本研究使用的68份蚤DNA样品, 采自柴达木盆地1市2县的68匹蚤(样点分布如图1)。将保存于75%酒精中的蚤样本用眼科镊轻轻摄出, 置于解剖镜下, 用手术刀片将其腹部切开, 再将单匹蚤体放入1.5 mL离心管中备用。根据QIAGEN试剂盒DNA提取步骤制备蚤DNA模板, 并将模板置于-20 ℃保存。样本来源详见表1。

图1

Fig.1

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	图1 青海省部分蚤种样本采集点信息Fig.1 Sampling location of fleas used in present study in Qinghai

表1

Tab.1

表1(Tab.1)

表1 实验用样本来源 Tab.1 Sources of samples in this research 科 蚤种 采集地 宿主 样本量 序列登录号 蚤科 铁氏角头蚤 格尔木 子午沙鼠、三趾跳鼠 2 MG138326-MG138327 切唇蚤科 叶状切唇蚤 格尔木 子午沙鼠 1 MG138325 栉眼蚤科 阿巴盖新蚤 都兰 长尾仓鼠 2 MG138233, MG138235 盔状新蚤 都兰 小毛足鼠 5 MG138229-MG138232, MG138246 类新蚤 都兰 长尾仓鼠、子午沙鼠 4 MG138222-MG138225 五侧纤蚤邻近亚种 共和 高原鼠兔 3 MG138218, MG138236, MG138241 细蚤科 迟钝中蚤指名亚种 格尔木 三趾跳鼠 6 MG138159, MG138250-MG138254 角尖眼蚤 都兰 五趾跳鼠 2 MG138260, MG138266 长突眼蚤 共和 小毛足鼠 3 MG138267-MG138269 直狭怪蚤 都兰 子午沙鼠 2 MG138270, MG138272 细钩双蚤 都兰、共和 子午沙鼠、小毛足鼠 2 MG138333-MG138334 表1(续) 科 蚤种 采集地 宿主 样本量 序列登录号 共和双蚤 共和 小毛足鼠 10 MG138298-MG138307 长鬃双蚤 格尔木、共和 小毛足鼠 9 MG138286-MG138288, MG138290, MG138294-MG138297, MG138335 直缘双蚤指名亚种 格尔木 白尾松田鼠 3 MG138273, MG138275-MG138276 角叶蚤科 哗倍蚤指名亚种 共和 高原鼠兔 2 MG138161-MG138162 裂病蚤 格尔木 子午沙鼠 1 MG138193 秃病蚤 格尔木、共和 小毛足鼠、子午沙鼠 6 MG138197-MG138202 端突病蚤 格尔木 子午沙鼠 2 MG138194-MG138195 刷状同瘴蚤 格尔木 白尾松田鼠 3 MG138203-MG138205

表1 实验用样本来源 Tab.1 Sources of samples in this research

扩增体系:10× buffer 2.5 μ L, dNTPs 0.5 μ L, Taq DNA聚合酶0.15 μ L, 上下游引物各0.5 μ L, 模板2 μ L, 最后用dd H₂O补齐反应体系至25 μ L。扩增条件:94 ℃预变性4 min后进行40个循环, 94 ℃变性 1 min, 其中前10个循环的退火温度为55 ℃, 后30个循环的退火温度为50 ℃, 退火时间均30 s。72 ℃延伸40 s。扩增时选用通用引物扩增COI基因片段^[8], 引物序列L1490(5'-GTCAACAAATCATAAAGATATTG-3')和H2198(5'-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3')。将PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测, 选取条带清晰样品送北京擎科生物技术有限公司进行双向测序(如图2)。

图2

Fig.2

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	图2 PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products

首先用Chromos软件观察测序峰图质量, 选取峰图质量较高的测序结果在NCBI上运行BLAST程序进行序列同源性比较, 以确保所获序列是目的序列。再用Clustal X软件^[9]

进行多重序列比对, 将比对结果导入Mega 6.0软件^[10], 基于Kimura-2-parameter模型^[11]进行碱基组成计算和分析、序列信息位点检测、转换数与颠换数及其比值等。

共测得3总科5科11属19种蚤计68条COI序列, 另外从GenBank中查询的蚤类同源序列经Mega 6.0软件进行序列组成分析, 结果显示COI基因序列中保守位点有336个, 变异位点有261个, 简约信息位点有252个, 自裔位点有9个。同时A、T、C、G碱基的平均含量分别为27.2%、39.7%、17.7%、15.4%, 其中A+T含量(66.9%)远高于G+C含量(33.1%), 与目前已测线粒体DNA序列中较高的A+T含量现象相一致。

由表2可以看出, COI基因序列的碱基转换值明显高于颠换。T、C间的转换平均数是204, A、G间的转换平均数是137, TC转换大于AG间的转换。转换/颠换的平均值0.08, 转换主要发生于A-G之间, 颠换主要发生于T-A之间。第1位点R值最小, 仅0.78, 说明第一位点的替换多是同义替换, 不会导致氨基酸的改变。

运用Mega 6.0软件, 基于Kimura-2-parameter模型, 采用NJ邻接法构建柴达木盆地常见寄生蚤COI基因序列的NJ树(图3), 对NJ树进行内部分支检验与1 000次Bootstrap检验分析, 来确定各支系的置信度。

表2

Tab.2

表2(Tab.2)

