肝螺杆菌是一种人兽共患病病原,可引发多系统疾病。其致病性与毒力因子有关,细胞致死性肿胀毒素会阻断细胞在G2/M期生长,引起细胞凋亡,同时还能激活NF-κB通路,释放细胞因子,引发炎症;鞭毛蛋白、粘附素、铁蛋白DPS、抗氧化酶、尿素酶等,利于肝螺杆菌定植、生长和发挥致病作用;毒力基因包含一个Ⅵ型分泌系统(T6SS),可将毒力相关基因编码的毒力蛋白释放到机体中,引起机体免疫反应。本文阐述了肝螺杆菌毒力因子对机体损伤的作用机制,旨在为深入了解肝螺杆菌致病机制提供参考。
Helicobacter hepaticus ( H.h) is a zoonosis pathogen, its infection is closely related to its multi-system diseases. Hh-induced-diseases are associated with virulence factors. Among these factors, cytolethal distending toxin (CDT) has been mostly elucidated. It could not only arrest cell growth in G2/M phase of eukaryotic cell cycle, causing apoptosis, but also activate the nuclear factor-kappa B pathway, releasing cytokines, and initiate inflammatory response. The flagellin and the adhesion, DNA binding protein from starved cells (DPS), antioxidase and urease are helpful for H.h to colonize, grow and play pathogenic roles in intestinal tract. Virulence genes include a type Ⅵ secretion system (T6SS), it can release virulence proteins into the host, initiating immune response. In this review, the virulence factors of H.h and their pathogenic roles are described for further understanding of the potential pathogenic mechanism of H.h.
肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus, H.h)是肝肠螺杆菌属(Enterohepatic Helicobacter Species)中一员, 可感染多种哺乳动物。1992年, Fox等人在Fredrick-Institute癌症中心研究癌症药物作用时, 从A/JCr小鼠肝脏中发现并分离出Hh, 且该菌也是螺杆菌属中第一个被报导可诱发肝癌的病原[1]。Hh自然宿主是鼠类啮齿动物, 大鼠和小鼠的感染率较高[2], 但在人类肝脏组织中也有检出报导, 猜测是一种细菌-肝炎-肝癌的发病模式[3]。用Hh感染小鼠, 尤其是免疫缺陷鼠, 引发慢性活动性肝炎、结肠炎、肝细胞癌和结肠癌, 该症状与人类相关疾病极其相似, 可为研究癌症发生机制提供模型[4, 5, 6]。用CD41 T细胞表达高水平CD45RB形成的CD45RBhighC
