辽吉两省部分鹿场鹿茸皮肤病的临床特征与真菌分离初探
黄清荣1, 褚文辉2, 魏海军2, 程世鹏2, 孙娜2, 朱洪伟1,2
1. 鲁东大学生命科学学院,烟台 264025
2. 中国农业科学院特产研究所,长春 130112
通讯作者:孙娜,Email:sunna@caas.cn;
摘要
目的 研究探讨生茸期梅花鹿、马鹿在鹿茸快速生长期常发生以“白皮茸”、“痂皮茸”为主要症状的皮肤病。方法 研究对吉林、辽宁8个梅花鹿、马鹿养殖场的20份患病鹿进行了临床观察、血细胞计数、病理观察、病原分离及ITS分子鉴定。结果 发现本病仅侵染鹿茸皮肤表层、主要病变为结痂处真皮组织坏死、炎性细胞浸润; 血液中淋巴细胞、白细胞和中性粒细胞数变化不明显。对茸皮患处分离菌的鉴定结果表明68株分离株中44株属于半知菌亚门(64.7%), 24株属于酵母亚门(35.3%), 其中, 半知菌亚门的毛癣菌属、表皮癣菌属以及酵母亚门的念珠菌等可能为本病的条件致病菌。结论 鹿茸“白皮茸”、“痂皮茸”病均符合真菌皮肤病的发病特征,为该类疾病的预防及治疗提供了一定的参考。
关键词: 鹿茸; 真菌性皮肤病; 真菌分离; 种群多样性分布
中图分类号:R379 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)03-0213-04
Characterization and fungal community of antler dermophytosis in Jilin and Liaoning provinces
HUANG Qing-rong1, CHU Wen-hui2, WEI Hai-jun2, CHENG Shi-peng2, SUN Na2, ZHU Hong-wei1,2
1.School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China
2. Institute of Special Economic Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China
Corresponding authors: Sun Na,Email: sunna@caas.cn; Zhu Hong-wei,Email: zhuhongwei@caas.cn
Abstract

Dermophytosis is a common fungal disease that affects fast-growing antlers of sika deer ( Cervus nippon) and red deer ( Cervus elaphus), causing the so-called ‘white-skin antlers’ and ‘crusted antlers’. Here we described the features of dermophytosis in deer antler observed from 20 affected deer from 8 farms in Jilin and Liaoning province by clinical findings, hematology, pathological examination and fungal species distribution. The fungal infection in the antlers as indicated by HE staining, affected only epidermis and the dermis layers, with the main lesion of necrosis of the dermis tissue and inflammatory infiltrate. Hematologic profile suggested the insignificant cell count change of lymphocyte, neutrophil, white blood cell between dermophytosis and healthy deer ( n=10). A total of 68 fungi isolates were then recovered from the antlers with dermophytosis, of which 64.7% (44/68) were identified as members within Deuteromycotina, the rest 35.3% (24/68) belonged to the Saccharomycotina. Notably, the well-known opportunistic pathogen, including species within Trichophyton, Epidermophyton as well as Candida albican, might account for the dermophytosis of deer antler. In conclusion, ‘white-skin antlers’ and ‘crusted antlers’ are high likely caused by opportunistic fungi.

Keyword: deer antler; dermophytosis; fungal isolation; fungal species diversity

鹿茸是雄性鹿科动物未骨化的幼角, 其内部为骨质、血管和神经, 表面覆以茸皮、生有茸毛, 是一种贵重的中药[1, 2]。鹿茸的部位, 形状及品相对其销售价格影响很大。鹿茸皮肤病一般多由真菌感染或合并继发细菌感染引起的一种传染性疾病, 该病可不同程度的破坏鹿茸品相, 影响其销售价格[3]。此外, 鹿茸皮肤病可传染给人类, 发生体癣、股癣、手足癣等皮肤癣疾, 给鹿类养殖、鹿茸加工的从业人员及消费者带来一定的公共卫生隐患。近年来, 吉林省和辽宁省多个鹿场发生了以“ 白皮茸” , “ 痂皮茸” 为主要症状的皮肤病, 给养殖户造成一定的经济损失。本研究对辽吉两省8个梅花鹿、马鹿养殖场的20份患病鹿进行了经过临床观察、病原分离鉴定, 发现半知菌亚门的毛癣菌属、曲霉菌属和表皮癣菌属的菌株分离率较高, 为该病的预防及治疗提供了一定的理论参考。

1 材料与方法
1.1 材料

VetScan HM5血液分析仪为Abaxis公司产品; 正置显微镜为Leica公司产品; ExTaq DNA聚合酶、dNTP等相关试剂为TaKaRa公司产品; 多聚甲醛及病理观察成套试剂均为SIGMA-Aldrich公司产品。

1.2 方法

1.2.1 临床观察 通过鹿场饲养人员口述及现场症状观察, 对发病鹿只进行临床症状总结, 留存发病图片。

1.2.2 白细胞计数 选取患病和健康梅花鹿各10只, 采取外周抗凝血, 应用VetScan HM5血液分析仪对白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYM)和中性粒细胞(NEU)分别进行细胞计数并进行统计分析(Student's t test)。