表2 柴达木盆地蚤类COI基因碱基替换数 Tab.2 Base substitutions on COI gene of fleas from Qaidam Basin 位点 R TT TC TA TG CT CC CA CG AT AC AA AG GT GC GA GG 平均 42.00 1 204 16 17 2 15 87 3 1 15 4 137 6 1 0 6 1st 0.78 69 11 15 1 10 5 3 0 14 3 57 5 1 0 4 2 2nd 2.92 48 5 2 0 5 29 0 0 1 0 57 1 0 0 2 48 3rd 1.19 88 0 0 0 0 53 0 0 0 0 23 0 0 0 0 34

表2 柴达木盆地蚤类COI基因碱基替换数 Tab.2 Base substitutions on COI gene of fleas from Qaidam Basin

图3

Fig.3

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	图3 基于Kimura-2-parameter模型构建蚤类NJ系统树Fig.3 A neighbor-joining phylogenetic tree of fleas based on Kimura 2-parameter model

柴达木盆地19种蚤的COI序列其平均遗传距离为16.1%, 种内遗传距离0.01%2.9%, 种间遗传距离3%15.4%, 种间遗传距离显著大于种内遗传距离。种属间遗传距离如图4所示。

图4

Fig.4

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	图4 柴达木盆地蚤类COI基因部分序列遗传距离差异分析Fig.4 Analysis of genetic distance on partial COI gene sequence of fleas from Qaidam Basin

本研究中我们挑选了形态特征比较明显的非透明蚤标本做分子实验, 即便这样, 在分析和比对本研究的蚤类COI基因部分序列时, 我们也发现一些种类的形态鉴别可能存在误定问题, 尤其是雌蚤的鉴定结果。例如编号Z138的双蚤雌蚤(符合双蚤属属征:仅有胸栉, 腹节背板有副鬃列, 眼鬃位于眼的上方、触角窝的前缘, 眼的前方有可见的幕骨拱, 后足第5跗节4对侧蹠鬃、1对蹠鬃), 且第7腹板后缘较平, 初鉴为原双蚤指名亚种; 编号Z147、Z148的雌蚤在镜检时也符合双蚤属的属征, 但第7腹板后缘具浅凹, 下段不外斜, 初步鉴定为方指双蚤。这3匹雌蚤均采自格尔木白尾松田鼠体表, 因该地区未采到相应雄蚤, 先暂以形态鉴定命名。在后续工作中发现这3匹蚤和GeneBank登录号为MG138278、MG138279的直缘双蚤指名亚种的雄蚤聚为一支, 且置信度为99%。根据蚤类形态鉴别以雄性为主, 雌性为辅的特性, 所以我们在分子结果分析时结合现场鉴定结果、宿主和地区分布等综合考量, 将这3匹雌蚤复鉴为直缘双蚤指名亚种。

实际工作应用中, 一些雌蚤种一级的分类特征差异很小, 我们在形态分类时只能鉴定到属, 无法鉴定到种。若想细分, 最好在同地区再次补点进行样本采集, 以期获得该属雄蚤, 看能否和雌蚤进行配对鉴定。如果雄蚤特征不匹配或现场补样条件不允许, 可通过分子试验的COI基因数据在GeneBank基因库中比对后, 再综合分子聚类结果和现场样本采集信息进行准确分类鉴定。

鉴于形态常规分类存在鉴定错判的可能, 今后蚤类鉴定应以外部形态鉴定为主, 结合分子鉴定结果, 可更好地发现和纠正传统形态学鉴定中的错误, 从而准确鉴别物种。

构建的系统树显示所有个体形成19个高支持度的单一分支, 提示蚤种类应该有19种, 这和蚤凭证标本复核结果大致一致, 说明DNA条形码技术可用于蚤类的鉴定。

形态鉴别结果为秃病蚤田鼠亚种和秃病蚤指名亚种的COI基因序列在NJ树中却聚为一个分支, 置信度100%, 考虑亚种在形态鉴别中的很多问题和歧义等实际问题, 笔者认为把这一分支直接定为种的阶元-秃病蚤, 而不再往下细分更为合理些。

NJ树中长鬃双蚤和共和双蚤分支蚤种鉴定出现问题最多, 暂时把这两个双蚤分支归为疑似长鬃双蚤、疑似共和双蚤类群。我们再三复核这两个分支的凭证标本, 最后分析出现的问题原因大致有二, 一是双蚤属雌蚤形态鉴定只能凭第7复板后缘凹陷的深浅及广度, 差别细微, 主观性较强, 极易造成误鉴或只能粗略鉴定到属。二是雄蚤形态复鉴无误, 但分子结果却和形态结果不相一致的问题。例如, 1匹雄蚤形态鉴定为长鬃双蚤, 复检透明标本后我们认为形态鉴别无误, 但它却和共和双蚤聚为一支。关于这些形态极其相似、地理分布相近的蚤种分类, 建议今后在形态分类基础上开展多基因分子标记, 尤其是线粒体基因和核基因联合标记研究, 以便精准分析种群遗传多样性和系统进化发育。

综上所述, 尽管DNA条形码鉴定技术前景非常乐观, 但目前分子鉴定技术的正确做法还是应以传统分类法为基础, 保证分类物种为纯种且鉴别正确, 在此基础上测定的COI基因序列才能作为该物种的DNA条形编码。并尽可能留存凭证标本, 以供其他学者对形态数据和基因数据进行相关研究时做一参比。