引用本文
张璐, 刘珍珍, 陈凯丽, 王荣军, 张龙现, 宁长申, 菅复春. 夹心ELISA检测微小隐孢子虫抗原方法的建立及初步应用[J]. 中国人兽共患病学报, 2018,34(3): 230-235.
ZHANG Lu, LIU Zhen-zhen, CHEN Kai-li, WANG Rong-jun, ZHANG Long-xian, NING Chang-shen, JIAN Fu-chun. Method establishment and preliminary application of sandwich ELISA for detecting Cryptosporidium parvum antigen [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2018,34(3): 230-235.  
DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.040
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中国人兽共患病学报
夹心ELISA检测微小隐孢子虫抗原方法的建立及初步应用
张璐1,2, 刘珍珍1,2, 陈凯丽1,2, 王荣军1,2, 张龙现1,2, 宁长申1,2, 菅复春1,2
1.河南农业大学牧医工程学院,郑州 450002
2.河南省人兽共患病国际联合实验室,郑州 450002
通讯作者:菅复春,Email: jfchun2008@163.com;
基金资助: 国家重点研发计划(No.2016YFD0500707),河南省科技厅基础与前沿研究项目(No.162300410166)联合资助
摘要
目的 建立检测隐孢子虫的夹心ELISA方法。方法 本试验以纯化的抗隐孢子虫IgG、IgY分别作为包被抗体和捕获抗体,棋盘滴定法确定夹心ELISA的最适工作条件。用基于18SrRNA的PCR方法评估饱和蔗糖溶液、饱和食盐水漂浮和PBST洗涤剂洗涤3种方法预处理样品对夹心ELISA检测效果的影响。结果 建立的夹心ELISA捕获抗体、抗原、检测抗体、酶标二抗最佳工作浓度分别是1:800、2.5 μg/mL、1:100和1:5 000,最适捕获抗体包被、抗原抗体反应、酶标二抗反应条件分别为37 ℃作用1 h后4 ℃过夜、37 ℃作用30 min、45 min;最适终止条件是2 mol/L H2SO4,50 μL/孔;TMB室温显色10 min;特异性试验结果显示仅可以检出隐孢子虫抗原,而与常见肠道寄生的球虫卵囊、圆线虫和蛔虫虫卵无交叉反应。批间和批内变异系数均小于10%。3种方法前处理粪便用于ELISA检测与nested-PCR检测结果总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%,以饱和蔗糖溶液漂浮法处理检测样品的效果最佳。与爱德士的隐孢子虫检测试剂盒比较,结果显示,本方法敏感性低于爱德士试剂盒的最低检出量(6×103个/mL),整个试验过程比试剂盒多用15 min,但特异性和重复性均一致,且本试验方法更加经济实用。结论 该方法简便,快速,灵敏,可用于临床粪样中隐孢子虫病原检测或隐孢子虫流行病学调查研究。
关键词: 隐孢子虫; 双抗体夹心ELISA; 检测
中图分类号:S855.9 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)03-0230-06
Method establishment and preliminary application of sandwich ELISA for detecting Cryptosporidium parvum antigen
ZHANG Lu1,2, LIU Zhen-zhen1,2, CHEN Kai-li1,2, WANG Rong-jun1,2, ZHANG Long-xian1,2, NING Chang-shen1,2, JIAN Fu-chun1,2
1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2.International Joint Research Laboratory of Zoonosis of Henan Province,Zhengzhou 450002,China
Corresponding author: Jian Fu-chun, Email: jfchun2008@163.com
Fund:Support by the National Key Research and Development Program of China (No.2016YFD0500707) and the Fundamental and Advanced Project of Henan Province (No.162300410166)
Abstract

