引用本文
刘益萍, 庞慧, 万康林, 弓艳娥, 郭旭霞, 王艳霞, 刘海灿. 127株结核分枝杆菌基因分型及耐药相关研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2018,34(12): 1119-1125
LIU Yi-ping, PANG Hui, WAN Kang-lin, GONG Yan-e, GUO Xu-xia, WANG Yan-xia, LIU Hai-can. Genotyping and drug resistance of 127 strains of Mycobacterium tuberculosis [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2018,34(12): 1119-1125.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.201
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中国人兽共患病学报
127株结核分枝杆菌基因分型及耐药相关研究
刘益萍1, 庞慧2, 万康林3, 弓艳娥4, 郭旭霞4, 王艳霞4, 刘海灿3
1.长治医学院人体寄生虫学教研室,长治 046000
2.长治医学院免疫学教研室,长治 046000
3.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206
4.长治医学院附属和平医院检验科,长治 046000
通讯作者：庞慧,Email: panghuimail@126.com
收稿日期: 2018-02-06
资助项目: 山西省青年科技研究基金(No.2016021161); 山西省十三五教育科学规划项目(No.GH17047); 山西省大学生创新创业训练计划项目(No.2016303); 长治医学院大学生创新创业训练计划项目(No.D2017015); 山西省第二批继续教育项目(No.130308197)和长治医学院科技创新团队项目(No.CX201412)联合资助
摘要

目的研究山西省长治及周边地区结核分枝杆菌的基因多态性及基因型与耐药的相关性。方法 收集结核分枝杆菌临床分离株,运用MLVA方法进行基因分型,对8种抗结核药物分别采用比例法进行药敏试验,应用 BioNumerics 5.0软件进行聚类分析。结果 15个位点中Mtub21、MIRU26和ETRE多态性较高 (HGI>0.6),MIRU40、ETRB、MIRU16、ETRD、MIRU23和ETRC位点多态性较低(HGI<0.3)。127株结核分枝杆菌共分为11个基因群102种基因型,90 株为独特型,基因群中Ⅰ群所占比例最大(80.31%)。127株菌株对一线和二线抗结核药物的总耐药率分别为47.24%和23.62%。一线药物中链霉素(40.94%)的耐药率最高,乙胺丁醇(6.30%)最低。二线药物中左氧氟沙星(14.17%)的耐药率最高,丙硫异烟胺(3.15%)最低。链霉素的单耐药率最高(11.81%);耐多药率为21.26%(27/127);广泛耐多药率为3.15%。Ⅰ群菌株的耐药率与其它菌株的差别无统计学意义。结论 初步证实山西长治及周边地区的结核分枝杆菌具有明显的多态性,Ⅰ群为主要流行群。结核分枝杆菌对二线药物的敏感性高于一线药物。主要流行菌株Ⅰ群菌株与耐药无明显的相关性。

关键词: 结核分枝杆菌; 基因分型; MLVA; 药敏试验
中图分类号:R378.91 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)12-1119-07
Genotyping and drug resistance of 127 strains of Mycobacterium tuberculosis
LIU Yi-ping1, PANG Hui2, WAN Kang-lin3, GONG Yan-e4, GUO Xu-xia4, WANG Yan-xia4, LIU Hai-can3
1. Department of Medical Parasitology, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China
2. Department of Immunology, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China
3. State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
4. Department of Inspection, Heping Hospital Affiliated to Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China
Corresponding author: Pang Hui, Email: panghuimail@126.com
Fund:Supported by the Science Foundation for Youths of Shanxi Province (No. 2016021161), the Shanxi Education Science "Thirteenth Five" Planning Issue (No. GH17047), the Innovation and Training Program for College Students of Shanxi Province (No. 2016303), the Innovation and Training Program for College Students of Changzhi Medical college (No. D2017015), the Second Batch of Continuing Education Program in Shanxi Province (No. 130308197), and the Changzhi Medical College Science and Technology Innovation Team Support Project (No. CX201412)
Abstract

