引用本文
孟锦昕, 何于雯, 肖雷, 李楠, 宋建领, 王静林, 李华春. 云南省师宗县牛羊蓝舌病病毒感染情况及活动规律监测[J]. 中国人兽共患病学报, 2018,34(6): 537-541
MENG Jin-xin, HE Yu-wen, XIAO Lei, LI Nan, SONG Jian-ling, WANG Jing-lin, LI Hua-chun. Dynamic monitoring and infection on bluetongue virus in cattle and goats in Shizong County, Yunnan[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2018,34(6): 537-541.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.086
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中国人兽共患病学报
云南省师宗县牛羊蓝舌病病毒感染情况及活动规律监测
孟锦昕, 何于雯, 肖雷, 李楠, 宋建领, 王静林, 李华春
云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室,昆明 650224
通讯作者：李华春,Email:li_huachun@hotmail.com
收稿日期: 2017-10-13
资助项目: 云南省应用基础研究计划(青年基金)(2015FD065); 公益性行业(农业)科研专项(201303035)
摘要
目的 研究蓝舌病病毒近几年在云南省师宗县的感染情况及活动规律。方法 2014-2016年连续3年在师宗县设置监控点,每年选择蓝舌病抗体阴性的10头牛和5只羊作为监控动物,5-10月每周采血1次,11月、12月,每月采血1次,每次每头动物采集常规全血、肝素抗凝血各1份,用于蓝舌病抗体检测和病毒分离。结果 2014-2016年均有动物感染蓝舌病病毒,平均感染率为35.56%,感染时间均在6-10月之间,这一结果表明蓝舌病病毒感染动物主要集中在每年的6-10月,这一时期应加强蓝舌病的防控。在蓝舌病监测中,45只监控动物中的16只感染了蓝舌病病毒,并从7只感染动物中分离出9株蓝舌病病毒,分别为BTV-2、-4、-9、-12、-16型,其中BTV-16型4株,为优势血清型。结论 病毒分离和鉴定结果表明,师宗县长期存在多种血清型蓝舌病病毒。
关键词: 蓝舌病病毒; 监控动物; 感染率; 血清型
中图分类号:S823 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)06-0537-05
Dynamic monitoring and infection on bluetongue virus in cattle and goats in Shizong County, Yunnan
MENG Jin-xin, HE Yu-wen, XIAO Lei, LI Nan, SONG Jian-ling, WANG Jing-lin, LI Hua-chun
Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Disease Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China
Corresponding author: Li Hua-chun, Email: li_huachun@hotmail.com
Abstract

We studied the infection and dynamic patterns of bluetongue virus in Shizong County, Yunnan Province in recent years. Ten healthy cows and 5 healthy goats which were not infected with bluetongue virus were selected to monitor bluetongue in Shizong County from 2014 to 2016 for three consecutive years. In each year, the blood of the selected animals was collected once a week from May to October and once a month in November and December. We used the serum samples and the heparin anticoagulant blood samples for bluetongue antibody detection and virus isolation respectively. Infection rate of bluetongue virus was 35.56% from 2014 to 2016 and the positive seroconverted time of the antibody was June to October. These results indicated that the animals infected with bluetongue virus were mainly focused on June to October of every year and the prevention and control of bluetongue should be strengthened in this period. The 16 of 45 animals have been infected with bluetongue virus, and nine strains BTV have been isolated from seven animals in this Bluetongue monitoring. The nine BTV strains belong to serotypes BTV-2, -4, -9, -12, and -16 in which four strains belong to serotypes BTV-16, suggested that BTV-16 were the prevalent serotype in Shizong County. The results of virus isolation and identification showed that multiple serotype bluetongue virus were prevalent in Shizong County, and exsited in long-term.

Key words: bluetongue virus; sentinel animals; natural infection; serotype

蓝舌病(Bluetongue, BT)是一种由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒((Bluetongue Virus, BTV)引起的, 通过昆虫库蠓(Culicoides)传播的非接触性反刍动物传染病[1, 2], 动物感染BTV的平均死亡率为30%, 绵羊高达80%[3]。OIE将其列为须通报疾病, 我国归为一类动物疫病。BT流行广泛, 目前尚无有效的治疗方法[4], 当BTV的不同血清型毒株在同一区域同时流行时, 容易发生基因重组, 全球共有27种不同的BTV血清型, 在中国已有BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-12、-15、-16、-21、-24等11种血清型被分离报道[5], 不同血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护给BTV的防控带来了严峻挑战[6, 7]。

