金丝桃素对小鼠巨噬细胞内刚地弓形虫速殖子的增殖抑制作用

引用本文

崔洁, 王旗, 杨小迪, 孙希萌, 汪瑞, 姜辉, 王守祥, 张敏, 魏明, 夏惠, 陈兴智, 沈继龙. 金丝桃素对小鼠巨噬细胞内刚地弓形虫速殖子的增殖抑制作用[J]. 中国人兽共患病学报, 2018,34(7): 583-587.
CUI Jie, WANG Qi, YANG Xiao-di, SUN Xi-meng, WANG Rui, JIANG Hui, WANG Shou-xiang, ZHANG Min, WEI Ming, XIA Hui, CHEN Xing-zhi, SHEN Ji-long. Inhibitory effect of hypericin on intracellular proliferation of Toxoplasma gondii in macrophages [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2018,34(7): 583-587. 复制到剪切板

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.098
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中国人兽共患病学报

金丝桃素对小鼠巨噬细胞内刚地弓形虫速殖子的增殖抑制作用

崔洁^1,^2,³, 王旗⁴, 杨小迪², 孙希萌⁵, 汪瑞², 姜辉², 王守祥², 张敏², 魏明², 夏惠², 陈兴智², 沈继龙¹

1. 安徽医科大学基础医学院病原生物学教研室;病原生物学安徽省重点实验室,安徽省人兽共患病重点实验室(安徽医科大学),合肥 230032

2.蚌埠医学院病原生物学教研室,安徽省感染与免疫重点实验室, 蚌埠 233030

3.蚌埠医学院显微形态综合实验室,蚌埠 233030

4.安徽省血吸虫病防治研究所,合肥 230061

5.首都医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室,北京 100069;

通讯作者:沈继龙,Email:shenjilong53@126.com

基金资助: 国家自然科学基金(No.81471983)资助; 蚌埠医学院自然科学基金面上项目(No.BYKY1653)资助; 安徽省大学生创新创业训练计划项目(No.201610367025)资助; 安徽省血吸虫病防治研究所科研基金项目(No.1603)资助

摘要

目的观察金丝桃素(Hypericin,Hy)对小鼠巨噬细胞内弓形虫的增殖抑制作用,为抗弓形虫天然药物的筛选提供线索。方法分离小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage,Mφ),建立体外Mφ感染稳定表达绿色荧光蛋白的弓形虫(RH-green fluorescent protein,RH-GFP)速殖子模型,观察不同剂量Hy的最佳作用效果。实验分4组:①A组(对照组),不加Hy;②B组(Mφ感染RH-GFP+100 μg/mL Hy);③C组(Mφ感染RH-GFP+200 μg/mL Hy);④D组(Mφ感染RH-GFP+400 μg/mL Hy),分别在培养1、2和3 h后利用荧光显微镜和流式细胞术观察计数感染的Mφ和游离速殖子在各药物浓度及各时间点的变化;透射电镜观察虫体超微结构的变化。结果与对照组相比,随着Hy浓度的增加和用药时间的延长,Mφ内速殖子数量明显减少,游离速殖子数量也显著减少,荧光强度逐渐降低;经药物组不同浓度Hy作用后,游离/Mφ内弓形虫的比值逐渐升高,至400 μg/mL剂量作用3 h后开始下降,游离与胞内速殖子比例的差异在同一时间段内均有统计学意义 ( P<0.05),但药物作用1 h或2 h各实验组之间无统计学差异 ( P>0.05),作用3 h各浓度组之间差异有统计学意义( P<0.05),各实验组同一药物浓度下在孵育1、2和3 h后效果增强( P<0.05)。透射电镜观察显示,随Hy作用时间延长,虫体逐渐出现肿胀,胞膜与基质之间空隙明显,空泡形成且增多、变大,胞膜断裂,内部结构溶解溢出。结论体外实验初步显示Hy呈剂量和时间依赖性地增强对Mφ内弓形虫速殖子增殖的抑制作用,可降低宿主细胞感染率,且对胞外速殖子有一定杀伤作用。

