何小丽,吴林青同等贡献
目的 研究IL-33敲除(IL-33-/-)对小鼠急性弓形虫感染腹腔巨噬细胞(pMφ)极化的影响,探讨IL-33-/-在弓形虫感染免疫应答中的作用。方法 收集C57BL/6 IL-33-/-小鼠和野生型(WT)小鼠pMφ,各分为弓形虫感染组和未感染组,比较各组pMφ 感染率、细胞因子及表面分子表达水平的变化。结果 IL-33-/-小鼠pMφ 弓形虫感染30 min后的感染率低于WT小鼠( t=-2.49, P<0.05);IL-33-/-小鼠感染组pMφ M1型标志物NO( t=29.71, P<0.05)、MHCⅡ( t=19.05, P<0.05)、TLR4( t=8.34, P<0.05)表达高于WT小鼠感染组,而M2型标志物CD206表达低于WT小鼠感染组( t=-3.34, P<0.05);感染组小鼠pMφ NO、IL-10、TNF-α、MHCⅡ类分子及CD86的表达高于各自未感染对照组;IL-33敲除和弓形虫感染对IL-33-/-与WT小鼠pMφ MHCⅡ( F=5.25, P<0.05)、TLR2(F=14.88, P<0.05)分子的表达有交互作用。结论 在急性弓形虫感染早期,IL-33敲除驱动小鼠pMφ 向M1方向极化,促进pMφ 抗感染。
HE Xiao-li and WU Ling-qing have an equal contribution to this paper.
We investigated the effect of IL-33 knockout on the polarization of peritoneal macrophages from mouse with acute Toxoplasma infection, in order to uncover the function of IL-33 knockout in mice macrophages with acute Toxoplasma infection. pMφ was isolated from C57BL/6 wild type and IL-33 deficient mice and divided into Toxoplasma infected group and control group respectively. Infection rate of pMφ was determined; the mRNA of iNOS, Arg-1, IL-1, IL-10 and IL-12 were analyzed by real-time PCR; the secretion of IL-12, TNF-α, IL-10 and NO were detected by ELISA and Griess method respectively; the surface molecules (CD80, CD86, CD206, TLR4, TLR2, MHCⅡ) were analyzed by flow cytometry. Results showed that the infection rate of pMφ was deceased in IL-33-/- mice compared with wild-type mice ( t=-2.49, P<0.05); the expression of M1 makers NO( t=29.71, P<0.05), MHCⅡ( t=19.05, P<0.05), CD86 and TLR4( t=8.34, P<0.05) were increased ( P<0.01) while the M2 maker (CD206) was down-regulated in IL-33-/- mice infected with Toxoplasma than that in the wild-type infected group; the secretion of NO, IL-10, TNF-α and the expression of MHCⅡand CD86 were higher in infected group of both IL-33-/- and wild-type mice compared with uninfected control group respectively ( P<0.01). Results suggest that IL-33 knockout promote the secretion of NO and the expression of MHCⅡ( F=14.88, P<0.05), CD86 and TLR4 via driving polarization of M1 macrophages, thereby enhancing the immune protection in acute Toxoplasma infection.