云南省师宗县地处滇中地区, 有亚热带与温带共存的气候特征, 冬春季受大陆季风的影响, 晴天偏多, 光照充足, 气候温和干燥, 夏秋季受海洋季风的影响, 阴雨偏多, 光照差, 气候温凉潮湿。总的情况是终年温和, 雨热同期, 干湿分明, 非常适宜蚊虫生长[8, 9, 10]。云南BTV的传播与媒介昆虫、地理环境、气候变化都紧密相关[11], 1979年张念祖等在云南省师宗县首次分离到蓝舌病病毒, 从而确定本病在我国的存在[12]。1995年由12头BTV抗体阴性黄牛组成的监控群在师宗县建立, 随后监控动物转阳, 成功分离到蓝舌病病毒。2012年肖雷等[13]在师宗县分离获得67株蓝舌病病毒, 可见云南省师宗县是蓝舌病高发地区。为了解近年来云南师宗县蓝舌病病毒活动情况, 参照澳大利亚病毒监测模式[14], 自2014年起, 连续3年在云南省师宗县五龙乡建立监控群, 每年设立监控动物15只, 从5-10月, 每周采血一次, 11月、12月, 每月采血1次, 每份血清样品经BTV C-ELISA检测, 连续的血清学检测数据可得出师宗县近3年来蓝舌病病毒的感染情况以及病毒活动的时间规律, 每份血液样品盲传分离病毒, 根据3年分离获得的蓝舌病毒株数量及病毒的血清型, 可推测出当地流行的蓝舌病主要血清型, 对蓝舌病的预警、风险评估、流行病的研究起到重要作用。

1 材料与方法
1.1 监控群建立

1.1.1 监控动物的选择 因蓝舌病病毒可引起绵羊发病和死亡, 而牛和山羊多为隐性感染, 所以2014-2016年每年4月筛选年龄小于1岁且蓝舌病抗体检测为阴性的10头健康黄牛和5只健康山羊为监控动物设立监控动物群, 3年累计设立监控群3个, 监控动物45头。

1.1.2 监控动物的管理 筛选出来的监控动物用耳标进行专门标识, 与其它牛羊混群放牧, 禁止使用杀虫药。

1.1.3 采血 每年的5月到10月, 每周采血1次, 11月、12月, 每月采血1次, 每头监控动物每次采集常规全血、肝素抗凝血各1管(10 mL), 常规全血分离获得血清, -20 ℃保存, 用于血清学检测, 肝素抗凝血, 4 ℃保存, 用于病毒分离。

1.2 血清学监测

1.2.1 实验材料 BTV C-ELISA检测试剂盒由云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室提供, 并仅限实验室使用[15]。

1.2.2 检测方法 按检测样品数量取出2 ℃~4 ℃保存的ELISA板, 置室温15 min, 并编号; 根据编号每孔加入50 μ L 10%稀释的待检血清和阴性、阳性、弱阳性对照血清各2孔, 空白对照加4空; 同时按每孔50 μ L加入竞争抗体, 此时每孔共100 μ L液体, 空白对照用稀释液补充至100 μ L, 震荡混匀后置37 ℃温箱里温育60 min; 取出温育好的板, 用PBST洗液洗板2次, 在吸水纸上轻轻拍干; 每孔加入50 μ L酶标二抗工作液震荡混匀后置37 ℃温箱里温育30 min; 用PBST洗液洗板5次, 吸水纸上轻轻拍干; 每孔加50 μ L底物反应液, 37 ℃避光温育10 min, 每孔再加终止液50 μ L终止反应, 37 ℃避光显色15 min , 读取OD450nm值。

1.2.3 结果判定 检测合格条件:两个阳性对照孔OD450≤ 0.2, 两孔间OD450差距小于0.05, 两个阴性对照空孔OD450≥ 1.0且< 1.6, 两孔间OD450差距小于0.2。

按照抑制率(PI)=(阴性对照OD450平均值-样品血清OD450)/阴性对照OD450平均值× 100%, 抑制率≥ 50%时判为抗体阳性, 否则为阴性。

1.3 病毒分离

1.3.1 样品准备 在1.5 mL微量离心管中加入1 mL PBS、200 μ L肝素抗凝血红血球, 颠倒混匀5次; 1 000 r/min离心10 min, 轻轻吸弃上清; 加入800 μ L灭菌双蒸水, 涡旋混匀, 确保红细胞充分裂解, 准备好的样品作为接种液备用。