关键词: 金丝桃素; 刚地弓形虫; 巨噬细胞; 抑制

中图分类号:R382.5 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)07-0583-05

Inhibitory effect of hypericin on intracellular proliferation of Toxoplasma gondii in macrophages

CUI Jie^1,^2,³, WANG Qi⁴, YANG Xiao-di², SUN Xi-meng⁵, WANG Rui², JIANG Hui², WANG Shou-xiang², ZHANG Min², WEI Ming², XIA Hui², CHEN Xing-zhi², SHEN Ji-long¹

1. Department of Parasitology, School of Basic Medicine, Anhui Medical University, Hefei 230032, China

2. Department of Microbiology and Parasitology, Anhui Key Laboratory of Infection and Immunity, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China

3. Microscopic Morphology Integrated Laboratory, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China

4. Anhui Provincial Institute of Schistosomiasis Control, Hefei 230061, China

5. Department of Parasitology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China

Corresponding author: Shen Ji-long, Emial: shenjilong53@126.com

Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 81471983), the Project on the Natural Science Foundation of Bengbu Medical College (No. BYKY1653), the University Students’ Innovation and Entrepreneurship Training Programs of Anhui Province (No. 201610367025), the Project on the Scientific Research Foundation of Anhui Provincial Institute of Schistosomiasis Control (No. 1603)

Abstract

The suppressive effect of hypericin on the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii ( T.gondii) tachyzoites in mouse peritoneal macrophages was explored in this study. Macrophages were isolated and infected with T. gondii tachyzoites (type I, RH strain) expressing green fluorescent protein (GFP). There were four groups: the control group (macrophages infected with RH-GFP without treatment, group A) and the other three groups (macrophages infected with RH-GFP treated with different concentrations of hypericin: group B, with 100 μg/mL; group C, with 200 μg/mL; and group D with 400 μg/mL). Tachyzoites were collected after 1 hour, 2 hours, and 3 hours of treatment. The infected macrophages and the free parasites were observed under different concentrations of hypericin in various time intervals by fluorescence microscopy and flow cytometry. The ultrastucture of tachyzoites was also observed by transmission electron microscopy. Compared with the control group, the number and fluorescence intensity of tachyzoites were gradually decreased in a concentration and time dependent manner under the experimental condition. The ratio of free parasites to those within macrophages increased and reached the peak at the dosage of 400 μg/mL on 3 hours after treatment. With the extension of treatment duration, it was found that tachyzoites showed swelling and deformed; apparent gap appeared between cell membrane and matrix; more and bigger vacuoles were formed; the cell membrane became dissolved and disrupt, the inner structure overflowed. It’s suggested that the inhibition of hypericin on intracellular proliferation of T. gondii tachyzoites in macrophages is presented in a concentration and time dependent manner in vitro, meanwhile, a remarkable killing effect on free tachyzoites is also found.

Keyword: hypericin; Toxoplasma gondii; macrophage; inhibition

文章图片

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种顶复门的机会性致病原虫, 呈世界性分布, 可感染几乎所有温血动物的有核细胞, 引起人兽共患的弓形虫病^{[1, 2]}。在免疫功能正常者, 弓形虫感染多呈慢性隐性感染, 而在免疫功能缺陷者则可导致严重临床后果, 甚至死亡^[3]。胎儿发生先天性感染时可引起死亡, 存活者常出现先天性畸形、心脏病、智力发育不全等, 对优生优育产生较大影响^[4]。目前临床上主要的治疗药物包括磺胺嘧啶、乙胺嘧啶、螺旋霉素等^[5], 这些药物毒副作用大、疗程长或不易透过胎盘屏障, 且难以清除病原体, 治疗效果并不理想。因此研发毒副作用小、能有效控制弓形虫感染的新药仍是弓形虫病治疗的研究热点之一^[3]。