此外, Hh感染也与人类其它疾病相关。Tahereh等发现Hh可通过污染的水和食物侵入人体组织, 产生致癌物并破坏正常细胞DNA结构[4]。Hamada等采用胆汁标本原位分析技术对胆结石、胆囊炎和胆囊息肉患者进行检测, 发现胆汁中存在Hh, 证实Hh可能与人类肝胆疾病有关[8]。血清流行病学调查显示, 健康人群血清中Hh阳性率为26.7%, 肝胆疾病患者(乙肝和丙肝阴性)的Hh抗体阳性率为38.7%, 乙肝或/和丙肝患者抗体阳性率在60%以上[9], 而胆结石和胆囊瘤患者的Hh阳性率分别高达82%和87.5%[10], 提示Hh感染可促成病毒性肝炎转变成肝胆肿瘤。Hh还能引发乳腺癌, 可能是宿主免疫失调导致癌细胞扩散的结果[11]。Hh感染后, 临床表现的多样性揭示其致病机制的复杂性, 本文就Hh的毒力因子及其致病机制研究进展作简要概括。
细胞致死性肿胀毒素(Cytolethal distending toxin, CDT)是革兰氏阴性菌的毒力因子, 它是由cdtB基因编码的A亚单位和cdtA、cdtC基因联合编码的B亚单位构成的异源二聚体A-
cdtB是CDT的毒性基因, 通过CdtA连接细胞膜上的脂筏, 依靠动力将CdtB蛋白胞吞入膜内, 再由CdtC将CdtB移入胞核[13]。CdtB进入核内后, 表达类似脱氧核糖核酸酶I的功能, 导致DNA双链断裂[14, 15]。断裂后的DNA刺激ATM激酶, 通过磷酸化作用激活Chk2激酶, 活化的p-Chk2激活CDC25C磷酸酶, 降低CDC25C磷酸酶的活性, 使细胞G2/M期阻滞。同时, p-Chk2还参与激活p53, 活化的p-p53加快细胞周期依赖性激酶抑制剂p21的合成, 使p21与cyclin B/p-Cdk1形成复合体, 阻止cyclin B/p-Cdk1脱磷酸化, 导致G2期终止[16]。该机制由CDT损伤细胞DNA来阻断细胞G2/M期, 引起细胞凋亡。
NF-κ B是由p50和p65组成的二聚体, HhCDT可激活NF-κ B信号通路引发炎症。静息状态时, 胞浆中NF-κ B与抑制因子Iκ B结合形成三聚体p50-p65-Iκ B。CDT进入胞浆激活聚合物, Iκ B解离, p50上转移信号将NF-κ B转入核内, p65暴露结合位点, 与DNA结合。IBD患者结肠细胞中的NF-κ B通路被CDT激活, 并进入核内与DNA的κ B位点结合, 引发炎症, 结合若不被及时终止, 炎症则无法消退, 暗示Hh感染会影响IBD发展[14]。NF-κ B还可调节白细胞介素、肿瘤坏死因子、凋亡抑制因子等多基因表达, 参与炎症、肿瘤、发育不良等多种病理生理过程[17]。例如造血细胞中NF-κ B的p50亚基能与IL-10抗体联合抑制结肠炎发展, 提示在先天免疫中, NF-κ B的亚基能促进IL-10抗体抑制肠炎[18]。
氧化应激(oxidative stress)是机体受外来物质刺激时, 高活性分子如活性氧自由基产生过多, 氧化物无法将其彻底清除, 高活性分子可破坏细胞膜并损伤细菌核酸结构, 使骨架单双链断裂, 引入外来碱基和糖基, 交联其他分子, 使细胞复制中止。Hh进化过程中产生的过氧化氢酶和氢化酶可催化活性分子, 抵抗宿主氧化反应。
过氧化氢是一种由宿主细胞释放的活性氧自由基, 使细菌氧化应激死亡。研究表明, 感染Hh的小鼠, 体内的8-氧鸟嘌呤和脂质过氧化水平会显著升高, 说明其氧化大分子数量会在感染期间增加[19]。Hh的过氧化氢酶KatA, 可将宿主细胞产生的过氧化氢分解成氧气和水, 从而减少细菌的氧化应激效应。细菌通过该方式可持续侵袭宿主, 导致机体免疫力降低。过氧化氢酶常存在于细胞质和细胞间质中, 但只有细胞间质中过氧化氢酶具有分解过氧化氢的能力并传递免疫应答信号[1]。
氢化酶是Hh内含镍金属酶, 可催化氢气氧化成质子和电子, 并产生能量储存于菌体中。其能量会被用于合成其他毒力因子或酶来诱发肝炎、肠炎和肠坏疽等疾病[20]。已知Hh氢化酶亚基有四种, 分别为HyaA、HyaB、HyaC、HyaD, 其中HyaB蛋白含量最高。研究表明, 在含氢的液态环境中, 野生型Hh与敲除hyaB基因的突变株相比, 前者的生长状况更好, 表明hyaB基因参与氢化酶氧化氢气的过程[20]。而同时敲除hyaA和hyaB基因, 氢化酶便丧失活性, 提示该基因在呼吸酶中起重要作用[21]。