1.3.2 接种细胞 将长成单层的BHK-21细胞瓶, 根据血液样品编号对细胞瓶进行编号, 每个样品标记2瓶; 弃去细胞瓶中的培养液, 取500 μ L接种液接种到相对应的细胞瓶内, 每个样品接种2瓶, 置37 ℃培养箱感作1 h后加入10mLMEM维持液, 再置37 ℃培养箱中培养7 d, 每天观察细胞病变情况, 与对照细胞相比, 病变程度以+、++、+++表示, 有25%细胞出现CPE时记做+, 50%细胞出现CPE时记做++, 75%细胞出现CPE时记做+++; 连续在BHK-21细胞上传3代, 出现CPE的细胞瓶4 ℃保存, 扩大培养, 存于-80 ℃冰箱, 待鉴定; 3代都无CPE的细胞瓶视为病毒分离阴性, 可弃之。

1.4 阳性分离物鉴定

1.4.1 提取阳性分离物的RNA 取接毒后CPE达到70%的单层培养BHK-21细胞, 按TRizol试剂盒方法抽提总RNA。

1.4.2 引物的设计与合成 根据基因库提供的BTV各基因序列, 通过分析软件, 对BTV较为保守的RNA7(VP7基因)片段设计引物[9]:

BTV-S7-A:5'-GTTACAATGCGCCCGACATC-3'

BTV-S7-B:5'-TGTAATGCGGCCTGTCCAT-3'

扩增产物长度为555 bp。引物由大连天宝生物工程公司合成, 用RNase-free ddH2O稀释成20 pmol/μ L备用。

1.4.3 病毒双链RNA变性 在PCR反应管中加入所提取的核酸样品10 μ L, 甲酰胺5 μ L, 95 ℃ 5 min, 速取出置冰上。

1.4.4 cDNA的制备 在PCR反应管中加入变性好的模板RNA 8 μ L, 下游引物1 μ L, dNTP Mixture 1 μ L, 65 ℃保温10 min, 冰浴2 min, 置于冰上; 加入10 μ L提前配好混匀的反应5× PrimeScript Buffer 4 μ L, RNase Inhibitor(40 U/μ L)0.5 μ L, PrimeScript Reverse Transcriptase(200 U/μ L)1 μ L, RNase free dH2O 4.5 μ L, 此时PCR反应管里共有液体20 μ L, 混匀后, 42 ℃ 60 min, 70 ℃保温15 min后冰上冷却, 得到的cDNA溶液, -20 ℃保存备用。

1.4.5 病毒的RT-PCR鉴定 以cDNA为模板, 在50 μ L PCR体系中完成反应, 反应参数为95 ℃ 52 min, 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40个偱环; 72 ℃ 5 min, 4℃ 保持。取PCR扩增产物5 μ L与1 μ L 6× DNA上样Buffer混匀, 点样于12 g/L琼脂糖凝胶上样孔中, 80 V电泳30 min, 置于凝胶成像系统中紫外光照射, 观察记录结果。

1.4.6 病毒血清型的鉴定 Karber方法计算TCID50, 应用南非参考毒株标准血清按《澳大利亚动物疫病诊断技术标准》进行中和试验[16]。

2 结 果

自2014年建立监控群以来, 共计采血80次, 收集监控动物血清1 200份, 所有血清均在采血后1周之内进行BTV C-ELISA检测, 监控动物抗体转阳后, 抗体阳性持续5周以上, 监测数据连续可靠。统计监控动物血清蓝舌病抗体检测结果, 3年均有动物感染, 2014年感染率60%, 2015年感染率为33.33%, 2016年感染率为13.33%; 黄牛感染率略高于山羊感染率(表1)。

表1 2014-2016年监控动物蓝舌病感染情况统计 Tab.1 Natural infection rate of bluetongue disease in sentinel animals from 2014 to 2016

统计3年的监控动物蓝舌病抗体检测结果, 监控动物感染BTV的时间均在6-10月之间, 其中以7月和10月感染动物最多, 且7月连续3年都有动物感染(图1)。

图1 2014-2016年监控动物感染BTV的数量和感染时间统计图Fig.1 Number of sentinel animals infected with BTV and the time of infection during 2014-2016

16个感染BTV的监控动物中有7个分离到病毒, 共9株, BTV对BHK-21细胞上的病变产生明显的细胞病变, 细胞病变产生比较迅速, 接种BHK-21细胞24 h就可以观察到明显细胞病变, 48 h CPE可达到70%以上, 细胞病变特点为变圆、肿胀、脱落(图2)。