弓形虫是一种专性的细胞内寄生原虫, 可以感染几乎所有的温血动物, 呈全球性分布。弓形虫感染可导致人和其它哺乳动物流产, 是人先天致畸的重要病原体, 也是引起免疫缺陷疾病如AIDS和长期使用免疫抑制剂病人死亡的重要原因[1, 2]。
白介素-33(interleukin-33, IL-33)是2005年作为磺基转移酶同源体(homolog of sulfotransferase, ST2)的配体被发现的一个新的IL-1家族成员。ST2选择性地在Th2细胞上表达, Th1则不表达, IL-33与ST2结合, 通过下游信号分子髓样分化因子88(MyD88), IL-1相关蛋白激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子受体相关因子 6(TRAF6), 使NF-κ B 和MAPK活化, 从而调节基因的转录, 促进Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的产生及发挥后续的生物学功能[3], 故IL-33可增强Th2免疫反应。同时, IL-33也是Th2细胞的趋化因子, 促使Th2细胞在淋巴结和组织中募集, 通过促进Th2免疫反应、趋化嗜酸粒细胞、改变Mφ 的极化趋势, 在多种炎症性疾病中发挥作用, 如感染性疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病等[3, 4, 5, 6]。
巨噬细胞(macrophage, Mφ )是一种多分化来源的细胞, 具有复杂的异质性与功能的多样性, 在不同的微环境及不同的因子作用下可被激活成不同的表型, 根据极化后细胞表面标志性分子及功能的不同, Mφ 大体可分为经典激活的Mφ (Ml型)和替代激活的Mφ (M2型)。M1型细胞以CD68+、CD86+、MHCⅡ +为表型特征, 表达诱导型一氧化氮合成酶(iNOS), IL-12及膜蛋白CD16/32; 通过产生iNOS分解L-精氨酸产生NO及反应性氧中间物(ROI), 促进炎症反应以及清除入侵微生物; 高效递呈抗原、高水平合成促炎细胞因子, 是激活Thl细胞反应的效应细胞, 具有抗病原微生物和肿瘤细胞的作用[7, 8, 9]。而M2型细胞则通过表达I型精氨酸酶(Arginase1, Arg1)分解L-精氨酸产生L-鸟氨酸, L-鸟氨酸是脯氨酸前体, 能促进胶原合成, 促进损伤部位的修复; 低表达IL-12, 高表达IL-10、Arg1、甘露糖受体(CD206)、YM-1(几丁质酶家族成员)等; 抗原递呈功能弱, 通过抑制Thl免疫反应, 诱导Th2细胞, 抑制急性炎症反应、参与慢性炎症、肿瘤转移、超敏反应、创伤愈合等的发生和发展、促进损伤组织修复、重构和血管生长功能。iNOs和Arg1两者竞争性地结合L-精氨酸, 并通过代谢产物发挥促炎或抗炎的相反作用[10, 11, 12, 13, 14]。
近期的研究表明, IL-33可促进Mφ 向M2方向极化, 在Mφ 的极化中发挥重要作用。在IL-33诱导的气道炎症中, IL-33促进静止状态的肺泡巨噬细胞(AMs)向M2方向极化, 表达CD206, IL-4Rα , 产生高水平的CCL24和CCL17, 去除AMs会减轻气道炎症反应。体外实验也显示, IL-13/IL-4Rα 信号通路在IL-33驱使AMs向M2a方向极化中起关键作用, IL-33放大了IL-13诱导的肺泡及骨髓来源的Mφ 向M2a方向极化, 增加Arg-1, YM-1及CCL24和CCL17的表达。在先天性及抗原诱导性的气道反应性炎症中, IL-33/ST2在AMs向M2a极化中起重要作用[13]。Yang Z等的研究也证实IL-33诱导AMs主要是通过AAM自分泌IL-13激活IL-4Rα -STAT6途径, Mφ 作为IL-25/IL-33的效应细胞在Th2型免疫反应中起重要作用。去除小鼠Mφ 会减弱IL-25/IL-33诱导的2型免疫反应[15]。Besnard A-G等在研究小鼠实验性脑型疟疾(ECM)时也证实:IL-33通过促进Th2型的先天性淋巴细胞(ILC2)产生2型的细胞因子, 如IL-4, IL-5, IL-13, 从而驱使Mφ 向M2型极化, 而M2型细胞再影响Tregs, 最终抑制Th1免疫反应, 减少IFN-γ , IL-12 和TNF-α 的分泌, 抑制ECM的进一步发展[16]。最新研究也显示IL-33在柯萨奇病毒引起的心肌炎[5]和三硝基苯磺酸诱导的肠炎[6]中通过诱导Mφ 向M2方向极化从而减轻炎症发展。
综上所述, 可见IL-33在Mφ 的极化中起重要作用, 关于其在弓形虫感染Mφ 中的免疫作用还未见报道。因此本课题通过观察IL-33-/-小鼠PMφ 弓形虫感染后的极化趋势, 进一步探讨IL-33在弓形虫感染免疫应答中的作用。
ZS株刚地弓形虫(人源), 基因型为ToxoDB#9 (Chinese 1), 由本室传代保种。