金丝桃素(Hypericin, Hy)是一种贯叶连翘植物的提取物, 为萘骈二蒽酮化合物, 是该植物中最具生物活性的物质。研究显示, Hy具有抗病毒、抗肿瘤和抗抑郁等作用, 可提高机体免疫力而且对正常细胞无毒副作用, 亦有激活T淋巴细胞、上调免疫功能的作用^[6]。蔡茹等^[7]发现Hy被光诱导后具有显著的体外杀伤日本血吸虫的效应。张克勤等^[8]报道Hy具有显著的抗艾美球虫(与弓形虫同属于顶复门原虫)的效果。本实验室的前期研究证实Hy具有显著的体外抗弓形虫速殖子的效果^[9]。本研究通过建立携带绿色荧光蛋白的弓形虫(RH-green fluorescent protein, RH-GFP)体外感染小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage, Mφ )模型, 观察Hy对Mφ 内弓形虫速殖子的抑制作用, 为Hy作为弓形虫病治疗药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物 Hy购自上海经科化学有限公司, Giemsa染液为美国Sigma公司产品, RPMI 1640培养液为 GIBCO公司产品。

1.1.2 实验动物用于弓形虫传代保种的SPF级昆明小白鼠(6~8周, 雌性)和用于提取Mφ 的BALB/c小鼠(6~8周, 雌性)均购自安徽医科大学实验动物中心。动物伦理批准文号:AMU26-08061。

1.1.3 虫株 RH-GFP由中国农业大学动物医学院索勋教授惠赠。

1.2 主要仪器设备

荧光显微镜(CX31)为日本OLMPUS公司产品。流式细胞仪(FACSCalibur)为美国BD公司产品。CO₂细胞培养箱(SERIES 8000 DH)为Thermo Scientific Napco公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 Mφ 提取将BALB/c小鼠麻醉后脱颈处死, 75%酒精浸泡并消毒腹部皮肤, 剪开腹壁暴露腹膜, 腹腔注入RPMI1640培养液3 mL, 轻柔腹部静置 3 min, 夹提腹膜并用吸管吸取腹腔灌洗液。将腹腔液1 000 r/min离心 10 min, 细胞沉淀用预冷培养液洗涤 2 次。细胞沉淀再加入含抗生素的培养液重悬、计数并接种于培养板中, 置于 37 ℃, 5%CO₂培养箱。待Mφ 贴壁后取出培养板, 用培养液洗1~2次, 收获贴壁细胞。

1.3.2 Hy对Mφ 的毒力检测提取BALB/c小鼠腹腔Mφ 常规进行体外培养, 铺12 孔板, 1× 10⁶个细胞/孔, 加入Hy使其终浓度分别为100、200和400 μ g/mL, 同时设空白对照组。每组设3个复孔。培养板置于37 ℃, 5%CO₂培养箱中孵育, 分别于1、2 和3 h后收集细胞进行Giemsa染色。

1.3.3 RH-GFP速殖子制备建立小鼠体内急性感染RH-GFP模型, 分离纯化游离速殖子, 用荧光显微镜观察。

1.3.4 体外Mφ 弓形虫速殖子(RH-GFP)感染在细胞培养板内以虫体与细胞5: 1比例接种速殖子至小鼠腹腔Mφ , 30 min后洗去未侵入的速殖子继续培养, 12 h后取样在荧光显微镜下观察。

1.3.5 实验分组 Hy设100、200和400 μ g/mL 3个药物浓度。按照以下分组:感染RH-GFP的Mφ 组(A组对照)、不同浓度Hy组:感染RH-GFP的Mφ +100 μ g/mL(B组)、感染RH-GFP的Mφ +200 μ g/mL(C组)和感染RH-GFP的Mφ +400 μ g/mL(D组)。每组设3个复孔, 每孔定容1 mL。