1.2.3 病理学观察 选取发病鹿只患处皮肤材料, 磷酸盐缓冲液(PBS)洗去血污, 4%多聚甲醛固定后, 苏木精-伊红染色法 (Hematoxylin-Eosin, HE)染色、显微镜下观察结果。

1.2.4 真菌分离 患病的鹿只麻醉后, 用75%酒精擦拭患处, 小心刮取结痂和茸皮, 研磨后用PBS制备10%悬液, 低速瞬时离心后取少量上清涂布于沙氏琼脂培养基(Sabouraud dextrose agar, SDA), 28 ℃培养48 h~72 h后, 观察菌落大小、形态, 显微观察菌丝和孢子形态, 小心挑取单菌落, 接种于新鲜SDA培养基, 进行纯培养。

1.2.5 真菌鉴定 取适量真菌培养物, 加液氮研磨, 研磨后的菌体加入500 μ L 2× CTAB裂解液(2% CTAB, 100 mmol/LTris-Cl, 20mmol/L Na2EDTA, 1.4 mol/L NaCl, pH8.0), 65 ℃水浴1 h, 酚: 氯仿: 异戊醇(25: 24: 1)抽提2次, 乙醇沉淀, 70%乙醇洗涤后离心沉淀DNA[4, 5], 以此DNA为模板, 以ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')为引物, 扩增真菌核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列[6]。PCR反应条件为94 ℃预变性2 min、随后进行30个循环的94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s以及72 ℃延伸1 min的扩增反应, 反应获得的扩增产物直接测序, 经BLAST检索后, 得到相应分离菌的种属分类[7]

2 结 果
2.1 临床症状

“ 白皮茸” 病以鹿茸色素脱失、茸皮白化、起鳞状皮屑和结痂为特征。病鹿患病初期一般多从鹿茸顶端发起, 患处皮肤呈现条状, 浅粉色或白色, 边界清晰(图1E)。患处可渐进性发展, 无脓无疱, 可出现鳞状皮屑(图1F), 伴瘙痒感, 患病鹿可出现触碰鹿茸现象, 如无外伤破损, 一般不形成结痂、无组织液渗出、无化脓现象。“ 痂皮茸” 病以鹿茸瘙痒, 茸皮上呈圆形小疱、溃疡和结痂为特征(图1A、1B)。患病初期茸皮表面出现干性丘状小疱疹, 有瘙痒症状, 疱疹破溃后形成结痂, 严重可形成大块干性结痂(图1C, 1D)。不断的炎性刺激使茸皮增厚、色素沉着、伴有湿性组织液或脓液。严重感染的病例整副鹿茸主干受损严重。患病鹿一般无其他临床症状。未发现本病对鹿茸的茸形和生长速度有影响。

图1 鹿茸皮肤真菌感染的临床症状Fig.1 Clinical findings of deer antler withdermophyte fungi infection

2.2 白细胞数变化

对患病鹿(n=10)和健康鹿(n=10)外周血进行血细胞计数分析, 选取淋巴细胞、白细胞和中性粒细胞分别进行细胞数的t检验分析(图2)。结果显示, 健康组与患病组梅花鹿淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(NEU)和白细胞(WBC)数量t检验的P值分别为0.319、0.239和0.865, 均大于0.05, 说明在以上3种细胞没有显著差异, 即患病对这3种血细胞数目不会产生明显影响。

图2 患鹿茸皮肤病与健康梅花鹿淋巴细胞、中性粒细胞、白细胞计数(n=10)Fig.2 LYM, NEU and WBC cell count of the healthy deer and dermophyte fungi infected deer in antler (n=10)

2.3 皮肤病灶病理学

观察发现患病鹿茸仅皮肤层受累, 间质层、软骨和骨质层无可见病理学改变。正常鹿茸茸皮由表皮和真皮层组成, 真皮层含有大的皮脂腺和毛囊(图3A), 感染真菌的愈伤茸皮外侧, 表皮细胞由附近的正常茸皮迁徙至结痂下, 形成新生茸皮, 但表皮下的真皮层未发现皮脂腺和毛囊(图3B); 愈伤茸皮内侧, 内部结痂与真皮交界面(结痂脱落面)出现坏死的组织, 为表皮的迁徙及茸皮的新生奠定了基础(图3C); 愈伤茸皮的里侧, 出现由单核细胞组成带状结构, 为未来结痂的脱落面(图3D)。

图3 患真菌性皮肤病的茸皮处病理变化(HE染色, 标尺为1 000 nm)Fig.3 Pathological findings of the antler skin infected with dermophyte fungi (HE staining with the scale bar of 1 000 nm)

2.4 真菌鉴定结果

从患病鹿茸皮肤共分离到了68株真菌, 经26S rDNA D1/D2区以及ITS基因测序结果表明, 这些真菌共分为10个种, 分别为白色念珠菌(Candida albicans)8株、克柔念珠菌(C. krusei)2株、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)14株、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes) 9株、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)7株、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa) 5株、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 2株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)12株、白色隐球菌(Cryptococcus albidus) 8株、黄曲霉(A. flavus)1株。检测鹿场的位置信息及分离株分布见表1

