-A4毒株与其他年份分离株核苷酸序列差异性较大, 平均同源性为85.1%~88.6%; 2006-2016年分离株间核苷酸序列平均同源性为91.5%~95.9%; 1996-2016年分离株间氨基酸序列差异性较小, 平均同源性为96.3%~99.3%(表2)。

表2 中国大陆地区分离株不同年份间核苷酸和氨基酸同源性比较分析 Tab.2 Homology analysis of nucleotide acid and amino acid sequences of VP1 gene according to years among CV-A4 isolates in mainland China

2.4.2 不同地区间分离株核苷酸和氨基酸同源性分析 对中国大陆地区116株CV-A4毒株依照不同地区进行分组, 利用MEGA6.0软件计算不同地区间核苷酸和氨基酸同源性, 结果显示核苷酸和氨基酸序列平均同源性为91.4%~97.3%和97.8%~99.5%(表3)。

表3 中国大陆地区分离株不同地区间核苷酸和氨基酸同源性比较分析 Tab.3 Homology analysis of nucleotide acid and amino acid sequences of VP1 gene according to distribution among CV-A4 isolates in mainland China
3 讨 论

手足口病是一种婴幼儿常见急性传染病, 可由多种肠道病毒感染引起, 我国于2008年将其纳入法定报告传染病丙类传染病管理。以往研究报道多集中在肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)和CV-A16两种常见病原体, 而手足口病病原谱研究更多的将CV-A4划分为其他肠道病毒, 因此CV-A4毒株分子流行病学研究目前国内报道相对较少[5]。本研究通过检索GenBank核苷酸数据库收录的中国地区CV-A4毒株VP1区核苷酸序列, 构建系统进化树图, 从而进一步阐明中国地区CV-A4毒株基因特征和遗传进化规律。

研究显示基于肠道病毒VP1区核苷酸序列可准确应用于肠道病毒基因特征和型别分析, 因此本研究利用CV-A4毒株VP1区核苷酸序列进行分子流行病学分析[2, 3, 4, 6]。本研究从GenBank核苷酸数据库获取中国地区116株CV-A4毒株VP1区基因序列, 参照陈炜等人[6]研究构建系统进化树, 结果将CV-A4毒株划分为6个基因型, 分别为A、B、C、D、E和F型。基因型A原型株High Point于1950年分离于美国脊髓灰质炎流行的社区污水中, 系统进化树图显示中国大陆地区CV-A4毒株相对于原型株遗传距离较远, 亲缘性远[7]。进一步分析显示中国大陆地区一些省份1996-2006年CV-A4毒株流行基因型D和E, 合计7株分离株, 占收录国内分离毒株数的6.0%, 随后流行毒株基因型F取代基因型D和E成为中国大陆地区16个省份潜在的优势基因型。

本次研究基于CV-A4毒株完整VP1区核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析, 结果显示中国大陆地区流行毒株内部间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82.6%~100.0%和91.5%~100.0%; 与原型株序列在核苷酸和氨基酸水平已产生较为明显的差异, 同源性分别为79.9%~84.1%和92.5%~98.7%。对国内分离株按照年份分析核苷酸和氨基酸序列同源性, 中国大陆地区1996-2003年和2006-2016年毒株序列间核苷酸差异性较大, 平均同源性为85.1%~88.6%, 但氨基酸水平未见特征性差异, 提示表明CV-A4毒株在中国已经流行传播较长时间, 病毒核苷酸存在着一定的遗传进化。对国内分离株按照地区分析核苷酸和氨基酸序列同源性, 国内16个省份平均同源性为91.4%~97.3%和97.8%~99.5%, 提示各地区间病毒序列差异性较小。中国大陆地区116株CV-A4分离毒株核苷酸和氨基酸序列分析结果与田子颖[8]、张宝敏[9]的关于CV-A4毒株分子流行病学研究内容相似。

综上所述, 本研究分析GenBank核苷酸数据库收录的中国大陆地区CV-A4毒株VP1区序列基因特征, 从而了解国内CV-A4病毒株时间、地区及基因型的分布情况, 及分析不同基因型、地区和年份分离毒株的核苷酸和氨基酸间同源性。此研究内容将提供更多的关于中国地区CV-A4毒株遗传流行规律, 为进一步研究CV-A4毒株分子流行病学提供数据支持, 利于加强手足口病防控工作。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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