图2 BTV对BHK-21细胞的致病变作用
A:正常BHK-21细胞; B:感染BTV 48 h后的BHK-21细胞Fig.2 CPE of BHK-21 cells infected with BTV

2014年在3头感染黄牛红细胞内分离获得4株BTV共3个血清型, 分别为BTV-2、4、12型, 感染山羊红细胞内未能获得分离毒株; 2015年在1头感染黄牛红细胞内分离获得1株BTV, 鉴定为BTV-9型, 在3只感染山羊红细胞内分离获得4株BTV, 均为BTV-16型; 2016年未能获得分离毒株(表2)。

表2 2014年-2016年BTV分离鉴定情况统计 Tab.2 Isolation and identification of the BTV details during 2014-2016

2012年在师宗县分离的蓝舌病病毒包含7个血清型, 分别为BTV-1、BTV-3、BTV-5、BTV-9、BTV-12、BTV-16、BTV-24型, 2014年新增了2个血清型BTV-2、BTV-4型。(图3)

图3 近年来师宗县分离蓝舌病毒株的血清型统计图Fig.3 Serotype of the BTV was isolated in Shizong County

3 讨 论

2008-2009年云南省境内地区牛、羊蓝舌病的感染率为23.0%, 其中师宗县370份羊血清中, BTV抗体阳性率为0%[17]。本次监测实验由于监控动物是在自然界放牧饲养管理, 干扰试验结果因素较多, 且监控动物数量有限, 因此在检测结果中出现了2016年山羊感染率为0%的情况, 但2016年的黄牛感染率为20%, 证明2016年仍有蓝舌病病毒活动, 且3年平均牛、羊感染率为35.56%, 远高于2008-2009年的调查结果, 说明蓝舌病病毒在师宗县长期存在并有活跃的趋势。

蓝舌病是由库蠓传播的一种虫媒病毒病, 因此蓝舌病的活动规律主要取决于库蠓的活动情况, 1991年李华春等在调查蓝舌病传播媒介库蠓时, 曾报道云南省师宗县多在7-10月发生蓝舌病[18], 与本次监测结果一致。库蠓在6月上旬开始活动, 7-9月是活动高峰期, 这样的季节性消长规律使蓝舌病的流行也具有明显的周期性和季节性, 也提示了蓝舌病的防控关键时期是每年的6-10月, 且杀虫灭蚊尤其重要。

2014-2016年, 有16个监控动物感染BTV, 从其中7个感染动物的红细胞内分离到9株BTV, 包含5个血清型, 病毒分离效率较高, 证明本研究的病毒分离方法成熟。2014年21号黄牛红细胞内同时分到2株病毒, 且为不同的血清型, 该黄牛可能被同时携带两个血清型的媒介昆虫叮咬, 也可能是两个携带不同血清型的媒介昆虫在1周之内都叮咬了该黄牛[19]。2015年2号山羊红细胞内分离到BTV-16型毒株, 时隔两周又分离到同一毒株, 证明BTV在动物红细胞中至少存活14 d。

