We identified the species and molecular genetic characteristics of Leishmania protozoa in Hancheng City, Shaanxi Province. The SSU rRNA genes of Leishmania positive samples were amplified and sequenced. The sequencing results were compared with the SSU rRNA gene sequences of Leishmania in different regions and species reported in the literature. The mutation sites were analyzed and the phylogenetic tree was constructed. Three specimens’ SSU rRNA gene amplification sequences, which were highly homologous to L.donovani, L.Chagas and L.infantum, were successfully sequenced. The sequences had one base variation, comparing with the L. infantum in the UQ-II mutant region. Phylogenetic tree analysis showed that Leishmania from Shaanxi Province, Gansu Province and L. infantum strains from Xinjiang were gathered into one cluster. Epidemiological data and SSU rRNA sequence analysis showed that the pathogens of visceral leishmaniasis in Hancheng City, Shaanxi Province should be Leishmania infantum.
利什曼原虫所致的利什曼病, 可分为内脏利什曼病(又称为黑热病)、黏膜皮肤利什曼病和皮肤利什曼病。引起不同临床类型的利什曼原虫在形态结构上没有明显差别, 传统方法对虫株的鉴别主要依靠流行病学及临床资料[1]。基于分子研究的方法已被广泛运用于微生物和寄生虫的分类, 相别于传统方法, 具有快速、准确, 且可与国内外数据比对构建进化关系的特点。SSU rRNA是真核生物一个较保守的基因, 但在原虫的不同种间的变异比原核生物还要大, 可用于原虫种属之间亲缘关系的研究[2, 3]。本文研究分析了陕西省韩城市利什曼原虫标本的SSU rRNA基因片段, 与国内外发表的该基因数据库进行比对, 从分子水平确立陕西省利什曼原虫种属分类地位。
1.1.1 虫株标本 采集病犬及病例骨髓标本, 以NNN培养基25 ℃进行培养, 第10 d收集培养液镜下观察, 发现有前鞭毛体存在者为培养阳性。取培养液用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen公司生产)提取基因组DNA。
1.1.2 病例标本 3例有黑热病疫区接触史, 症状典型的病例, 取骨髓穿刺液, 瑞氏染色, 镜下观察发现典型利杜体者为阳性, 取骨髓液用QIAamp DNA Mini Kit提取基因组DNA。
1.1.3 媒介标本 采集病区白蛉标本, 单只装管, 冷冻研磨砂, 以天隆动物组织基因组核酸提取试剂盒(西安天隆公司生产)提取基因组DNA, 以kDNA引物RV1、RV2及K13A、K13B[4]扩增阳性者作为媒介感染的阳性标本。
1.2.1 SSU rRNA引物及扩增条件 参照文献[5], 研究序列SSU rRNA的上游引物为R222:TATTGGAGATTATGGAGCTG; 下游引物R333:AAAGCGGGCGCGCGGTGCTG。由上海生工公司合成。PCR试剂盒由Takara公司生产, 反应体系50 μ L:10× PCR缓冲液5 μ L, 上下游引物各1 μ L, 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP, 各2.5 mmol/L)1 μ L, 加水补齐至47.6 μ L, 加入模板DNA 2 μ L, 100 ℃, 解链10 min, 再加入Taq酶(2.5 U)0.4 μ L, 再按照94 ℃ 75 s, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 60 s循环32次, 最后72 ℃延伸10 min。产物大小约395 bp。
1.2.2 PCR产物测序 上述PCR产物由QIAxcel Advanced毛细管电泳仪(Qiagen公司生产)进行电泳检测, 条件为AM420, 条带清晰且产物大小符合目的序列的PCR产物送上海生工公司进行纯化, 双向测序拼接, 将拼接序列提交GenBank数据库。
获得1份利什曼原虫培养虫株, 1份犬骨髓、3份病例骨髓、2份白蛉共7份利什曼原虫kDNA阳性标本。对7份标本进行SSU rRNA扩增, 毛细管电泳有5份标本出现大小约400 bp的目的条带, 见图1。来自白蛉的核酸标本未扩增出目的条带, 有3份标本条带较淡, 有一份出现杂带, 未影响测序。将出现条带的样本进行双向测序, 有3份标本测序成功, 分别为QB41-1、QB41-2(单向测序)、Niufei。
对测序成功的3条序列提交GenBank, 获得登录号分别为MG020105、MG020106、MG020107, 下载文献[3, 7-8]中的序列以及通过Blast获得的代表性利什曼原虫的SSU rRNA序列, 组成本研究所用的序列数据信息表如表1。
2.2.1 序列同源性分析 利用DNAStar MegaAllign7.07进行比对分析, 发现本研究的3条序列中有2条完全相同, 另一条测序不完整。与GenBank登录号为HQ895849和HQ895854的序列在第49位均为C、第92位均为A, 与其余序列有3-4个核甘酸的差异, 序列对比图未列出, 序列同源分析如图2, 可见陕西MG020106_QB41-1、MG020107_Niufei标本与甘肃HQ895849和新疆HQ895854虫株100%同源, 与其余国内利什曼原虫同源性在98%以上。