To understand the genetic polymorphism and the correlation of genotype and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis ( M. tuberculosis) circulating in Changzhi and the surrounding area in Shanxi Province, multi-loci variable number tandem repeats (VNTRs) analysis (MLVA) were utilized for the genotyping of the clinical isolates and drug susceptibility test (DST) of the 8 antituberculosis agents was performed on the Lowenstein-Jensen (L-J) medium by the proportion method. The BioNumerics (Version 5.0) software was used for clustering analysis. The result showed that Mtub21, MIRU26 and ETRE revealed high polymorphism (Hunter-Gaston Index, HGI>0.6). MIRU40, ETRB, MIRU16, ETRD, MIRU23 and ETRC showed low polymorphism (HGI<0.3). The 127 M. tuberculosis strains were divided into 11 groups of which the groupⅠ accounting for the largest percentage of 80.31% and 10.genotypes including 90 idiotopes. The drug resistance of the first-line antituberculosis agents and the second-line antituberculosis drugs were 47.24% and 23.62%. Among the first-line antituberculosis agents, streptomycin (SM) (40.94%) had the highest drug resistance, and ethambutol (EMB) (6.30%) was the best antibacterial agents against experimental strains. Of the second-line antituberculosis drugs, protionamide (PTH) (3.15%) was the good choice with the lowest drug resistance, and levofloxacin (LFX) (14.17%) had the highest drug resistance. The single drug resistance of streptomycin (11.81%) was the highest followed by isoniazid (2.36%), and we found that no strains were drug resistant for single rifampicin or single ethambutol. The 21.26% (27/127) were multi-drug resistant, and the 3.15% were widely multi-drug resistant. It’s no statistical significance that the difference of the drug resistance rate between the groupⅠ strains and other strains. In conclusion, it’s preliminarily confirmed that the M. tuberculosis has obvious genetic polymorphism and the group Ⅰ strains were popular in Changzhi and the surrounding area. The sensitivity to the second-line antituberculosis drugs was higher than that to the first-line antituberculosis drugs. It had no obvious correlation between the major epidemic strains groupⅠand drug resistance.

Key words: Mycobacterium tuberculosis; genotyping; multiple loci variable number tandem repeats analysis; drug susceptibility test

2017年发布的全球结核病报告显示, 2016年新发现大约1 040万结核病例, 印度、印度尼西亚、中国、菲律宾和巴基斯坦5个国家占56%[1]。利用结核分枝杆菌遗传标志物(具有遗传的稳定性和个体的多样性)对结核分枝杆菌临床分离株进行分型研究, 证实菌株的基因多态性, 以此了解结核病的流行病学特征、分析患者产生耐药的原因、推断病原演变情况等, 对于防治结核病具有重要的意义[2, 3]。基于PCR技术的MLVA方法, 由于其特异性高、分辨率强、效果明显、操作简单方便和重复性好, 美国疾病控制和预防中心推荐其为首选的结核杆菌基因分型方法[3]。因为在不同区域VNTR位点及位点组合有差异性, 所以各个实验室都在尽力寻找适合当地的位点。本研究采用MLVA技术, 选取15个VNTR位点对山西省的127株结核分枝杆菌进行基因分型及药敏试验, 以初步了解山西长治及周边地区结核分枝杆菌分子流行病学特征及耐药性, 为山西省预防和治疗结核病提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 菌株

127株结核分枝杆菌菌株分别分离自长治市、晋城市和临汾市的临床患者痰标本, 其中长治106株, 晋城20株, 临汾1株。患者年龄16~90岁, 平均44岁; 男80例(63%), 女47例(37%); 农民75例(59.06%), 学生14例(11.02%), 其他38例(29.92%)。长治医学院附属和平医院微生物学实验室负责菌株的培养、鉴定和保存。菌株H37Rv作为参照标准(中国疾病预防控制中心提供)。

1.2 主要仪器与试剂

MasterMix(Beijing TsingKe Biotech Co., Ltd)、DL l 000 DNA Marker(Takara)、GoldenView(Aidlab Biotechnologies Co., Ltd)、琼脂糖、PCR扩增仪、凝胶成像仪及BioNumerics 5.0 分析软件。

1.3 基因分型

依据参考文献选取15个VNTR位点[2, 4, 5, 6, 7](表1)。

表1 15个位点的引物、H37Rv重复单元和扩增片段的长度及重复次数 Tab.1 Primers of 15 locus and the size of repeat, the size of PCR product and the number of repeats of H37Rv strain

表1 (续)

DNA提取:收集适量经Lowenstein Jensen(LJ)培养基培养的菌体于400 μ L蒸馏水悬菌, 10.℃金属浴灭活裂解30 min, 14 000 r/min的速度离心10 min, -20 ℃保存上清液以备用。