We established the method of Sandwich ELISA to detect Cryptosporidium parvum antigen. Purified anti- Cryptosporidium IgG and IgY were used as a capture antibody and detection antibody respectively to develop sandwich ELISA. A checkerboard titration study was carried out to determine the optimal conditions of ELISA. The PCR based on 18SrRNA was used to evaluate the pre-treatment effect of three methods (saturated sucrose solution floating, saturated salt water floating and PBST detergent washing). The optimum concentration of coated antibody, antigen, detection antibody and enzyme-labelled antibody were 1:800, 2.5 μg/mL, 1:100 and 1:5 000 respectively. The coating condition, antigen antibody reaction, optimum reaction time of enzyme-labelled antibody were 4 ℃ through the night after 37 ℃, incubated at 37 ℃ for 30 min and 45 min respectively; the optimal termination condition was 2 mol/L H2SO4,50 μL/well; TMB developed 10 minutes at room temperature. The developed sandwich ELISA has no cross reaction with the eggs/oocyts of Nematode, Coccidium and Ascarid; coefficient of variation of intra-assay and inter-assay were all less than 10%. The results showed that the total coincidence rate of the three pre-treatment methods with nested PCR were 95.83%, 91.67% and 83.33%, respectively, and the Saturated Sucrose Floatation method was the best one among the three methods, the sensitivity of the method was lower than the Cryptosporidium detection kit of IDEXX (6×103/mL), and whole test process was longer than the kit. While, its specificity and reproducibility were consistent with that of IDEXX kit, and the developed method was more economical. The method is simple, rapid, sensitive, and can be used for clinical epidemiological investigation of Cryptosporidiosis or pathogen detection.

Keyword: Cryptosporidium; DAS-ELISA; detection

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的人兽共患肠道原虫, 其宿主范围十分广泛, 可感染包括人类在内的哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类等多种脊椎动物[1]。隐孢子虫多通过受污染的水源和食物等途径传播, 由其感染可导致以腹泻为主要临床症状的人兽共患原虫病[2]。免疫功能健全的宿主感染本虫后, 一般表现为自限性的短期急性腹泻; 而免疫力低下、免疫功能缺陷或抑制者则通常表现为持久的水样腹泻, 导致体液大量丢失而危及生命。该病已被确认为引起人腹泻的六大病因之一, 并被世界卫生组织(WHO)和美国疾病预防控制中心(CDC)列入新发传染病[3, 4]。隐孢子虫病的病原检测有形态学、免疫学和分子生物学等方法, 最常用的是检测粪便样品中的隐孢子虫卵囊[5]。粪便学检测主要有染色法、漂浮法和沉淀法, 这些方法具有操作简单、费用低等优点, 但是常规粪检有敏感性低、漏检率高等缺点[6, 7] 且需要检测人员有一定的检测经验。免疫学检测方法主要有免疫荧光、免疫印迹、免疫磁珠分离、流式细胞仪和间接血凝试验等, 因特异性高、敏感性强, 便于批量检测等优点, 被广泛应用于隐孢子虫病诊断中[8]。

本研究以兔抗微小隐孢子虫血清抗体(IgG)为捕获抗体, 以鸡抗微小隐孢子虫卵黄抗体(IgY)为检测抗体, 建立了双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用, 以期为微小隐孢子虫病的流行病学调查和诊断提供快速、简便的免疫学检测方法。

1 材料与方法
1.1 样品及试验用抗体来源

微小隐孢子虫卵囊由人工感染犊牛后纯化获得; 抗微小隐孢子虫IgG抗体、IgY抗体由本实验室制备。

1.2 仪器及试剂

超声波细胞粉碎仪:Cole.Parmer Instrument公司; 紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限公司; 漩涡振荡器:Scientific Industries INC; 全自动酶标仪:Thermo公司; HRP-兔抗鸡IgY:上海艾博抗贸易有限公司; 透析袋:北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司; Cryptosporidium parvum Antigen Test Kit(P00605-1): IDEXX公司。

1.3 抗原的制备

将提纯后卵囊(108/mL)置液氮(-196 ℃)和水浴锅37 ℃反复冻融5次, 超声波细胞粉碎仪(100HZ)2 min× 5次破碎后, 10 000 r/min离心15 min, 上清测定蛋白含量后作为检测用抗原[25]。

1.4 IgG和IgY的纯化

采集的血清抗体IgG参照文献[9]采用盐析法纯化血清抗体, 纯化后-20 ℃保存备用; 参照文献[10, 11]采用水稀释二步硫酸铵的方法纯化IgY抗体, 纯化后-20 ℃保存备用。