2.2.2 利什曼原虫SSU rRNA多变区段序列比较 将GenBank下载的序列与本研究的3条序列以Clustal W方法对齐, 分析两个独特序列区UQ-I和UQ-II的序列点突变的情况, 见表2。可见陕西3条序列点突变完全一致, 不同于其余所有虫株。仅与甘肃HQ895849、新疆HQ895854、 印度L.d.DD8、M81430、苏丹X07773、XR_001203206虫株在374位有一个点位突变, 而与国内其它虫株的突变差异较大。另外, 陕西省虫株MG020105、MG020107在45、46位还有两个碱基缺失。在与国外的虫株比较中, 在72位、312位、376附近还有碱基位点的变化, 表中未列出。
将本研究序列与GenBank下载的的SSU rRNA序列导入MEGA6.06, 以Clustal W对齐后, 构建系统进化树如图3, 可见国内利什曼原虫聚为3支, 陕西省的3条序列与杜氏利什曼原虫HQ895854、HQ895849、X07773、夏科氏利什曼原虫M81430以及婴儿利什曼原虫XR_001203206聚为一类。而其余来自北京、新疆、甘肃、四川等地的杜氏利什曼原虫聚在另一支。1株来自江苏的虫株与墨西哥利什曼原虫、硕大利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫聚为一支。
陕西省是我国黑热病的传统疫区, 解放前后对人民群众生命健康造成极大的危害。韩城市1967-2011年之间无病例发生。近年来在该地区屡见黑热病病例报告, 甚至出现小的暴发点[9]。但陕西省缺乏利什曼原虫病原体的研究资料, 2017年从韩城市病犬分离到1株利什曼原虫, 并获得了数份利什曼原虫PCR阳性的标本。本文采用了SSU rRNA基因作为研究序列, 以韩城市犬只、白蛉、病例的标本, 对SSU rRNA基因片段进行PCR扩增, 对扩增产物进行双向测序拼接, 所获得的3条序列分别来自犬只与病例, 将序列与国内外发表的SSU rRNA进行对比分析, 构建了基于SSU rRNA的系统发育树。结果表明陕西省韩城市的标本与杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫以及夏科氏利什曼原虫聚为一类。
SSU rRNA(核糖体小亚基RNA)具有一个rRNA分子, 在真核生物为18S, 其基因序列及二级结构是至今发现的最为保守的一类核糖体基因, 以此构建的系统发育树, 在分子水平上更适合反映原虫的进化关系。本研究利用SSU rRNA构建的系统发育树表明, 陕西省的利什曼原虫与新疆、甘肃、苏丹的杜氏利什曼原虫以及夏科氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫聚类为一支。而国内其余地区的利什曼原虫则聚在另一支, 一株来自江苏的虫株与墨西哥利什曼原虫、硕大利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫聚为一支。与曹得萍[3]、Guan W[6]等人的研究结果一致, 从SSU rRNA的序列发育树来看, 陕西省的原虫与新疆、甘肃、苏丹的杜氏利什曼原虫以及婴儿、夏科氏利什曼原虫的遗传关系近缘。此3类均是引起内脏利什曼病的原虫, 世界卫生组织建议将其归属于杜氏利什曼原虫的种群[10]。Van Eys[4]等研究了9株利什曼原虫的SSU rRNA序列, 认为其中存在2个独特的的突变序列区, 分别是1-148位的UQ-1, 包括7个突变点, 229-392位的UQ-II包括2个突变点。卜毅玲[7, 8]等人研究了5株利什曼原虫的SSU rRNA基因片段, 发现在UQ-1上有3个碱基突变, UQ-II上有2个碱基突变。并认为在UQ-II区中, 只有山丘疫区存在2个点突变, 与平原疫区的L.d.SD2也存在碱基序列上的不同, 认为我国山丘疫区与平原疫区存在种间的差异。本研究所分析的陕西省3条SSU rRNA序列不同于已发表的任何一条序列, 特别是与国内众多利什曼原虫序列突变位点差异较大, 仅与HQ895854、HQ895849在374位有一个位点突变(T变C)。同时还与来自印度的L.d.DD8、苏丹的X07773以及另一株夏科氏利什曼原虫在同样位点有突变(T变C), 不同的是, 苏丹的X07773和夏科氏虫株在376位有C碱基的插入。这些突变与郑学礼[11]等报道的新疆皮肤型利什曼原虫也有明显的差异。而芦殿梅[12]等用RAPD证实, 印度平原型标准株L.d.DD8与国内荒漠型的HQ895854遗传距离较近, HQ895854虫株1977年分离自新疆塔里木硕大白蛉[3, 7], 属婴儿利什曼原虫。历史资料表明, 陕西省黄土高原病区属犬源性疫区, 病原体为婴儿利什曼原虫[13]。韩城市位于黄土高原与关中平原的交界地带, 流行学资料显示犬只感染率高而人的感染率低, 且以儿童发病较多, 符合犬源性疫区特征, 该疫区的原虫应为婴儿利什曼原虫[13, 14], 与SSU rRNA序列分析研究结果一致。
陕西省关中平原地区的人源性利什曼原虫疫区已消灭多年, 陕北黄土高原及陕南山区偶有内脏利什曼病散发[15, 16]。韩城市位于黄土高原与关中平原交界地带, 自1967年以后再无病例报告, 据郭晓莉[9]等报道, 韩城市2012年暴发黑热病之前, 有人从外地引进藏獒饲养, 间隔45年再度出现利什曼病的流行, 据报道[14, 17]在犬源性疫区, 野生动物也参与了传播过程, 成为保存宿主之一。韩城的利什曼病是本地还是输入入值得探讨。虽然基于SSU rRNA的系统发育树中陕西虫株与新疆聚为一支, 但突变位点来看与新疆1977年分离株有1个位点的差异, 一方面SSU rRNA虽然可以代表一定的遗传变异关系, 但毕竟序列较少, 仍有局限性存在, 另一方面二者相隔分离时间相差40年, 是距离年代久远的变异还是陕西的虫株, 由于缺乏陕西省利什曼原虫本底资料, 还需要进一步的研究。
The authors have declared that no competing interests exist.
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