引用本文
李潇, 周志超, 田新贵, 廖嘉仪, 樊晔. 中缅树鼩自然感染五种高致病性人腺病毒的血清流行病学分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2018,34(3): 243-247.
LI Xiao, ZHOU Zhi-chao, TIAN Xin-gui, LIAO Jia-yi, FAN Ye. Serum epidemiology of five strong pathogenicity human adenoviruses natural infection in Tupaia belangeri [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2018,34(3): 243-247.  
DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.033
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中国人兽共患病学报
中缅树鼩自然感染五种高致病性人腺病毒的血清流行病学分析
李潇, 周志超, 田新贵, 廖嘉仪, 樊晔
呼吸疾病国家重点实验室,广州医科大学附属第一医院,广州医科大学,广州 510010
基金资助: 广州市科技计划项目(No.201504010032),广东省自然科学基金项目(No.2016A030313572)联合资助
摘要
目的 分析中缅树鼩( Tupaiabelangeri, Tree Shrew)自然感染5种高致病性人腺病毒(Human Adenovirus, HAdv)的血清流行病学,以探讨人腺病毒感染树鼩的可能性。方法 采用固定病毒稀释血清法测定34份树鼩血清对Ad3、Ad4、Ad7、Ad14和Ad55的中和抗体水平。结果 4种B组腺病毒的中和抗体阳性率及中和效价较E组4型的大,阳性率由大到小依次为:Ad14(55.88%)、Ad3(47.06%)、Ad55(29.71%)、Ad7(14.71%)、Ad4(8.82%),树鼩血清主要表现为Ad3、Ad14和Ad55混合型多价抗血清。结论 中缅树鼩可自然感染5种人腺病毒,有望以树鼩为实验动物,建立一种成熟的人腺病毒感染模型。
关键词: 中缅树鼩; 自然感染; 人腺病毒; 血清流行病学
中图分类号:R373 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)03-0243-05
Serum epidemiology of five strong pathogenicity human adenoviruses natural infection in Tupaia belangeri
LI Xiao, ZHOU Zhi-chao, TIAN Xin-gui, LIAO Jia-yi, FAN Ye
State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510010, China
Fund:Supported by the Science and Technology Program of Guangzhou (No.201504010032) and the Natural Science Foundation of Guangdong Province (No.2016A030313572)
Abstract

In order to explore the possibility of human adenovirus infection with tree shrews, the neutralizing antibody titers of five kinds of human adenoviruses (HAdv) in the serum of tree shrews were analyzed. The levels of Ad3, Ad4, Ad7, Ad14 and Ad55 neutralizing antibody were detected by virus neutralization test. The results showed that the positive rate of four adenoviruses in group B were higher than Ad4 in group E, and the positive rates respectively were Ad14 (55.88%), Ad3 (47.06%), Ad55 (29.71%), Ad7 (14.71%) and Ad4 (8.82%). The antiserum mainly mixed with Ad3, Ad14 and Ad55 antibody. Five species of human adenovirus can be naturally infected with tree shrews. Tree shrews are used as experimental animals to establish human adenovirus infection model is alternative.

Keyword: tree shrew; natural infection; human adenoviruses; serum epidemiology

人腺病毒于1953年首次从手术切除的儿童腺体和扁桃体内分离、鉴定, 可感染呼吸道、泌尿生殖道及眼角结膜等多种粘膜组织, 引起多种疾病甚至死亡[1]。目前腺病毒已有A-G共7种68个腺病毒型别。其中B组人3、7、11、14、55和E组4型腺病毒是引起重症致死性肺炎的主要病原体[2]。由于人腺病毒具有严格的宿主专一性, 在常用的模型动物体内并不感染和复制, 目前国内外仍无其疾病动物模型, 因此人B组腺病毒感染相关的致病机制, 尤其是致重症机制, 以及不同型病毒间的重组机制等仍不清楚, 亟待研究。

