环介导等温扩增技术检测方法的研究进展
刘亚东, 冷雪, 时坤, 李建明, 张姗姗, 刘艺, 宫庆龙, 孙志博, 宗颖, 曾范利, 杜锐
吉林农业大学,长春 130000
通讯作者:杜 锐,Email:durui71@126.com
摘要

环介导等温扩增技术是一种可用于临床诊断的快速检测方法,可用于检测病毒、细菌、寄生虫等多种病原体。经不断完善,现已在临床检测过程中发挥重要作用。可用显色试剂对反应结果实现可视化,即结果的即时显示,无需后续验证。但是,无论是荧光染料还是显色指示剂,对反应过程都会产生或多或少的影响,目前研究表明羟基萘酚蓝是最好的显色试剂。同时,人们发现电化学技术也可以应用于此,使检测反应更快,操作更加简单。生物传感器可以对多种反应产物进行同步检测,而微流控芯片技术更是方便携带,有望成为实时检测技术的理想载体。

关键词: LAMP; 可视化; 电化学检测法; 生物传感器; 微芯片
中图分类号:R37 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)05-0460-06
Advanced of the detection method of loop-mediated isothermal amplification
LIU Ya-dong, LENG Xue, SHI Kun, LI Jian-ming, ZHANG Shan-shan, LIU Yi, GONG Qing-long, SUN Zhi-bo, ZONG Ying, ZENG Fan-li, DU Rui
Jilin Agricultural University,Changchun 130000,China
Corresponding author: Du Rui, Email:durui71@126.com
Abstract

loop-mediated isothermal amplification is a rapid detection method that can be used for clinical diagnosis and can be used to detect viruses, bacteria, parasites and other pathogens. It has been improved and plays an important role in the clinical testing process. The color reaction can be used to achieve visualization of the results, and the results can immediately display. However, both the fluorescent dye and the color indicator can impact the reaction process. The current study shows that hydroxyl naphthol blue is the best color reagent. At the same time, it was found that electrochemical technology can also be applied to the method, which can make the detection reaction be faster and the operation more simple. Biosensors can synchronized detect a variety of reaction products. And microfluidic chip is easy to carry and is expected to become the ideal carrier for real-time detection technology.

Key words: loop-mediated isothermal amplification; visualization; electrochemical detection; biosensors; microchips

目前已存在几种核酸扩增方法[1, 2, 3, 4], 而PCR(聚合酶链式反应)是目前使用最广泛的技术, 该基因扩增方法已被应用于临床, 特别是在分子检测方面, 在传染病诊断中尤其如此, 例如肝炎和结核等, 以及一些遗传疾病。基因检测步骤包括从标本中提取核酸, 进行基因扩增和检测, 这些步骤需要一定的操作技术和昂贵的仪器设施, 在资金投入紧张的国家和地区, 使用受到限制, 且PCR的循环过程变温会消耗一定时间。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等[5]人研究的一种分子扩增技术, 可以快速大量的扩增目的片段, 等温扩增解决了变温的时间损耗, 现被应用于临床检测中, 并被不断完善, 在临床检测中具有非常重要的意义。

1 LAMP原理

LAMP技术的核心之一在于引物的设计, 设计出特异性强的引物是LAMP的第一步也是开始的关键。LAMP引物是针对DNA的靶序列设计一对外引物F3与B3, 以及一对内引物FIP和BIP, 内引物FIP是由F2和FIc组成, BIP是由B2和B1c组成[6]。反应的进行依托于DNA置换酶的活性和引物的特异性。在初始过程中, 4个引物都参与反应, 但是在循环反应中只有内引物参与DNA序列的置换合成。内引物分为上内引物(FIP)和下内引物(BIP), 每一个内引物含有2个不同的序列, 与靶序列的正向序列和反向序列相对应, 一个用于第一步的启动, 另一个以自身为模版进行第二阶段的循环扩增, 即目的片段的尾端内侧序列被命名为F2c和B2。F2c和B2尾端内侧的2个序列被称为F1c和B1, 外侧的2个序列称为F3c和F3。鉴于这种结构, FIP和BIP被命名为内引物。FIP包含F1c, 1个TTTT片段以及互补于F2c的序列F2。BIP包含的是与B1互补的序列B1c, TTTT片段和B2。2个外引物包括的是B3和F3c互补的序列F3。1个含有靶序列和4个引物的DNA样品加热变性后在冰上快速冷却。之后, 加入Bst DNA大片段置换酶, 65 ℃ 1 h, 开始LAMP反应[5]