PCR:混合物总体积为25 μ L:DNA模板1 μ L, 上游引物1 μ L, 下游引物1 μ L, 2× Taq DNA酶13 μ L, 三蒸水9 μ L。PCR反应条件:预变性94 ℃ 10 min, 变性94 ℃ 1 min, 退火56 ℃ 1 min, 延伸72 ℃ 1 min, 共35个循环, 最后延伸72 ℃ 10 min。PCR产物在4 ℃保存。

琼脂糖凝胶电泳:取5 μ L扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳(含5 μ L/10.mL Golden View), 置于紫外凝胶成像仪下观察结果, 与DNA marker进行比较, 估测PCR扩增产物的相对分子质量。实验中以H37Rv作为阳性对照。

1.4 药敏试验

对8种抗结核药物分别采用比例法进行药物敏感性试验。培养基中8种药物的终浓度分别为异烟肼(INH)0.2 μ g/mL, 利福平(RFP)40 μ g/mL, 乙胺丁醇(EMB)2 μ g/mL, 链霉素(SM)4.0 μ g/mL, 卡那霉素(KN)30 μ g/mL, 丙硫异烟胺(PTH)40 μ g/mL, 对氨基水杨酸(PAS)1.0 μ g/mL, 左氧氟沙星(LFX)4.0 μ g/mL[5]。耐药标准:含药培养基与对照培养基的菌落数相比, 小于l%为敏感, 大于或者等于l%为耐药[5]。

1.5 数据分析

每株菌株的PCR扩增条带均与H37Rv比较, 确定每株菌株各个VNTR位点重复单元的重复次数, 计算Hunter-Gaston指数(HGI)分析各位点的分辨能力。采用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析, 聚类方式用平均连锁聚类法(UPGMA), 根据cluster-cutoff值差异进行基因分型。采用统计软件SPSS l7.0进行统计分析, 运用χ 2检验或Fisher确切概率法进行组间差异比较, P< 0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 基因多态性和聚类分析

运用MLVA方法对127株结核分枝杆菌进行基因分型, DNA指纹图谱显示不同菌株表现出明显的基因多态性。15个VNTR位点中, Mtub21、MIRU26 和ETRE位点多态性较高(HGI> 0.6); MIRU10.ETRA、MIRU27、Mtub39 、Mtub30和MIRU39位点呈中等程度的多态性(0.3< HGI< 0.6); MIRU40、ETRB、MIRU16、ETRD、MIRU23和ETRC位点多态性较低(HGI< 0.3)(表2)。127株菌株共分为11个基因群, 其中Ⅰ 群所占比例最大, 含102菌株, 占80.31%; 其它菌株呈散在分布, Ⅵ 群含13菌株, 占10.24%, Ⅷ 群含3菌株, 占2.36%, Ⅸ 群含2菌株, 占1.57%, Ⅱ 群、Ⅲ 群、Ⅳ 群、Ⅴ 群、Ⅵ 群、Ⅹ 群和Ⅺ 群各含1菌株, 各占0.79%。127株菌株包括102种基因型:90 株为独特型, 占88.24%; 其余37株表现为12种基因型, 成簇数为12, 占29.13%(37/127), 最多的一簇有8株, 占(6.30%), 其次的一簇有6株, 占4.72%, 其它簇有2~3株, 占1.57%~2.36%(图1)。 H37Rv的基因型不同于所有临床分离株。

图1 127株菌株MLVA基因分型聚类分析Fig.1 Clustering analysis of 127 strains by MLVA

表2 15个VNTR位点的Hunter-Gaston指数 Tab.2 Hunter-Gaston Index of 15 VNTR loci

2.2 药敏试验

根据临床实验室标准化协会(CLSI)标准对127株结核分枝杆菌进行药物敏感性试验[8]。实验结果显示:127株菌株对一线和二线抗结核药物的总耐药率分别为47.24%和23.62%。一线抗结核药物的耐药率:链霉素(40.94%)最高, 依次是异烟肼(32.28%)、利福平(24.41%), 乙胺丁醇(6.30%)最低; 二线抗结核药物的耐药率:左氧氟沙星(14.17%)最高, 其次是卡那霉素(8.66%)、对氨基水杨酸(7.09%), 丙硫异烟胺(3.15%)最低。链霉素的单耐药率最高(11.81%), 其次是异烟肼(2.36%), 未发现利福平和乙胺丁醇的单耐药菌株; 耐多药率为21.26%(27/127), 其中有5株(3.94%)菌株对四种药物同时耐药; 广泛耐多药率为3.15%(表3)。