DPS(DNA binding protein from starved cells, DPS)属于铁蛋白家族, 它是细菌复杂防御系统的一部分, 用于保护细菌DNA免受氧化损伤。YANG等报导:野生型Hh在含5%氧的条件下也生长良好, 而敲除dps基因的突变株在含3%氧的条件下都无法生长[22]。DPS易形成α 螺旋, 在其首个N端富含大量赖氨酸残基, 是DNA的结合位点。尽管所有DPS均能与亚铁离子结合, 但它们不能连接DNA, 无法起保护DNA的作用[23]。HhDPS在铁离子参与下能增强对DNA的结合能力, 而在缺乏铁离子的情况下, DPS蛋白会聚合在一起形成低聚物, 导致结合DNA的能力减弱[22]。DPS与细菌的DNA结合, 其复合物可保护Hh免受氧化应激, 以适应宿主环境逃避免疫攻击。
大约有40%的肝肠螺杆菌可产生尿素酶, 包括Hh[24]。Hh尿素酶是一种以金属镍为辅因子的多聚体脲酶, 其包含两个结构基因(ureAB), 编码尿素酶的结构蛋白和五个辅助基因(ureIEFGH), 编码辅助蛋白。尿素酶活性是由活性部位镍含量决定的, 而提高镍含量则需辅助蛋白将Ni2+插入到活性部位。研究表明, 分别敲除ureF、ureG、ureH基因会使尿素酶失活, 而敲除ureE基因仅降低其活性[25], 表明ureE是尿素酶的非活性成分表达所必需基因。Hh尿素酶ureI基因上游无启动子, 其必然会影响转录, 提示该系统可能仅协助氮水平代谢和提供铵盐的储存场所[26]。尽管如此, 尿素酶可水解尿素产生氨, 由于Hh对酸敏感, 其尿素酶也无法适应酸性条件, 而尿素酶水解尿素产生的氨与酸中和, 为Hh生长提供适宜环境[27]。且氨也具有细胞毒性, 可阻止氢离子进入粘膜组织, 并大量聚集于粘膜外侧, 造成细胞损伤。
Hh具有两级鞭毛, 其结构是由flaA和flaB基因编码的两个鞭毛蛋白FlaA和FlaB。鞭毛是Hh的运动器官, 鞭毛蛋白也是一种重要的毒力因子。鞭毛既可促进细菌运动, 也能吸附于粘膜表面[6], 对机体造成损伤。其中由等位基因flaA1和flaA2编码的FlaA蛋白起吸附作用[28], Fox等表明, flaA-基因突变株的Hh无运动性且不能定植于粘膜表面, 而flaA1基因在细菌运动中起主要作用。Hh的FlaB蛋白是仅由T细胞介导的抗原, 具有一定的保守性, 于是可利用flaB基因作为鉴定Hh的特异性基因[29]。
黏附素(Adhesins)是细菌表面具有附着作用的集合体, 宿主细胞中存在由糖蛋白和糖脂组成的黏附受体, 黏附素可直接将Hh黏附在宿主细胞表面[30]。不同细菌黏附上皮细胞的过程有所差别, 但主要经过两个步骤:首先依靠静电力、疏水作用力、粘膜接触等趋化作用, 与上皮细胞发生非特异性接触, 再借助分子间化学键使细菌与受体发生特异性结合[31]。Hh黏附上皮细胞, 为其在宿主内繁殖、引起疾病创造良好条件, 但具体黏附机制仍不清楚。
外膜蛋白(Outer membrane proteins)是仅存于革兰氏阴性菌中的特殊蛋白, 可与其他物质协同作用增强致病性。与Hh相关的外膜蛋白是由11个基因编码的Hor蛋白家族, 该蛋白具体功能尚不明[1]。研究表明, 外膜蛋白和黏附素能促进细菌定植于宿主细胞具有相同原理[32], 且外膜蛋白可引起细胞因子释放, 如IL-1、IL-17、TNF-α 等, 引发炎症[33]。
脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁中的特殊成分, 属内毒素。HhLPS的毒性成分为短链脂肪酸构成的脂质A, 是固有免疫最强的诱导剂[34]。LPS具有高效的生物学活性, 不仅能激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞, 还能促进细胞因子生成。研究显示, 在感染鼠体内, Hh的LPS可协助其逃避胃粘膜的固有免疫, 造成全身性炎症等综合反应[28]。细胞膜上的CD14分子, 可与LPS结合转入膜内, 产生后续效应。还有报道表明由LPS组成的复合物作为配体可与膜表面TLR4受体相连参与激活NF-κ B通路, 引发炎症, 但该复合物具体结构仍未可知[35]。