2012年, 在师宗县分离到的BTV毒株已包含7个血清型, 2014年增加至9个, 其中BTV-5、-9、-24为我国首次发现[20], 可能还有未被发现的血清型, 说明师宗县存在多种血清型的BTV流行, 且以BTV-3、BTV-5、BTV-16为优势血清型。多种血清型同时存在, 型与型之间无交叉保护, 这给蓝舌病的防治带来了严峻考验, 不仅需要继续对BTV感染情况及活动规律进行研究, 还急需开展蓝舌病血清型灭活疫苗、新型疫苗研究, 开发多价蓝舌病通用疫苗, 建立疫苗生产技术储备[21]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Najarnezhad V, Rajae M. Seroepidemiology of bluetongue disease in small ruminants of northeast of Iran[J]. Asian Pacific J Tropic Biomed, 2013, 06: 492-495. DOI: 10.1016/S2221-1691(13)60102-1 [本文引用:1]
[2] Shoorijeh SJ, Ramin AG, Maclachlan NJ, et al. High seroprevalence of bluetongue virus infection in sheep flocks in West Azerbaijan, Iran[J]. Comparat Immunol Microbiol Infect Dis, 2010, 33(3): 243-247. DOI: 10.1016/j.cimid.2008.10.008 [本文引用:1]
[3] 苗海生, 李乐, 朱建波, 等. 蓝舌病病毒阻断ELISA抗体检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2014, 36(2): 111-115. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0589.2014.02.07 [本文引用:1]
[4] 林汉亮, 冉多良, 王文. 蓝舌病研究进展[J]. 新疆畜牧业, 2008, (1): 4-7. DOI: 10.16795/j.cnki.xjxmy.2008.01.002 [本文引用:1]
[5] Qin S, Yang H, Zhang Y, et al. Full genome sequence of the first bluetongue virus serotype 21 (BTV-21) isolated from China: evidence for genetic reassortment between BTV-21 and bluetongue virus serotype 16 (BTV-16)[J]. Arch Virol, 2018: 1-4. DOI: 10.1007/s00705-018-3718-9 [本文引用:1]
[6] 张胜男, 常建华, 韩明浩, 等. 蓝舌病的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2015(19): 57-60. DOI: 10.13881/j.cnki.hljxmsy.2015.1753 [本文引用:1]
[7] 刘景利, 孙建宏, 管雪婷, 等. 蓝舌病的研究进展[J]. 畜牧兽医科技信息, 2005(9): 19-21. DOI: 10.3969/j.issn.1671-6027.2005.09.007 [本文引用:1]
[8] Cook G. Effect of global warming on the distribution of parasitic and other infectious diseases: a review[J]. J R Soc Med, 1992, 85(11): 688-691. [本文引用:1]
[9] Martens P, Moser SC. Health impacts of climate change[J]. Science, 2001, 292: 1065-1066 [本文引用:2]
[10] Patz JA, Campbell-Lendrum D, Holloway T, et al. Impact of regional climate change on human health[J]. Nature, 2005, 438: 310-317. DOI: 10.1038/nature04188 [本文引用:1]
[11] 肖雷, 孟锦昕, 李楠, 等. 蓝舌病病毒BTV-1型的分离鉴定[J]. 上海畜牧兽医通讯, 2014(4): 5-7. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7725.2014.04.002 [本文引用:1]
[12] 张念祖, 张开礼, 李志华, 等. 绵羊蓝舌病的调查研究报告[J]. 云南畜牧兽医, 1989(4): 3-13. [本文引用:1]
[13] 肖雷, 孟锦昕, 李楠, 等. 云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定[J]. 中国动物传染病学报, 2014, 22(4): 1-6. [本文引用:1]
[14] Mertens PP, Burroughs JN, Walton A, et al. Enhanced infectivity of modified bluetongue virus particles for two insect cell lines and for two Culicoides vector species[J]. Virology, 1996, 217: 582-593. DOI: 10.1006/viro.1996.0153 [本文引用:1]
[15] 苗海生, 李乐, 廖德芳, 等. 蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立和比较研究[J]. 云南农业大学学报(自然科学), 2014, 29(1): 58-62. DOI: 10.3969/j.issn.1004-390X(n).2014.01.012 [本文引用:1]
[16] Gard GP, Kirkland PD. Bluetongue virology and serology[J]. Aus Stand ard Diagnost Techniq Anim Dis, 1993. [本文引用:1]
[17] 肖雷, 朱建波, 杨仕标, 等. 云南省边境地区2008-2009年度蓝舌病血清学调查[J]. 上海畜牧兽医通讯, 2010, (6): 22-23. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7725.2010.06.010 [本文引用:1]
[18] 李华春, 张开礼, 李志华. 蓝舌病传播媒介云南库蠓的调查[J]. 云南畜牧兽医, 1991(3): 86-87. [本文引用:1]
[19] Rogers DJ, Rand olph SE. Studying the global distribution of infectious diseases using GIS and RS[J]. Nat Rev Microbiol, 2003, 1(3): 231-237. DOI: 10.1038/nrmicro776 [本文引用:1]
[20] Yang H, Xiao L, Wang J, et al. Phylogenetic characterization genome segment 2 of bluetongue virus strains belonging to serotypes 5, 7 and 24 isolated for the first time in China during 2012 to 2014[J]. Transbound Emerg Dis, 2017, 64(4): 1317-1321. DOI: 10.1111/tbed.12479 [本文引用:1]
[21] 苗海生, 李乐, 朱建波, 等. 冷藏蓝舌病样品的Real-time PCR检测和病毒颗粒稳定性研究[J]. 中国畜牧兽医, 2013, 40(6): 41-44. DOI: 10.3969/j.issn.1671-7236.2013.06.008 [本文引用:1]