1.5 夹心ELISA方法的工作流程

以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释IgG后包被96孔酶标板, 100 μ L/孔, 同时设立阴性对照和空白对照各4个重复; 每孔加200 μ L封闭液, 反应后同上洗涤; 将待检抗原按最佳稀释倍数稀释, 100 μ L/孔, 37 ℃反应1 h后同上洗涤; 将IgY稀释至最佳工作浓度, 100 μ L/孔, 37 ℃反应1 h后同上洗涤; 加HRP标记的羊抗鸡IgG抗体, 100 μ L/孔, 37 ℃反应1 h后同上洗涤; 加新鲜配制的底物溶液, 100 μ L/孔, 室温避光; 加入终止液, 每孔50 μ L; 酶标仪读取OD450 nm值。

1.6 双抗体夹心ELISA最优条件的确定

1.6.1 捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度的测定 采用方阵滴定法确定IgG最适包被浓度和检测抗体IgY的最佳工作浓度。将纯化的IgG稀释为1: 100、1: 200、1: 400、1: 800、1: 1 600和1: 3 200等6个浓度进行包被, 每个浓度重复4孔, 4 ℃包被过夜。用1%明胶进行封闭, IgY也分别做1: 100、1: 200、1: 400、1: 800、1: 1 600和1: 3 200等6个浓度稀释, 每个稀释度重复4孔, 37 ℃孵育1 h。按照1.4夹心ELISA方法进行操作, 记录结果。选取相邻平均OD450 nm值出现较大变化并且P/N值达到最大的孔, 确定捕获抗体最适包被浓度和检测抗体最佳稀释度。

1.6.2 最佳包被条件的确定 将包被抗体IgG进行1: 800稀释后包被酶标板, 分别在以下3个条件下包被:37 ℃作用1 h后4 ℃过夜, 37 ℃作用2 h后4 ℃过夜, 4 ℃过夜, 筛选最优包被条件。

1.6.3 抗原最佳浓度的确定 将试验用抗原分别稀释为3 μ g/mL、2.5 μ g/mL、2 μ g/mL、1.5 μ g/mL和1 μ g/mL共5个浓度每个稀释度重复4孔, 每孔100 μ L, 37 ℃作用1 h后4 ℃过夜, 用1%明胶进行封闭1 h, 37 ℃孵育1 h。按照1.4夹心ELISA方法进行操作, 记录结果, 确定抗原最佳稀释度。

1.6.4 最佳(检测抗体)IgY作用时间 将检测抗体作用时间依次调整为15min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min和120 min, 确定最佳抗体作用时间。

1.6.5 最佳酶标抗体工作浓度的确定 96孔酶标板包被、封闭之后, 其它条件按上述的最佳条件进行, 对酶标抗体进行1 000、3 000、5 000、8 000和10 000倍稀释, 确定最佳稀释倍数。

1.6.6 最佳酶标抗体作用时间的确定 96孔酶标板包被、封闭之后, 检测抗体时间、最佳稀释度, 酶标抗体最佳浓度按上述的最佳条件进行, 将酶标抗体作用时间依次调整为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min和120 min, 确定最佳作用时间。

1.6.7 最佳显色时间的确定 96孔酶标板包被、封闭之后, 其它条件按上述的最佳条件进行。加底物液后, 分别避光显色5 min、10 min、15 min、20 min、30 min, 确定最佳显色时间。

1.7 夹心ELISA方法的评价

1.7.1 重复性试验 以批内和批间重复性试验来检验夹心ELISA方法的重复性, 选取3份卵黄抗体样本在不同时间、相同条件下重复做夹心ELISA测定, 每个样品重复3次, 计算同一份样本OD450 nm值的变异系数(CV), 比较试验结果。

1.7.2 特异性试验 采用优化后的夹心ELISA方法同步检测球虫卵囊、圆线虫和蛔虫虫卵, 检验该方法的特异性。

1.7.3 敏感性试验 将隐孢子虫卵囊抗原从5× 105个/mL开始做2倍连续稀释至7.5× 103个/mL, 共做7个稀释度, 其他条件不变, 按照已建立的夹心ELISA操作方法测定OD450 nm值, 检测其灵敏度。以出现阳性的最高稀释倍数推算出其最小检出量。