表3 127株菌株的耐药情况 Tab.3 Drug resistance of 127 strains
2.3 基因型与耐药的关系

Ⅰ 群菌株与其它菌株对一线和二线药物的总耐药率、一线和二线药物的耐药率、单耐药率、耐多药率、广泛耐多药率如下。Ⅰ 群菌株与其它菌株的耐药率进行比较, 两者间的差异无统计学意义(α =0.05)(表4)。

表4 不同基因型菌株的耐药性比较 Tab.4 Drug resistance comparing in different genotype among strains
3 讨 论

MLVA基因分型方法有很多优点, 不仅特异性高、稳定性强, 且操作简便、重复性好, 检测结果还可以数字表示, 不同实验室之间可相互进行比较。

本研究采用15个VNTR位点对山西省的127株结核分枝杆菌进行基因分型, 结果显示Mtub21、MIRU26和ETRE对于分析山西省的结核分枝杆菌有较高的多态性; MIRU40、ETRB、ETRD、MIRU23、 ETRC的多态性较差。先前研究发现, 在北京[9]QUB11b、Mtub21、MIRU39和MIRU16的多态性较高, 青海省[4]菌株中多态性最好的是MIRU26, 徐州[5]结核分枝杆菌的实验过程中发现MIRU26和Mtub21多态性较好, 西藏地区[10]主要是MIRU31、Mtub21和ETRE多态性较高, 四川地区[11]QUB11b和MIRU26的多态性较好, 在韩国MIRU26和ETRE的区分力较高[12], 提示不同地区VNTR位点的多态性不同, Mtub21、MIRU26和ETRE位点在实验菌株的分析方面发挥着重要作用。127株菌株分为11个基因群, 以Ⅰ 群菌株(80.31%)为主, 说明这些菌株属于亲缘关系很近的同一个克隆系, 可能为山西长治及周边地区的主要流行菌株, 应加强对这类菌株的研究[13]。

耐药结核病的流行, 尤其是耐多药患者增多, 病程漫长, 传染风险极高, 是我国结核病疫情居高不下的重要原因[14]。2010年开展的全国结核病流行病学调查显示:一线、二线药物的总耐药率为36.8%和24.6%, 耐多药率6.8%[15]。

本次研究结果:一线药物的总耐药率为47.27%, 耐多药率为21.26%, 显然高于2010年全国调查结果, 表明长治及周边地区结核病耐药状况仍然比较严重。一线药物中链霉素的敏感性较低, 乙胺丁醇的敏感性较高, 二线药物中左氧氟沙星的敏感性较低。链霉素是广谱抗生素, 必须与其它药物联合使用, 但因其对神经和肾的副作用, 很多患者不按标准方案用药或中途停药, 部分医生用药不规范, 是造成链霉素耐药的重要因素[16]。因左氧氟沙星利于痰菌转阴、影像学疗效改善和不良反应少, 成为治疗耐多药肺结核的最佳辅助选择, 但氟喹诺酮类药物对其它致病菌较强的杀菌作用而被普遍使用, 增加了它的耐药率[16, 17]。一线药物中链霉素和异烟肼的单耐药率较高, 未发现利福平和乙胺丁醇的单耐药菌株, 二线药物的敏感性高于一线药物。临床用药建议:充分发挥利福平和乙胺丁醇的作用, 规范地联合用药, 特别是对于一线药物高度耐药的菌株联合二线药物进行治疗, 以避免耐药性的产生[18, 19]。应加大耐药结核特别是耐多药结核的监控力度, 继续加强菌株培养和药敏试验, 根据实验结果制定合理的化疗方案或调整方案[20]。对患者进行随访追踪, 监督指导, 以提高用药的依从性。

Ⅰ 群菌株(主要流行菌株)与其它菌株对一线、二线药物的总耐药率、一线和二线药物的耐药率、单耐药率、耐多药率及广泛耐多药率进行比较, 两者间的差异无统计学意义, 表明主要流行菌株与耐药性无明显相关性。