2 反应特点

LAMP反应的几个方面与其他扩增方法不同。LAMP方法的主要特征是只需要一种酶, 使其在65 ℃范围内的等温条件下扩增核酸。因此, 它允许使用简单且具有低成本效益的反应设备, 在临床检测中可以更好的实施。

LAMP方法具有高特异性和高扩增效率。由于LAMP方法使用4种识别模板DNA上6个不同区域的引物, 其特异性极高。例如, LAMP方法可以特异性扩增来自区分单个核苷酸差异的人类基因组标本中的特定基因[7]

LAMP方法的分离效率非常高, 等温也不需要变温过程的时间浪费。 LAMP方法在30~60 min内对25 μ L反应混合物合成10~20 μ g特异性DNA[8]。尤其加入特异性环引物可以有助于将扩增时间缩短到原始LAMP方法的1/2或1/3[9]

该方法还可用于扩增靶RNA序列。Notomi等人开发了一步, 单管, 实时逆转录循环介导的等温扩增(RT-LAMP)测定法, 用于检测甲型肝炎病毒(HAV)基因组中非翻译区的序列[10]。在这种情况下, 与DNA的扩增相同的一步扩增可以通过同时添加逆转录酶进行, 因为逆转录酶也显示出链转移活性。

3 LAMP研究进展

自从2000年[5]第一次报道了LAMP, LAMP就成为了分子扩增领域广泛研究的重点, 在不断的研究中LAMP技术越来越完善。2002年Nagamine等人[9]设计应用环引物, 大大缩短了LAMP反应时间; 同年Nagmine等人[11]使用TspRI酶实现了DNA的单链分离扩增; 2005年Enomoto等人[12]通过将LAMP与逆转录相结合, 建立了RT-LAMP技术; 2006年Yoneyama等人[10]开发了单管一步逆转录法, 对肝炎病毒进行了逆转录; 同年Hirayama等[13]应用LAMP方法对水牛胚胎进行了性别鉴定并克隆了性染色体的特异性序列, 对于物种的繁殖作出了非常重要的贡献。此外, 2006年Poon等人[14]未提取DNA直接进行LAMP, 成功检测到恶性疟原虫阳性反应, 对之后的检测技术产生深远的影响。Kaneko等人[15]在2007年通过检测LAMP对生物的耐受性, 进行了未提取DNA的病毒LAMP实验, 再一次表明LAMP可以不经过DNA提取而进行扩增, 只是结果没有经过提取的效果好。

3.1 可视化发展

2001年Mori等人发现了根据浊度对反应进行肉眼的直观判断[8], 但是因根据肉眼分辨浊度具有强烈的主观性, Le等人[16]发现, 在阳光照射下, 用肉眼确定管之间的灵敏度和变异性是困难的, 且阳性样品的浊度只在短时间内稳定。意味着必须在反应之后尽快进行监测[17], 更需要浊度计进行准确客观的判断, 然而使用浊度计进行检测, 不够经济实用, 因而, 实现反应结果的可视化, 成为了学者们关注的焦点。

DNA具有能和染料结合的特异性分子结构dsDNA, 通常, 染料与dsDNA的复合物的形成会使染料发生可见的颜色变化, 因此此类染料可用于LAMP产物的可视化。2003年, Iwamoto等人[18]首次使用SYBR-Green I用于LAMP结果鉴定, 研究发现[19]DNA结合染料的检测灵敏度都远高于浊度检测的灵敏度。目前, 许多荧光染料已被用于定性检测。在存在足够的dsDNA的情况下, 荧光染料SYBR-Green I的颜色从橙色变为绿色, 且在自然光下, 颜色变化依然易于分辨[19, 20]。另一方面, 通过添加DNA结合染料提高灵敏度与较高的运行成本有关。另外, 由于需要打开反应管以增加染料, 因此增加了污染风险。为了克服后者的缺点, 2012年, Hong等人[21]研究出了两步法, 以避免打开管:SYBR-Green I染料悬浮在管内的锡箔上, 在LAMP反应后, 将管离心, 使染料落入LAMP反应混合物中。使用该方法, 当最小模板浓度为1拷贝/μ L时, 可以检测到LAMP的产物。同样, Quant-iT PicoGreen[22], GeneFinder[17, 23, 24], 和溴化乙锭[22]也被用于LAMP结果的检测。2006年, Yasuyoshi等人[25]把聚乙烯亚胺用于LAMP的结果检测, 用来增强染料标记。在使用聚乙烯亚胺增强的方法中, 使用荧光标记的DNA探针结合LAMP产物, 随后加入聚乙烯亚胺中和染料标记的LAMP产物, 产生具有清晰的颜色的沉淀物, 可以通过肉眼直接对结果判定。