SPF级雌性C57BL/6 WT和IL-33-/-小鼠各48只, 鼠龄12~14周, 体重22~25 g, 昆明鼠30只。C57BL/6 WT小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号码:SCXK(沪)2012-0002, 合格证编号:20150 00509916, 2015000518671], C57BL/6 IL-33-/-小鼠由福建中医药大学林炜教授提供, 和昆明鼠小鼠一起饲养于福建医科大学实验动物中心(实验动物使用许可证号:SYXK(闽)2012-0001, 适用范围:SPF 级鼠类), 动物房SPF层流柜中, 鼠笼、鼠料、垫料、饮水经过高压消毒灭菌, 每周垫料更换两次, 动物使用协议由动物审查委员会批准。
吉姆萨染液(北京中杉金桥生物有限公司); 引物(上海生工); PerCP-Cy5.5 anti-mouse CD80, PE anti-Mouse TLR4, PE-anti-Mouse MHCⅡ , FITC-anti-mouse CD14, FITC-anti-mouse TLR2, Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl PE/ Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl APC(美国eBiosciences); APC anti-mouse CD206, Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl PE, APC anti-mouse CD86(美国Biolegend); RPMI 1640 培养液(美国Hyclone); 胎牛血清(美国Gibco); Mouse IL-10, IL-12, TNF-α ELISA kit (杭州联科生物); Griess Reagent System (美国Promega); RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(美国 Fermentas); SYBR Green Master(美国Roche); 温度梯度PCR仪(德国Eppendorf公司); 台式高速冷冻离心机Neofuge 15R(香港Heal Force Development Ltd); 酶标仪Multiscan FC、CO2培养箱Thermo Forma 3111型(美国Thermo Fisher); Mx3005p实时荧光定量PCR仪ND2000C(美国StrataGene); 流式细胞仪(美国BD公司); 超净台(苏州苏净安泰); 超低温冰箱(英国NBS)。
1.4.1 小鼠基因型鉴定 采用Keisuke Oboki[17]设计的引物, 由上海生物工程公司合成(表1), 提取小鼠鼠尾 DNA, PCR鉴定小鼠基因型。
1.4.2 小鼠pMφ 弓形虫感染率测定 参照文献[18]收集12~14周左右的 C57BL/6 WT 及 IL-33-/-小鼠 pMφ , 每组6只, 调整细胞浓度至1× 106个/mL, 以0.5 mL/孔接种于放了爬片的24孔细胞培养板中, 放入37 ℃, 5% CO2培养箱培养2 h, 去除未贴壁的细胞, 加入新鲜的0.5 mL 培养液继续
培养24 h; 加入0.5 mL 培养液稀释的2.5× 106个/mL弓形虫速殖子(液氮复苏后传3代以上), 轻轻混匀后, 继续培养30 min; 弃培养上清液, 加入 PBS 洗涤1次, 冷风吹干, 加入0.5 mL 的甲醇固定3 min, 吸弃残余的甲醇溶液, 加入姬姆萨染液0.5 mL 染色30 min, 用蒸馏水洗涤2次, 吹干爬片, 用中性树脂固定于载玻片上, 高倍镜下观察, 计数200个细胞的感染率。
感染率=
1.4.3 实验分组及细胞培养和弓形虫感染方法 实验分4组, 分别为 IL-33-/-小鼠 pMφ 弓形虫感染组和未感染组, WT 小鼠 pMφ 弓形虫感染组和未感染组。收集 WT 和IL-33-/- 小鼠 pMφ , 每组各6只, 按5× 105细胞/孔, 复孔接种到24孔细胞培养板, 置37 ℃, 5% CO2培养箱培养2 h; 洗去未贴壁细胞, 加入0.5 mL新鲜的培养液继续培养24 h; 取复孔中的一孔为感染孔, 加入弓形虫速殖子1.2× 105个/mL, 0.5 mL/孔; 另一孔为未感染孔加入0.5 mL 培养液, 继续培养24 h; 吸取培养上清液离心分装冻存于-70 ℃用于NO、TNF-α 、IL-10、IL-12 的检测; 收集细胞进行 Real-time PCR 和流式检测。