1.8 与隐孢子检测商品化试剂盒检测效果比较

按照1.7的方法, 用购于爱德士公司的隐孢子虫检测试剂盒检测。分别从特异性、重复性、敏感性、经济实用性和耗时等与本试验建立的方法作比较。

1.9 3种前处理方法检测效果比较

从长春某养殖场采集猪的粪便样品, 共108份(镜检均为隐孢子虫阴性)。取每份粪样5~10 g, 加适量自来水, 搅拌均匀, 用铜筛进行过滤, 滤液置离心管中以3 000 r/min离心10 min, 弃去上清。上述处理好的粪便样品分四组(分别为1、2、3、4), 每组27份并进行人工植入隐孢子虫卵囊, 每组分别按照10万, 5万, 2.5万…到5个卵囊/mL和104、103…10-1个卵囊/mL两种方式植入卵囊。

第1组用饱和食盐水漂浮法处理, 第2组用饱和蔗糖溶液漂浮法, 第3组用洗涤剂PBST洗涤处理, 第4组不再进行处理直接提取DNA, 基于18S扩PCR, 电泳检测扩增效果。

2 结 果
2.1 抗原蛋白含量的测定

紫外分光光度计测得试验用抗原蛋白含量为1.734 mg/mL。

2.2 夹心ELISA方法的建立

判定标准:选取阳性卵黄相邻OD450 nm值出现较大变化且P/N值达到最大的孔作为最佳条件的选择。

2.2.1 捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度的测定方阵滴定结果可知(表1), 捕获抗体IgG包被浓度为1: 800, 检测抗体IgY稀释度为1: 100时, OD450 nm接近于1.0, 且此时P/N最大, 故在ELISA检测方法中IgG包被浓度为1: 800, 被检样品的最佳稀释倍数为1: 100。

表1 血清最适包被浓度及阴、阳性IgY最佳稀释度的确定 Tab.1 Selection of the optional working concentration of coated antigen, negative and positive IgY

2.2.2 抗原最佳浓度的确定 由图1可知, 抗原最佳稀释浓度为2.5 μ g/mL。

图1 抗原佳稀释度的确定Fig.1 Selection of the optional working concentration of antigen

2.2.3 最佳包被条件的确定 最佳包被条件的选择结果如表2所示。试验确定最佳包被条件为37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜。

表2 最佳包被条件的确定 Tab.2 Selection of optimal coating condition

2.2.4 检测抗体IgY最佳作用时间 最佳检测抗体作用时间选择结果如图2所示。试验确定最佳检测抗体作用时间为37 ℃孵育30 min。

图2 IgY最佳反应时间的的确Fig.2 Selection of optimal reaction time of IgY

2.2.5 最佳酶标抗体工作浓度的确定 最佳酶标抗体工作浓度的选择结果如图3, 因此确定最佳酶标抗体工作浓度为1: 5 000稀释。

图3 最佳酶标抗体工作浓度的选择Fig.3 Optimination of anti-body dilution

2.2.6 酶标抗体最佳作用时间 最佳酶标抗体作用时间选择结果如图4所示。试验确定最佳酶标抗体作用时间为37 ℃孵育45 min。

图4 酶标抗体最佳反应时间的的确定Fig.4 Selection of optimal reaction time of enzyme labeled antibody

2.2.7 最佳显色时间的确定 最佳显色时间的选择如图5所示, 试验确定最终显色时间为室温显色10 min。

图5 最佳显色时间的确定Fig.5 Determination of substrate reaction time

2.2.8 最佳终止条件的确定 最佳终止条件的选择如表3所示, 试验确定最终终止条件为2 mol/L H2SO4, 每孔加入50 μ L。

表3 最佳终止条件的确定 Tab.3 Optimization condition of termination reaction
2.3 特异性试验

如表4所示, 对已知的球虫卵囊, 圆线虫和蛔虫虫卵作为抗原作1: 100稀释, 同时设隐孢子虫阳性对照和阴性对照, 每份样品重复4孔, 然后应用本试验建立的夹心ELISA检测方法进行测定。除阳性对照外, 结果均为阴性, 说明该夹心ELISA方法具有良好的特异性。