本实验标本量有限, 在今后的研究中, 我们需不断地加大样本量, 并且结合其它的分型方法— — Spoligotyping来共同分析基因型与耐药之间的关联性。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] WHO. Global tuberculosis report 2017 [EB/OL]. [2017-10-30]. http: //www. who. int/tb/publications/global_report/zh/. http://www.who.int/tb/publications/global_report/zh/ [本文引用:1]
[2] 曹晓慧, 刘志广, 赵秀芹, 等. 220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2008, 24(5): 412-417. [本文引用:2]
[3] 李道群, 夏雪山, 宋玉竹, 等. 结核分枝杆菌分子分型技术的研究和应用[J]. 中国人兽共患病学报, 2016, 32(1): 76-82. DOI: DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.016 [本文引用:2]
[4] 李斌, 刘海灿, 王兆芬, 等. 青海省结核分枝杆菌临床分离株可变数目串联重复序列基因多态性研究[J]. 中华流行病学杂志, 2015, 36(10): 1158-1161. DOI: DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.10.026 [本文引用:2]
[5] Pang H, Tong J, Liu HC, et al. Molecular characterization and drug-resistance of Mycobacterium tuberculosis strains in Xuzhou, China[J]. Bio Environ Sci, 2014, 27(12): 960-964. DOI: DOI:10.3967/bes.2014.136 [本文引用:4]
[6] 李君莲, 刘洁, 鱼栓民, 等. 新疆结核分枝杆菌临床分离株VNTR基因型的初步研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2010, 26(12): 1105-1109. [本文引用:1]
[7] Liu J, Tong C, Liu J, et al. First insight into the genotypic diversity of clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Gansu Province, China[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e99357. DOI: DOI:10.1371/journal.pone.0099357 [本文引用:1]
[8] Clinical and Laboratory Stand ards Institute. Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae, and other aerobic actinomycetes; approved stand ard-second edition[S]. CLSI Document, 2011, M24-A2. [本文引用:1]
[9] Liu Y, Tian M, Wang X, et al. Genotypic diversity analysis of Mycobacterium tuberculosis strains collected from Beijing in 2009, using spoligotyping and VNTR typing[J]. PLoS One, 2014, 9(9): e106787. DOI: DOI:10.1371/journal.pone.0106787 [本文引用:1]
[10] 石荔, 范昕建, 万康林. 多位点可变串联重复序列技术用于西藏地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究[J]. 中华流行病学杂志, 2007, 28(5): 477-481. [本文引用:1]
[11] 陈志, 陈佳, 段晋超, 等. 绵阳地区79株结核分枝杆菌的基因型特征研究[J]. 中华微生物学与免疫学杂志, 2011, 3(3): 200. DOI: DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2011.03.002 [本文引用:1]
[12] Shamputa IC, Lee J, Allix-Béguec C, et al. Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from a tertiary care tuberculosis hospital in South Korea[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(2): 387-394. DOI: DOI:10.1128/JCM.02167-09 [本文引用:1]
[13] 蒋毅, 张丽水, 赵秀芹, 等. MLVA技术用于福建105株结核分枝杆菌基因分型的初步研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2007, 23(1): 1-4. [本文引用:1]
[14] 李心德. 174株耐多药结核分枝杆菌对二线抗结核药耐药情况分析[J]. 国际检验医学杂志2014, (13): 1732 -1733, 1748. DOI: DOI:10.3969/j.issn.1673-4230.2014.13.028 [本文引用:1]
[15] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组, 全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室. 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J]. 中国防痨杂志, 2012, 34(8): 485-508. [本文引用:1]
[16] 陈丽峰, 周菁, 陈军, 等. 武汉市1561例结核患者的耐药性分析[J]. 临床肺科杂志, 2014, 19(9): 1638-1640. DOI: DOI:10.3969/j.issn.1009-6663.2014.09.028 [本文引用:2]
[17] 季登英, 张燕, 马欣慧. 左氧氟沙星辅助抗结核药物治疗耐多药肺结核的临床疗效[J]. 临床合理用药, 2015, 8(9): 14-15, 18. DOI: DOI:10.15887/j.cnki.13-1389/r.2015.27.007 [本文引用:1]
[18] Li Y, Cao X, Li S, et al. Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from Hebei, China: genotypes and drug susceptibility phenotypes[J]. BMC Infect Dis, 2016, 16: 107. DOI: DOI:10.1186/s12879-016-1441-2 [本文引用:1]
[19] 庞慧, 李桂莲, 万康林, 等. 34株慢速生长非结核分枝杆菌针对一线和二线抗结核药物的敏感性试验研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2015, 31(10): 914-918. DOI: DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.004 [本文引用:1]
[20] 赵丽芬, 刘延梅. 2013-2015年西安市胸科医院结核分枝杆菌的耐药性分析[J]. 现代药物与临床, 2015, 30(12): 1542-1545. DOI: DOI:10.7501/j.issn.1674-5515.2015.12.026 [本文引用:1]