然而, DNA结合染料的方法存在一定的缺陷, 主要为会对LAMP的扩增过程产生抑制[25], 这意味着染料试剂必须在终点加入, 避免影响LAMP反应。此外, 这些染料中的一些, 例如溴化乙锭[7]可能是诱变剂, 致癌物质或致畸物, 虽然这取决于接触程度。

此外, 这种方法需要在扩增后打开反应管, 可能会造成污染。对此, Liang等人[26]在2013年用微晶蜡将SYBR-Green I染料提前密封在反应管中, 在LAMP反应结束后通过加热使蜡融化释放染料进行显色, 这种方法即应用了荧光染料的灵敏度又解决了因开盖而可能产生的污染问题。在2014年Jiang等人[27]成功的应用这种方法对恶性疟原虫进行了检测。

另一种使用间接显色指示剂的肉眼观测方法, 指示剂可以加入到LAMP反应体系中, 进行密封一步测定。因此, 与两步的DNA结合染料方法相比, 降低了产生污染的风险[28], 比如, 钙绿黄素。在2008年钙绿黄素被Tomita等人[7]首次应用在LAMP反应结果检测。在扩增反应前, 钙黄绿素分子与锰离子结合, LAMP反应溶液为橙色, LAMP反应过程中生成大量的焦磷酸根, 使得钙绿黄素分子不再结合锰离子, 而与生成的焦磷酸根离子结合, 生成绿色荧光, 而且, 钙绿黄素分子与镁离子结合, 可以增强绿色荧光信号[7]。然而, 在2010年Wastiliing等人[22]发现, 与没有添加指示剂的反应相比, 加入钙绿黄素的似乎降低了LAMP的敏感性。实际上, 钙绿黄素的存在在一定程度上抑制了LAMP反应[22, 29], 另一个原因是钙绿黄素和双链DNA之间的相互作用导致了反应灵敏度的降低[30, 31]

因此, 具有相似作用方式的另一种染料HNB进入了人们的视线, 这种染料是在镁离子存在下形成紫色, 在扩增反应过程中, 伴随大量的焦磷酸镁的生成导致反应中的镁离子浓度下降, 从而使得含有HNB的反应溶液从紫色变为蓝色[29]。Wastliing等人[22]研究表示, 该试剂不会对LAMP反应产生抑制, 比钙绿黄素更加适合作为指示剂, 因而被广泛使用[17, 21, 29, 32, 33, 34]

3.2 电化学检测法

由于电化学方法更快, 成本更低, 更简单, 并且比光学的方法更容易以小型化的形式应用[35], 这些特点使得电化学可以作为分析DNA扩增结果的可靠且稳定的检测方法[36]。因此, 现在一部分的焦点为利用电化学传感器/芯片和生物传感器等方法对LAMP反应进行检测。

3.2.1 Endpoint 电化学的活性物质与dsDNA的结合会导致检测电流的变化。比如, 在溶液中的Hoechst 33258氧化还原分子可使得DNA在槽中聚集, 导致电流反应明显下降。Ahmed[37]和Safavieh[38]等人将分子用作电活性指示剂来检测LAMP反应产物, 并用探针非固定化方法测得8.6 fg /μ LDNA(24 CFU / mL)[38], 为减少交叉感染的分析, 他们开发了一个平台, 允许在单个设备中进行放大检测。使用该装置和Hoechst 33258指示器, 一次可测得300拷贝量[39]