表4 特异性试验 Tab.4 Results of specificity test
2.4 敏感性试验

以图6所示, 将隐孢子虫抗原做7个2倍连续稀释, 按照已建立的夹心ELISA操作方法测定OD450nm值, 结果显示最低检出量为1.5× 104个/mL。

图6 敏感性试验Fig.6 Result of sensitivity Test

2.5 重复性试验

以图7, 表5所示, 以批内和批间重复性试验来检验夹心ELISA方法的重复性, 选取3份卵黄抗体样本在不同时间、相同条件下重复做夹心ELISA测定, 每个样品重复3次, 按照已建立的ELISA操作程序测定, 计算同一份样本OD450nm值的变异系数, 比较试验结果。结果显示, 随机的3个样品批内变异系数和批间变异系数在3.88%和8.82%之间, 均小于10%, 说明此检测方法重复性好。

图7 重复性试验Fig.7 Results of reproducibility test

表5 批内、批间重复性试验 Tab.5 Results of reproducibility test in the same and different batch
2.6 与隐孢子虫检测试剂盒的比较结果

本试验建立的夹心ELISA方法的整个试验过程比试剂盒多用15 min, 敏感性低于爱德士试剂盒的最低检出量(6× 103个/mL), 特异性和重复性和其保持一致。

2.7 初步应用结果

如表6所示, 提取好的DNA样品基于18S rRNA进行PCR扩增, 共有8份样品呈阳性。用建立好的夹心ELISA检测1、2、3三组样品分别检测出6、7、4 份显示隐孢子虫阳性。3种对粪便样品的处理方法与巢式PCR扩增方法的总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%。结果表明, 该方法可以用于临床样品检测, 且粪样在用ELISA方法检测前的处理采用饱和蔗糖溶液漂浮法效果较好。

表6 3种前处理方法夹心ELISA检测结果与PCR检测结果效果比较 Tab.6 Comparison of DAS-ELISA and RT-PCR in samples detection
3 讨 论

隐孢子虫具有广泛的宿主且多具有宿主特异性[12, 13]。由于隐孢子虫群体遗传存在较大的种内变异, 其不同亚型家族的传播方式不同, 有的可以通过人和反刍动物传播, 有的只是人-人传播[14, 15]。隐孢子虫病作为一种重要的人兽共患性原虫病, 目前尚无有效的治疗方法, 并且其检出率逐年增高[16, 17]。因此建立简便、特异、敏感的免疫学诊断技术, 对于人和动物隐孢子虫病的防控具有重要意义。比较理想的微小隐孢子虫的免疫学检测方法, 有较高的敏感性和特异性, 对其他寄生虫无交叉反应, 健康动物样品无假阳性; 方法简便易行, 可在基层推广应用[18]。夹心ELISA 是测定病原抗原的一种常用方法, 该检测方法灵敏度高、特异性强, 适合大量样品检测, 在多个领域都得到了广泛应用[19, 20]。在本研究中, 以纯化的兔抗隐孢子虫IgG和鸡抗隐孢子虫IgY为基础建立了检测隐孢子虫的夹心ELISA方法。经检测和其它虫种(球虫卵囊, 圆线虫和蛔虫虫卵)无交叉反应, 敏感性试验显示最低检测限为1.5× 104个/mL, 比杨红玉[21]建立的双抗体夹心ELISA检测安氏隐孢子虫的方法更为敏感。利用所建立的夹心ELISA 与巢式PCR同时检测临床样品, 二者的阳性符合率为95.83%。目前国外已有商品化试剂盒面世, 用于检测粪便样品中的隐孢子虫卵囊[22], 国内也有此方面的报道, 但未见有国产试剂盒面世。本次建立的方法与爱德仕试剂盒比较, 特异性和重复性均一致, 敏感性稍逊于爱德士试剂盒(分别为1.5× 104个/mL和6× 103个/mL), 但成本低廉。相信经过试剂的进一步优化和改进, 提高检出的灵敏度, 组装成试剂盒在临床推广应用为期不远。

The authors have declared that no competing interests exist.

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