Hh毒力基因(virulence-associated genes)存在于其染色体和质粒中, 编码相关毒力基因的区域叫毒力岛, 同时该基因还兼有编码与侵袭力相关的T6SS系统功能。
毒力岛(Pathogenicity Island, PAI)是由Hh染色体组编码的多个相关毒力因子, 它们DNA的G+C含量有明显差异[30]。大多数毒力岛与tRNA基因有关, 它们与细菌染色体组tRNA保守区高度毗连, 两翼各有一段可识别切割酶的正向重复序列(direct repeats, DR)。Hh基因组区域中有一个71 kb大小的HHGI1基因, 该基因也呈现Hh毒力岛的功能特点[30], 但研究发现HHGI1与tRNA无关, 两翼也无DR存在。用雄性A/JCr小鼠感染敲除完整或部分HHGI1基因的突变株, 肝炎的发病率均降低[36]。敲除同源基因组HhPAId1的Hh接种于IL-10-/-的B6.129小鼠, 与接种Hh标准株的对照小鼠相比, 前者在肠内有更高的表达水平, 但盲肠结肠炎和组织增生的发病率却降低[37], 而血清学调查也显示突变株的Th1型免疫相关IgG2c抗体含量明显低于野生型抗体含量, 提示宿主激活免疫应答抑制Hh盲肠和结肠mRNA对促炎因子如IFN-γ 、TNF-α 、IL-17a的表达水平[6], 证明HHGI1是Hh毒力基因, 可调节细胞因子炎性介质。
Chow等[38]发现, HHGI1为一组由12个基因(HH0237、HH0242-HH0245、HH0247-HH0252、HH0291)编码的一系列蛋白组成的分泌机制, 这些蛋白包括结构蛋白、效应蛋白、调节蛋白和分子伴侣蛋白, 该机制称为细菌的Ⅵ 型分泌系统(T6SS)以倒置形式镶嵌于细胞膜[39]。T6SS通过丝/苏氨酸激酶和磷酸酶途径信号转导, 利用结构蛋白将效应蛋白由细菌内膜— 周质— 外膜路径转运到宿主细胞[40]。效应蛋白可在Hcp管道中通过, 由一种类似“ 针头结构” 的VgrG三聚体协助下穿透细菌细胞膜, 将效应蛋白释放到宿主体内, 引起免疫反应[41]。将HhT6SS中HH0252基因敲除, 感染该突变株比野生型表达IL-17、IL23、TNF-α 、IFN-γ 等细胞因子的水平更高[38], 患结肠炎概率也更高。目前对T6SS的研究甚少, 且T6SS的复杂性远高于前5种分泌系统, 同时还能影响细菌与机体间相互作用, 所以需要更为深入研究。
从最初发现Hh到对其致病性研究已有20多年, 近几年, 人类肠道疾病逐渐成为研究热点。在肠道性疾病中, 微生物感染起主要作用, 而肠炎又能引发肿瘤性疾病, 这对人类生命安全造成巨大威胁。目前IBD是人类最为关注的肠道疾病之一, 但因其病程长, 病因复杂, 涉及多方面因素, 因此该病发生发展难以得到有效控制且治疗效果不理想。
本文从免疫角度出发, 通过介绍Hh毒力因子, 以期理解人类机体炎性肠病以及恶性肿瘤的发生机制, 从而研发能治疗或预防慢性肝炎以及炎性肠病的新药物。对于Hh研究主要应用于啮齿类动物, 利用Hh构建小鼠IBD模型可促进理解人类肠道疾病发生经过以及病理变化, 为拓宽IBD研究思路提供新方向。
我国罹患肝炎、炎性肠病人数众多, 且传播迅速。Hh毒力因子研究表明, 微生物在致病过程的影响力越来越大, 而人体中某些蛋白可作为免疫学中的重要监视者, 存在于大多数细胞, 能控制基因参与炎症反应, 因此必须了解蛋白功能, 才能想出应对疾病难题的方法。
The authors have declared that no competing interests exist.