中缅树鼩属哺乳纲, 有胎盘类, 攀鼩目, 树鼩科, 我国云南、广西、广东、海南岛均有分布。树鼩与灵长类亲缘关系接近, 其解剖结构、生化代谢及基因组方面与人具有较高的相似度, 远高于鼠、犬、猪等常用实验动物, 因此被认为是灵长类最亲密的近亲[3]。中国对树鼩的研究早见于教研学和动物学方面, 1975年首先进行医学上的尝试, 用于代替恒河猴作为小儿麻痹方面的实验。近年来, 昆明动物研究所对树鼩进行了全基因组测定和解析工作, 为树鼩应用于医学生物学方面提供了理论依据[4]。陈元鼎等人从树鼩粪便中检出具有低滴度的凝聚人O型、B型红细胞的腺病毒, 但至今仍未确定树鼩易感人源腺病毒[5]。鉴于树鼩已证实可感染多种人源病毒, 如多种肝炎、轮状、疱疹、棒状、副粘[6, 7, 8], 而且人腺病毒研究正困于缺乏合适的动物模型, 将树鼩应用于人腺病毒动物模型的建立是一个良好的研究方向。

为了探讨树鼩存在自然感染人腺病毒的可能性及分型, 本实验测定树鼩血清对B组人Ad3、Ad7、Ad14、Ad55和E组人Ad4的中和效价水平, 进而为后续探索人腺病毒的树鼩动物实验模型的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及标本采集树鼩购于昆明医科大学实验动物中心, 雌雄各半, 年龄均> 6月龄, 于P2动物实验室恢复性饲养1周后进行实验。于树鼩腿静脉处采集0.5 mL无抗凝血, 采集后对待测血液标本编号, 共34份样本。将血液标本在4 ℃冰箱内静置1 h, 3 500 r/min离心5 min, 收集血清, -80 ℃保存。

1.2 病毒和细胞系人293细胞系为本实验室保存。实验中使用的人腺病毒Ad3(GenBank:DQ099432)、Ad4(GenBank:KF006344)为本实验室分离和保存; Ad7(GenBank:JX625134.1)为重庆医科大学附属儿童医院惠赠; Ad14(GenBank:JQ824845.1)为南方医科大学张其威教授惠赠; Ad55(GenBank:KF911353.1)为中国科学院生物医药与健康研究院陈凌研究员惠赠。病毒在293细胞增殖, 并经氯化铯密度梯度离心法纯化, 测定TCID50, -80 ℃保存。

1.3 试剂PBS、DMEM培养基、胎牛血清、100× 细胞培养用青霉素、链霉素、0.25%含EDTA胰酶购自GIBCO公司。42.23%和22.39%氯化铯溶液(pH=8.0)为自行配置。

1.4 实验方法 1.4.1 病毒微量血清中和试验参照中华人民共和国卫生行业标准(WS214-2008, 附录B:微量中和试验操作步骤)和相关文献[9, 10, 11], 采用固定病毒稀释血清的方法进行。待测血清标本56 ℃灭活30 min, 以除去可能存在的非特异反应物。灭活后血清标本40 μ L用DMEM从1: 16开始作倍比稀释(从24-210), 即所产生的稀释倍数为1: 16, 1: 32, 1: 64, 1: 128, 1: 256, 1: 512, 1: 1 024。根据所测滴度, 用病毒维持液(含2%血清的DMEM)将病毒稀释为200 TCID50。取稀释好的待测血清及阳性血清与病毒稀释液等量混合(病毒稀释液终浓度为100 TCID50)。设定细胞对照、病毒对照组, 将阴性对照混合液、阳性对照病毒混合液、血清对照混合液、待测血清病毒混合液及病毒工作滴度检查混合液置于37 ℃水浴作用1 h。最后接种至前1 d预先铺满239细胞的96孔培养板中, 置37 ℃、5% CO2湿温培养箱孵育l h, 弃去接种物, 加入细胞维持液继续培养, 培养3 d后, 于显微镜下观察细胞病变, 读取结果。

以病毒对照组为对照, 待检样品可保护50%细胞的为阳性样品, 其保护50%细胞的最高稀释度为该样品的中和效价。

1.4.2 数据处理计数资料统计描述给出频数和百分比。SPSS 19.0进行统计分析, Fisher确切概率法检验血清中和抗体等级分布, P≤ 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5种腺病毒血清抗体阳性树鼩情况中和抗体出现于病毒感染的较早期, 在体内的维持时间较长, 动物体内中和抗体水平的高低, 可显示动物抵抗病毒的能力, 作为判断动物是否感染过该种病毒的指标。结果显示, 共有21份树鼩血清对5种主要流行的人腺病毒中的一种或多种具有中和作用, 发挥保护细胞的作用, 其中Ad14中和抗体的检出阳性率最高, 为55.88%(19/34), Ad3和Ad55的阳性率也较高, 分别为47.06%(16/34)和29.71%(10/34), 见表1。21份阳性样品中, 有6份为单价抗血清, 14份为多价血清, 见表2。