1.4.4 Real-time PCR检测弓形虫感染前后pMφ iNOS、Arg-1、IL-1、IL-10、IL-12 mRNA的表达 取感染24 h后收集的各组细胞, 经Trizol 裂解、提取RNA、OD260/280测定其浓度和纯度; 按逆转录试剂盒逆转录为 cDNA, 采用20 μ L 反应体系; 按FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)说明书进行Real-time PCR 扩增, 以β -actin作为内参检测 iNOS、Arg-1、IL-1、IL-4、IL-10、IL-12 mRNA相对表达量, 引物见表2; PCR扩增条件为50 ℃ 2 min→ 95 ℃ 预变性10 min→ (95 ℃变性15 s, 60℃退火1 min→ 40个循环体系)→ 95 ℃ 15 s → 60 ℃ 1 min→ 95 ℃ 15 s。反应结束后, 用△ Ct法进行计算:△ Ct=Ct目的基因-Ct参照基因, △ △ Ct= (Ct目的基因-Ct参照基因)实验组-(Ct目的基因-Ct参照基因)对照组, 2-△ △ Ct的意义即实验组目的基因相对于对照组目的基因表达量变化倍数, 野生型小鼠未感染组为对照组。
1.4.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组pMφ 弓形虫感染后TNF-α 、IL-10、IL-12的分泌水平 采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术, 按ELISA试剂盒说明书进行操作。
1.4.6 Griess方法检测弓形虫感染前后各组pMφ NO的分泌水平 按试剂盒说明书进行操作。
1.4.7 流式细胞术检测弓形虫感染前后各组 pMφ 表面分子(CD80、CD86、CD206、TLR4、TLR2、MHCⅡ )的表达水平 胰酶消化收集各组细胞, 洗涤后, 加入含封闭抗体(CD16/32)的细胞洗液80 μ L, 混匀, 冰浴10 min; 加入各管相应的 Ab(CD80/CD206/TLR4; CD86/MHCⅡ /TLR2)20 μ L, 漩涡混匀, 4 ℃, 避光35 min; 加入含1%多聚甲醛的 PBS 固定液0.5 mL, 上流式细胞仪检测。
1.4.8 统计学方法 数据以
以PCR鉴定本实验用小鼠为C57BL/6 WT 和IL-33-/- 小鼠。
C57BL/6 WT和IL-33-/- 小鼠pMφ 感染弓形虫速殖子30 min后, IL-33-/- 小鼠pMφ 感染率低于WT小鼠(数值分别为0.95± 0.01及0.98± 0.01, t=-2.49, P< 0.05), 提示IL-33-/- 小鼠pMφ 抗弓形虫感染能力增强。
2.4.1 IL-33-/-对pMφ M1型标志物表达的影响 IL-33-/-感染组pMφ 上清液中NO的浓度(F=29.71, P< 0.05)及细胞表面MHCⅡ (F=19.05, P< 0.05)、TLR4(F=8.34, P< 0.05)阳性百分率高于WT感染组, 提示IL-33-/-促进弓形虫感染的小鼠pMφ 分泌NO, 表达MHCⅡ 和TLR4分子; 而TLR2阳性百分率表达则相反(F=14.88, P< 0.01), 提示IL-33-/-抑制了pMφ TLR2的表达; IL-33-/-小鼠感染组pMφ iNOS(F=0.96, P< 0.01)、IL-1(F=0.83, P< 0.01)、IL-12 mRNA(F=1.32, P< 0.01)的表达, TNF-α 的分泌(F=0.98, P> 0.05)及表面分子CD80(F=0.23, P> 0.05)、CD86的表达(F=0.02, P> 0.05)与WT小鼠感染组比较均无统计学差异, 见表3。
2.4.2 弓形虫感染对小鼠pMφ M1型标志物表达的影响 IL-33-/-和WT小鼠感染组pMφ TNF-α (F=11.56, P> 0.05)、NO分泌水平(F=16.68, P> 0.05)及CD86(F=13.43, P> 0.05)、TLR4(F=57.57, P> 0.05)、MHCⅡ (F=34.34, P> 0.05)表面分子的表达均高于各自未感染对照组, 提示感染促进了IL-33-/-和WT小鼠pMφ 上述炎性介质及表面分子的表达; 弓形虫感染对IL-33-/-和WT小鼠pMφ iNOS(F=0.69, P> 0.05)、IL-1(F=0.02, P> 0.05)、IL-12 mRNA(F=2.46, P> 0.05)表达及表面分子CD80(F=1.87, P> 0.05)、TLR2(F=3.33, P> 0.05)表达的比较均无统计学差异, 见表3。
2.4.3 IL-33-/- 和弓形虫感染双因素对小鼠pMφ M1型标志物表达的影响 IL-33-/- 和感染双因素对小鼠pMφ MHCⅡ 分的表达有交互促进作用(F=5.25, P< 0.05, 图2), 而对TLR2的表达则是明显的交互抑制作用(F=14.88, P< 0.01, 图3), 提示IL-33-/-促进弓形虫感染的小鼠pMφ 表达MHCⅡ 分子, 而抑制TLR2的表达。 IL-33-/- 和感染双因素对IL-33-/- 小鼠与WT小鼠间iNOS、IL-1、IL-12mRNA、TNF-α 、NO、CD80、CD86、TLR4的表达无交互影响。