表1 本研究涉及鹿场及分离菌株信息 Tab.1 Detail information of the farm, deer and isolates used in this study
2.5 患病鹿茸真菌种群分布

对患病鹿茸真菌种群分布分析(图2)发现, 患病鹿茸皮肤病料的真菌菌群复杂, 多为环境常在菌和条件致病菌, 分离到的68株真菌分类上属于半知菌亚门(Deuteromycotina)和酵母亚门(Saccharomycotina), 其中半知菌亚门分离菌, 包括毛癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、曲霉菌属(Aspergillus)和隐球菌属(Cryptococcus)占总分离菌株数的64.7%(44/68), 而毛癣菌属和表皮癣菌属的分离株而酵母亚门的分离菌包括白色念珠菌、克柔念珠菌、毕赤酵母、酿酒酵母占总分离菌株数的35.3%(24/68)。没有分离到其他亚门的真菌菌株。具体的菌株的分离率如图4所示, 经分析发现这68不同菌株不具有地域特异性。

图4 鹿茸皮肤真菌病分离株的分离率饼图Fig.4 Sector graph of the isolates recovered from deer antlers with dermophytosis

3 讨 论

鹿茸真菌病因鹿茸药食同源以及真菌的人兽共患等特征应引起研究者和从业者的足够重视, 然而多年来, 鹿茸真菌病的发病特征以及真菌分布方面的研究鲜有报道。基于此, 本研究在该病集中发病季节, 对辽、吉两省部分鹿场梅花鹿、马鹿鹿茸真菌病的流行特征、临床症状、病理变化、真菌的分离及鉴定等方面进行了系统的研究。研究发现该病仅发生于生茸期公鹿, 呈散发、偶发性流行, 发病率低, 约占公鹿数的1%~3%。各锯龄的生茸公鹿均可发病, 以三叉茸和畸形茸(怪角茸)多发, 一般来说“ 白皮茸” 病发病率低, 病程长, 疾病呈渐进式发展, 最长的可伴随整个生茸期, 而 “ 痂皮茸” 病具有发病率高, 传播快的特点。

除此之外, 本病的发病还具有以下特征:1)发病部位均位于鹿茸, 尤其是鹿茸嘴头、主干和梅枝上半段(图1), 推测可能是此处鹿茸生长迅速, 血管丰富, 血液循环快速, 为真菌的繁殖提供了某种(些)特殊的生长因子或定植因子; 2)鹿茸真菌病不引起血液中淋巴细胞、中性粒细胞和白细胞显著性改变, 这一结果与人类真菌感染患者的血常规检验结果一致, 说明真菌感染在不同物种中具有一定的相似性; 3)发病季节多为鹿茸萌发和快速生长期, 一般为5-8月集中发病。较高的温、湿度可促进本病的发生, 例如2016年吉林省6月平均降水量比常年同期高37%, 降水偏多(吉林省气象局2016年6月农业气象月报:http://www.jlqx.gov.cn/ydqhbh/kjcx/201607/t20160704_2318296.html), 同时期的辽宁省北部也出现类似情况, 临床发病率急剧升高, 约为往年平均发病率的2-3倍。因此, 保持圈舍干燥, 防雨排水可一定程度上降低本病的发生。

病理观察结果显示, 发病鹿茸的病变只限于真皮, 未扩散到皮下组织, 说明鹿茸“ 白皮” 和“ 痂皮” 病均为皮肤浅表真菌感染, 这一点与以前研究结果一致。由于感染常伴有皮肤瘙痒, 患病鹿不断刮蹭茸皮致其破溃、出血、愈伤茸皮内出现了带状结构的结痂脱落面形成结痂, 即形成痂皮茸。但由于皮肤真菌的存在, 刺激炎性细胞(巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等)在结痂处皮肤层聚集, 形成炎性细胞浸润, 腺体破坏严重, 表皮下的真皮层中缺乏形成皮脂腺和毛囊, 创口无法愈合(图2)。

鹿茸真菌病多年来未引起足够的重视, 但我们不能忽视该病的公共卫生安全隐患。首先, 在鹿茸收割、加工环节, 可传播给从业者, 使其患真菌性皮肤癣疾, 本研究分离率最高的絮状表皮癣菌(21%), 宿主可为人类、野生动物或宠物, 该菌偏好感染人的皮肤与指甲, 造成足癣、体癣、股癣或甲癣[8]。其次, 本研究分离到多株可致深部感染的致病菌或条件致病菌如烟曲霉、白色隐球菌、库德里阿兹威毕赤酵母等, 这些菌可在适合条件下引起人或动物的肺脏、肝脏、脑组织等的感染[10, 11, 12]。目前在我国某些地区仍保留生食鹿茸、鹿血的饮食习惯, 给真菌深部组织感染创造了条件。合理处置患病鹿和鹿茸、做好个人防护措施, 改变生食鹿茸的饮食习惯, 能很好地降低本病传播给人的概率。

The authors have declared that no competing interests exist.

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