表1 树鼩抗血清中不同型别人腺病毒中和抗体阳性率 Tab.1 Positive rate of different type adenovirus antibody in tree shrews antisera
表2 树鼩中不同血清型中和抗体混合情况 Tab.2 Mixture of different type adenovirus antibody in tree shrews antisera

2.2 树鼩抗血清样本中和效价水平21份树鼩阳性抗血清根据抗体种类及水平排序, 见表3。阳性血清主要表现为Ad3、Ad14和Ad55的混合型多价抗血清。Fisher确切概率法检验血清中5种型别的中和抗体水平具有统计学差异(P≤ 0.05), 其中Ad3与Ad4、Ad4与Ad14、Ad7与Ad14的中和效价等级构成具有统计学差异(P≤ 0.005), 中和Ad3与Ad14的抗血清效价较高, 见图1。

表3 21份树鼩阳性抗血清样本的中和效价(1: χ ) Tab.3 Neutralizing titer of 21 positive serum samples

图1 不同型别的血清中和效价分布Fig.1 Neutralizing titer statistics of positivesamples

3 讨 论

有研究报道以棉鼠、仓鼠、CBA小鼠、FVB/n小鼠为实验动物建立人腺病毒感染动物模型, 但大部分是基于人5型腺病毒的研究, 很少见其它型别的人腺病毒感染动物模型研究报道[9, 10, 11, 12, 13]。人5型腺病毒大剂量时可以感染这些动物模型并引起肺炎, 但多表现出自限性, 病毒在几天内即被清除干净。相对于人5型、2型等C组腺病毒感染, 人3型、7型、11型等B组腺病毒感染常导致更严重的肺炎, 也可能并发心肌炎、肾炎等[14]。因为3、7型等B组腺病毒感染的受体(桥粒芯蛋白-2, DSG-2)与5型腺病毒(CAR)不同, 具有不同的组织嗜性[15], 所以这些用于人5型腺病毒研究的动物模型可能不适合其它型别腺病毒感染研究, 人3型、7型、11型、21型、55型等相关型别的腺病毒感染动物模型还需要系统性的研究。本研究小组前期也利用人3型、4型和55型腺病毒对小鼠、裸鼠、金黄地鼠等啮齿类动物进行了攻毒实验, 发现病毒并不在细胞中复制增殖, 感染动物后呈一过性感染, 动物无明显症状表现, 表明上述动物不适合作为人B组腺病毒的感染动物模型。

树鼩作为一种新型的实验动物, 在当今医学生物学(特别是病毒学)研究中发挥了越来越重要的作用。韩建保等人用酶联免疫法检测272份树鼩血清中人腺病毒IgG抗体, 结果无阳性样品[16]。在本研究中, 我们采用微量中和实验的方法来测定树鼩血清中的人腺病毒抗体, 该方法是检测宿主过往感染史的经典方法, 与常用的酶联免疫法等检测方法相比更具有优势:1)特异性更强, 不存在交叉反应。微量中和实验法检测血清中的抗人腺病毒中和抗体, 是目前仍在沿用的腺病毒血清型分型法的标准方法, 各型别之间无交叉中和反应; 而ELISA法检测对象是血清中存在的多克隆抗体, 在动物腺病毒和人腺病毒之间可能存在交叉反应, 影响结果的特异性。2)准确性更高, 可用于病毒分型, 明确树鼩过往感染的人腺病毒型别, 并可进一步明确同一动物多次感染不同型别病毒的感染史。

本实验对34份树鼩抗血清样本进行5种腺病毒的中和试验, 结果显示21份样本显阳性, 树鼩血清大部分为多价抗血清, 主要表现为和Ad3、Ad14和Ad55混合型多价抗血清。我国时有B组人腺病毒疫情暴发, 血清型以3、7型为主, 而新发致急性呼吸道疾病的14型和55型自首次暴发后每年均有新增个案, 且疾病程度严重[2, 11, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]。主要流行型Ad3和近年来在人群中新发的Ad14和在树鼩血清中的中和抗体检出率和效价较Ad55和Ad7的高, E组Ad4的阳性率和中和效价较低, 提示人腺病毒在树鼩中的流行情况与在人群中暴发情况有着相关性。树鼩种群中存在人腺病毒流行, 是潜在的人腺病毒动物模型候选, 以树鼩为实验动物建立人腺病毒感染模型具有较大的可能, 后续可深入探讨。

The authors have declared that no competing interests exist.

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