1.3.6 流式细胞仪检测在培养1、2和3 h后, 每组各孔分别取样, 检测游离速殖子和感染细胞在不同时间、不同浓度条件下数量的变化。

1.3.7 透射电镜观察取400 μ g/mL Hy作用1、2和3 h后的虫体及生理盐水对照组, 2.5%戊二醛和1%四氯化锇依次固定, 按照透射电镜常规方法制备样品, JEM-1230透射电镜下观察并拍照。

1.4 统计学方法

数据统计采用SPSS 11.5统计软件处理, 各组数据均用( $\bar{x}$ ± s)表示, 检验各组方差齐同后进行方差分析(两两比较用q检验), 检验水平为α =0.05。

2 结果

2.1 Hy对Mφ 的毒力检测

经Giemsa染色在显微镜下观察, 不同浓度Hy作用3 h对Mφ 形态结构、细胞膜和细胞核与对照组比较无显著差别(图1)。

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	图1 Hy作用3 h后各组Mφ 吉姆萨染色(× 1 000) A: Mφ 对照组; B: 100 μ g/mL Hy组; C: 200 μ g/mL Hy组; D: 400 μ g/mL Hy组Fig.1 Groups of macrophages with Giemsa staining 3 hours after the treatment of Hy (× 1 000)

2.2 RH-GFP荧光显微镜观察结果

稳定传代过程中分离提纯的速殖子在存活状态下荧光激发状态正常, 荧光显微镜下发绿色荧光(图2)。

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	图2 RH-GFP荧光显微镜图片(× 400)Fig.2 RH-GFP under the fluorescent microscope (× 400)

2.3 Mφ 体外感染RH-GFP模型

显微镜下可见弓形虫在Mφ 内的增殖(图3)。

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	图3 RH-GFP感染Mφ (同一视野)在普通光源下(A)、在荧光光源下(B)(× 400)Fig.3 Macrophages infected with RH-GFP (the same view) under normal light (A), under fluorescent light (B) (× 400)

2.4 流式细胞仪检测

Hy作用后随着时间的延长以及药物浓度的增加, 速殖子感染的Mφ 比例逐渐下降; 游离与胞内速殖子比值升高, 各药物组在同一时间点内与对照组相比, 差异均有统计学意义(F=14.95、24.45、30.99, P< 0.05)。Hy作用1 h各浓度组之间差异无统计学意义(q值分别为0.45、0.45、0.0003, P> 0.05), Hy作用2 h各浓度组之间差异无统计学意义(q值分别2.48、0.39、2.09, P> 0.05), 在第3 h内各浓度组之间差异有统计学意义 (q=3.71、4.91, P< 0.05)。各实验组同一药物浓度下在第1 h、2 h和3 h之间差异有统计学意义(F=21.30、37.82、19.70, P< 0.05)(图4)。

Figure Option
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图4 各实验组在Hy作用1、2 和3 h后游离速殖子和感染细胞比例变化流式代表图(左)及统计图(右)
A: Mφ +T.gondii对照组; B: 100 μ g/mL Hy组; C: 200 μ g/mL Hy 组; D: 400 μ g/mL Hy 组流式图右上象限代表感染RH-GFP的Mφ ; 右下象限代表游离的RH-GFPFig.4 Change of the ratio of the free RH-GFP and infected macrophages in different concentrations groups after 1, 2 and 3 hours shown in the flow chart(left) and the statistical chart(right)

2.5 透射电镜观察结果

与对照组比较, Hy作用1 h后虫体肿胀, 包膜与基质出现空隙, 外形改变; 作用2 h后, 虫体内出现明显的空泡, 细胞核固缩; 作用3 h后, 虫体内空泡增多且较大, 电子密度明显降低, 局部包膜破裂, 内容物溢出。(图5)