3.2.2 Real time LAMP反应的实时监测可以通过原位电化学反应来实现, 依赖于两种机制:亚甲蓝(MB)分子与工作电极之间的氧化还原电子转移以及MB与dsDNA的嵌入[40, 41], 随着反应的进行, MB与LAMP扩增子的嵌入降低了游离MB浓度, 从而降低了这种氧化还原电流[42, 43, 44]。使用MB作为指标, Hsieh[42]和Xie[44]等人得到的检测限度分别为16拷贝(4fg /μ L)和0.3 pM。然而, MB的DNA结合亲和力为104~105 M-1[45], 其与MBL与扩增子LAMP在溶液中的低效率相互作用[46], 表明可以通过其他指标来实现较低的检测限度。钌六胺缺乏插层配体并与阴离子dsDNA骨架静电结合[47]。Ahmed等[46]人将其作为定量监测LAMP扩增子的指标, 在30 min内检测限为20拷贝/μ L。使用单个生物芯片在单个聚丙烯管中进行体外扩增和实时监测, 这种方法可以避免在整个过程中潜在的交叉污染风险。在理想情况下, 电活性指示剂应具有化学稳定性, 应优先与dsDNA扩增子结合, 不应在监测过程中抑制扩增[46]。然而, 几乎所有的氧化还原探针都对DNA的扩增存在抑制作用[38]。例如, Hoechst 33258对聚合酶活性有明显的抑制作用, 并且限制溶液中DNA的扩增和感测。为了克服这个问题, Zhang等人[24]开发了一种伏安模式, 用于通过测试游离的2-脱氧鸟苷5-三磷酸(dGTP)的氧化反应来监测DNA扩增的生物化学过程, 这也是LAMP反应中的反应物之一。有了这个方法, 抑制问题不再是焦点, 因为没有辅助指标可以使用。不幸的是, 需要将电极置于反应中可能会发生交叉污染。

3.3 生物化学传感器

电化学生物传感器与某种生物识别模式联合, 应用于检测方法中。已经报道了几种用于监测LAMP反应的电化学生物传感器/基于生物芯片的方法。Sun等人[48]通过将序列特异性ssDNA探针固定在离子液体改良的基底电极上来制造电化学DNA生物传感器。 然后, 他们使用生物传感器和亚甲基蓝电化学指示剂来监测杂交的LAMP扩增子。Nakamura等[49]人开发了一种电化学DNA生物芯片, 用Hoechst 33258作为杂交指示剂同时监测六种LAMP产物。Nakamura等人[50]又通过组合LAMP和基于杂交的电化学DNA生物芯片成功获得了特定基因的拷贝数, 其由Genelyze系统, DNA扩增1 h和DNA检测0.5 h组成。通常, 生物传感器/生物芯片的方法用于直接检测特异性序列的目标基因片段, 以及在LAMP反应后进行定性检测使用。虽然直接检测特异性高于间接测量的特异性, 但是制备DNA生物传感器/芯片是昂贵且耗时的, 特别是在LAMP反应时对其进行实时检测, 并不容易实现。

目前, 通过简单且经济有效的伏安模式监测LAMP反应已经有了一些进展, 但是还没有详细的解释能说明LAMP反应物会污染电极设备。Ahmed等人[46]观察到即使在重复测量之后, 电极面和相对面上也没有形成薄膜或污渍。

4 LAMP的未来

目前还没有足够稳定、简单以及经济的NAT系统供发展中国家使用。综上所述, LAMP及其周边技术还在开发中, 用于在发展中国家建立最简单的用于诊断的NAT系统。这种诊断方法可能对许多疾病流行的国家有很大帮助。检测LAMP反应的理想方法应具有高度的敏感性和快速反应性, 应具有低成本和非高密度性, 应易于使用和环保, 实现理想LAMP检测的可行性取决于微型化检测组件的发展, 微流控芯片[51]作为下一代基因检测设备一直被关注。该装置是在平台上组装的微小通道构成, 在基因测试时, 可以在单个芯片上进行完整的分析, 包括提取, 扩增和检测[52]。这些器件称为μ -总分析系统(μ -TAS)芯片, 或称为“ 芯片上的实验室” 。使用这些装置的优点包括防止基因扩增产物的污染, 根据设备的设计可以进行多体系自动化反应, 可以提高对微量样品的分析速度, 以及进行简化及微型化现场测试。这种方法可以解决与现场基因测试相关的大量问题。Hataoka等人[53]已经通过研究证明, LAMP扩增之后继续进行下一步的反应和分析, 这些都可以在单个芯片上实现, 也证明LAMP反应在下一代的设备装置中依然适用。基于LAMP方法的简单通用的设备的开发和应用, 对临床疾病的快速、准确的检测将具有重要意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

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