与WT感染组比较, IL-33-/- 感染组小鼠pMφ CD206的表达降低(t=-3.34, P< 0.01); 而弓形虫感染促进了WT和IL-33-/- 小鼠pMφ IL-10的分泌(F=6.18, P< 0.05); IL-33-/- 和感染双因素对小鼠pMφ Arg-1、IL-10 mRNA、CD206、IL-10的表达无交互作用, 见表4。
弓形虫感染pMφ 后, 会劫持宿主细胞器进行繁殖[19], 最终导致大量宿主细胞裂解破碎。本实验弓形虫感染pMφ 30 min后IL-33-/- 小鼠pMφ 胞内速殖子的数量少于WT小鼠, 提示IL-33-/- 小鼠pMφ 与WT小鼠比较, 抗弓形虫感染的能力增强。因此, 本研究于弓形虫感染小鼠pMφ 24 h后同时检测pMφ mRNA的表达水平、细胞培养液中细胞因子和炎性介质的分泌水平、细胞表面标志性分子的表达水平, 以达到比较客观的观察在IL-33-/- 与弓形虫感染双因素作用下小鼠pMφ 的变化。IL-33-/-小鼠感染组细胞培养液中NO明显升高(F=16.68, P< 0.01), 提示感染早期IL-33-/- 促进pMφ 生成NO, 后者可与Mφ 氧化酶所产生的过氧化氢或过氧化物结合, 产生杀伤微生物的过亚硝酸盐基[18, 20]。弓形虫感染明显促进了感染组小鼠pMφ NO及TNF-α 的分泌, 提示弓形虫感染增强了小鼠pMφ 的抗炎活性。而Real-time PCR检测弓形虫感染后小鼠pMφ iNOS、Arg-1、IL-1、IL-10、IL-12 mRNA表达水平显示, IL-33-/- 和感染对各个指标mRNA表达水平变化无统计学意义, 结合细胞培养液中NO和IL-10含量明显升高的变化, 可能与检测的时间点滞后有关系。
弓形虫蛋白会抑制 γ -干扰素激活的Mφ 表达MHCⅡ 类分子[21, 22], 而在本次研究中却观察到感染组小鼠pMφ 表面MHCⅡ 类分子表达明显高于未感染对照组, 分析结果显示:IL-33-/- 小鼠pMφ 弓形虫感染后MHCⅡ 类分子的表达高于WT型感染组。同时, 感染组小鼠pMφ CD86分子也明显高于未感染对照组。MHCⅡ 类分子为激活CD4+ T细胞提供第一信号, 而CD86是CD28的配体, 提供T细胞激活的共刺激信号。感染组小鼠pMφ 表面MHCⅡ 类分子和CD86分子表达增高, 提示弓形虫感染可能增强了CD4+ T细胞激活的双信号, 促进 T细胞的生长和分化。由于弓形虫为胞内寄生原虫, 细胞免疫在整个抗弓形虫感染过程中发挥了极其重要的作用。CD4+T细胞在抗弓形虫感染中发挥重要的免疫调节作用, 而CD8+T细胞发挥细胞杀伤作用[18]。本课题组前期的研究发现急性弓形虫感染时WT小鼠CD4+T细胞/CD8+T细胞比例逐渐降低, 随着感染进展CD8+T细胞在数量上比CD4+T细胞占优势。而IL-33-/-小鼠则刚好相反。这一点和文献报道的弓形虫脑炎时NF-κ B-/-小鼠脑中CD8+T细胞数量少于野生型小鼠相符[23]。因此IL-33-/- 可能通过促进M1巨噬细胞CD86、MHCⅡ 类分子的表达促进CD4+ T细胞发挥免疫调节作用。
Toll样受体是一类跨膜受体, 可识别并结合相应的病原体相关的分子模式(PAMP), 在弓形虫感染中主要通过启动TLR/MyD88信号传导途径[24], 诱导某些炎症介质(如细胞因子)和某些杀菌分子(如NO等), 介导炎性反应并发挥杀寄生虫作用[25, 26]。弓形虫糖基磷脂酰肌醇类(GPIs)可活化TLR2和TLR4[24]。我们发现感染组小鼠pMφ TLR4表达明显高于对照组, IL-33-/- 促进了小鼠pMφ TLR4的表达。但在本次实验中, IL-33-/- 小鼠感染组pMφ TLR2的表达明显低于WT感染组。Mun HS等观察到TLR2敲除小鼠口服感染弓形虫无毒株包囊后8 d内全部死亡, 而TLR4敲除小鼠及野生型小鼠则全部存活; 发现TLR2敲除小鼠 pMφ 感染弓形虫后未能产生NO和 γ -干扰素等抗弓形虫感染的炎性介质[27]。本实验 IL-33-/- 小鼠pMφ 感染弓形虫后表面受体TLR2表达降低是否与受体内化有关还有待后续进一步研究。
综上所述, 在急性弓形虫感染早期, IL-33-/- 小鼠pMφ 高表达MHCⅡ 类分子、NO、TLR4、CD86等M1型标志, 而M2型标志物CD206表达降低。提示IL-33-/- 可能通过调控Mφ 向M1亚群分化, 分泌NO等活性介质, 表达MHCⅡ 类分子、CD86等分子参与抗弓形虫免疫应答。
The authors have declared that no competing interests exist.
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