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	图5 Hy作用后的速殖子超微结构变化(透射电镜, × 12 000) A: 生理盐水对照组; B: 400 μ g/mL Hy作用1 h; C: 400 μ g/mL Hy作用2 h; D: 400 μ g/mL Hy作用3 hFig.5 Ultrastructural alterations of T. gondii tachyzoites incubated with Hy (transmission electron microscopy, 12 000 × )

3 讨论

弓形虫病一直是人类和畜牧业生产重点防控的疾病, 治疗弓形虫病的常用药物以叶酸代谢的抑制剂居多, 如乙胺嘧啶联合磺胺嘧啶, 替代的药物有克林霉素、阿奇霉素或克拉霉素。上述化学药物毒副作用大, 且无法有效对抗弓形虫组织包囊^[10]。植物源性药物一直被用于治疗人与动物的许多疾病, 包括寄生虫病^[11]。来自植物的天然化合物为寻找新的有效安全的驱虫剂提供了一个独特的机会。近年来, 众多研究显示中草药治疗弓形虫病具有巨大发展前景, 如桦褐孔菌多糖能够减少弓形虫感染引起的睾丸生精细胞病理损伤; 甘草在与磺胺氯吡嗪钠(SPZ)结合应用时, RH感染小鼠的存活率达到50%; 氧化苦参碱和苦参碱可降低速殖子数量(45.2%和53.8%), 并使小鼠的存活率提高到67%^{[12, 13]}。

而Hy来自贯叶连翘植物, 具有独特的药理作用, 目前市场上可见商品化成品。近年研究发现, Hy不仅具有抗病毒、抗肿瘤及抗抑郁的效应, 还能激活单核吞噬细胞从而增强机体抗感染的免疫功能^{[14, 15]}。在寄生虫病防治中, 已有报告证实Hy能够杀伤蠕虫类的日本血吸虫和顶复门原虫类的艾美球虫。有研究显示Hy可通过调变亚精胺在寄生虫中的氧化还原平衡作用进而诱导利什曼原虫的死亡^[16]。王旗等^[17]发现Hy可以调节宿主体内细胞因子水平的变化, 通过抑制CD8⁺ T细胞介导的细胞毒作用改善急性弓形虫感染小鼠的细胞免疫功能, 提高小鼠抗感染的能力。

本研究前期实验已经证实Hy体外抗弓形虫速殖子效果显著^[9]。在动物实验中, Mφ 是弓形虫偏嗜的主要宿主细胞之一, 也是在感染早期宿主固有免疫发挥抗感染的最重要的免疫细胞, 因此探讨中草药提取物抑制弓形虫速殖子在Mφ 内以及游离虫体的增殖, 具有重要的潜在临床应用价值。本实验使用稳定表达绿色荧光蛋白的转基因弓形虫虫株, 利用流式细胞术进行检测, 相比以往染色剂染色后依靠肉眼观察计数更加客观可靠。研究结果显示, Hy能够以剂量和时间依赖性地抑制Mφ 内和游离的弓形虫速殖子的增殖, 并且实验浓度范围内的Hy对Mφ 无明显形态学影响。体外培养中, 弓形虫约在接种1 min即可侵入Mφ , 约3 h后可见弓形虫在细胞内分裂增殖, 4~6 h开始破坏细胞, 因此实验选取1、2和3 h 3个时间点进行观察。预试验显示500 μ g/mL组作用4 h抗虫效果即达到平台期, 故选择100、200、400 μ g/mL 3个浓度梯度。流式检测结果显示, 随着Hy作用时间的延长, 游离与胞内速殖子的比值不断升高, 同一时间段内不同浓度Hy对胞内速殖子均有抑制作用(P< 0.05), 3 h后各浓度组之间差异明显(P< 0.05), 而400 μ g/mL组在3 h后游离速殖子的比例有所下降。透射电镜结果显示, 400 μ g/mL组虫体在不同时间段形态结构变化明显, 在Hy作用3 h后速殖子出现虫体破裂, 内容物溢出, 虫体处于死亡状态, 而对照组超微结构清晰完整, 这些也证实了Hy在体外有较好的抗弓形虫的作用。

本实验结果初步揭示了Hy对Mφ 内和游离的弓形虫速殖子的增殖抑制作用, 为该药的深入研究提供了线索。Hy是通过对弓形虫的直接抑制, 或是通过诱导宿主细胞的抗感染免疫, 有待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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蔡茹, 佘新平, 王瑜, 等. 光诱导金丝桃素体外抗日本血吸虫雄虫作用的观察[J]. 中国寄生学与寄生虫病杂志, 2014, 32(3): 176-179.

Objective To investigate the in vitro effect of photoactivated hypericin on anti- Schistosoma japonicum adult male worms. Methods Kunming mice were infected with 60-80 Schistosoma japonicum single-sex cercariae. At 6 weeks post-infection, the mice were sacrificed and adult male worms of S. japonicum were collected. The worms were incubated in DMEM medium containing different concentrations of hypericin （0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, and 2.5 μmol/L） in the presence or absence of light. In photoactivated hypericin groups, after 6 h of dark incubation the worms were exposed to LED light irradiation（590 nm） for 30, 60, 90, and 120 min, respectively, and then cultured overnight in darkness（16 h）. In the next morning, the parasites were washed, resuspended in drug-free medium, and incubated in the dark for 48 h. These worms were observed with stereomicroscopy and scanning electron microscopy（SEM）. Results Photoactivated hypericin showed the ability to kill Schistosoma japonicum in vitro . The death rate was 20% in 0.1 μmol/L photoactivated hypericin group under 30 min irradiation, and 100% in 2 μmol/L under 90 min irradiation and 2.5 μmol/L under 60 min irradiation, respectively. In blank control group, DMSO control group, and hypericin groups without light irradiation, worms were alive. After 60 min irradiation, the worms in 1.0, 2.5, 5.0 μmol/L photoactivated hypericin groups showed spastic paralysis characterized by reduced body length, pronounced tight curl, body stiffness, and complete cessation of movement. Surface tegumental damages of adult worms in 2.0 μmol/L photoactivated hypericin group for 60 min irradiation were observed under SEM, such as vacuole formation, erosion and peeling of the tegument, collapse of the sensory papillae, and even the normal structure disappeared completely. Both death rate and morphological damage of the worms treated by photoactivated hypericin were positively correlated with hypericin dose and light irradiation time. Conclusion Photoactivated hypericin has anti- Schistosoma japonicum adult male worms effect in vitro.

目的观察光诱导后的金丝桃素对日本血吸虫雄虫的体外杀伤作用。方法 80只昆明小鼠经腹部皮肤感染由单只阳性钉螺逸出的日本血吸虫尾蚴60～80条，6周后剖检，收集雄虫置入含有3 ml DMEM培养液的平皿内（10条/皿）。每批次实验均分为：金丝桃素提取物或金丝桃素纯品（以下简称金丝桃素）不同浓度（0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μmol/L）光照组以及不同浓度非光照组，二甲基亚砜（DMSO）对照组和空白对照组。各实验均重复2～5次。将金丝桃素提取物或金丝桃素纯品及DMSO液分别加入含有血吸虫的培养皿中，恒温避光共孵育6 h，再分别照射30、60、90和120 min后，37 ℃避光培养过夜（16 h）。次晨，洗涤、更换无药物新鲜培养液，继续避光培养48 h，观察光诱导后的金丝桃素对血吸虫的杀伤作用。选取1.0、2.5和5.0 μmol/L 金丝桃素光照60 min组虫体在解剖镜下观察并摄像；2.0 μmol/L金丝桃素光照60 min组虫体进行扫描电镜观察。　　结果各浓度金丝桃素纯品光照组的虫体均有不同程度的死亡，0.1 μmol/L金丝桃素纯品光照30 min组，虫体死亡率为20%；2 μmol/L金丝桃素纯品光照90 min组和2.5 μmol/L金丝桃素纯品光照60 min组，虫体均100%死亡。相应的金丝桃素纯品各浓度无光照组、DMSO对照组和空白对照组，虫体均100%存活。解剖镜下观察，1.0、2.5和5.0 μmol/L金丝桃素纯品光照60 min组虫体均出现显著的痉挛性麻痹现象，表现为不同程度的缩短卷曲、体态僵硬和活动终止等改变；扫描电镜观察，2.0 μmol/L 金丝桃素纯品光照60 min组虫体皮层出现肿胀、空泡形成、破裂、糜烂、剥落和感觉乳突丢失等损害，甚至皮层正常结构完全消失。金丝桃素纯品各浓度光照组的虫体死亡率和形态结构的损伤改变与金丝桃素浓度和光照时间有关。结论金丝桃素经光诱导后，具有显著的体外抗日本血吸虫雄虫作用。

... 蔡茹等^[7]发现Hy被光诱导后具有显著的体外杀伤日本血吸虫的效应 ...

2012

0.0

张克勤, 蒋丽, 张俊杰, 等. 金丝桃素抗鸡球虫效果观察[J]. 湖北农业科学, 2012, 51(19): 4316-4320.

... 张克勤等^[8]报道Hy具有显著的抗艾美球虫(与弓形虫同属于顶复门原虫)的效果 ...

2016

0.0

杨小迪, 孙希萌, 王旗, 等. 金丝桃素体外抗弓形虫速殖子效果的观察[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2016, 34(3): 203-207.

Objective To investigate the killing effect of hypericin on tachyzoites of Toxoplasma gondii RH strain in vitro. Methods Normal saline （group A） and different concentrations of hypericin （5 μg/ml, group B; 50 μg/ml, group C; 500 μg/ml, group D） were added to T. gondii tachyzoites in 24-well plate（1×106/well）. The tachyzoites were harvested after 2, 4 and 6 h, and underwent the following treatment: trypan blue staining to calculate the dyeing rate, Giemsa staining to observe the morphological and structural alterations of tachyzoites, and transmission electron microscopy to observe the ultrastructure of tachyzoites. In addition, flow cytometry was performed to calculate the survival rate of YFP-carrying Toxoplasma with the same treatment. Results The trypan blue dyeing rate at 2 h after treatment in groups B, C and D was（11.0±3.6）%, （25.0±6.3）% and（40.0±2.7）% respectively, with a significant difference of group D versus B and C （P<0.01）, and groups C and D versus group A ［（6.0±3.0）%）］. The dyeing rate at 4 h and 6 h in group D was（97.0±2.0）% and （98.0±1.7）%, respectively, both significantly higher than that of groups C ［（30.0±7.2）%, （42.7±5.5）%］, B ［（20.0±3.0）%, （34.0±6.6）%］ and A ［（10.0±1.0）%, （19.3±4.9）%］（P<0.01）. Giemsa staining showed gradual end swelling and necrosis of tachyzoites with increased treatment duration and dosage. Transmission electron microscopy showed swelling of worm body, gap between cell membrane and matrix, increase and enlargement of vacuoles inside worm body, disruption of cell membrane, and dissolving of inner structures, with increased treatment duration. Flow cytometry showed significant difference of tachyzoite survival rate at 2, 4 and 6 h after hypericin treatment with that of the control group（P<0.01）. The survival rate of group C at 2 h after hypericin treatment was（7.9±1.9）%, significantly lower than that of groups B ［（38.1±5.5）%］ and A ［（81.8±6.0）%］（P<0.01）. No tachyzoite was found to survive in group D at 2 h and in group C at 4 h. The survival rate of group B at 4 and 6 h after hypericin treatment was（14.3±7.9）% and （1.4±1.8）%, respectively, both significantly lower than that of group A［（73.8±11.3）% and（64.1±14.4）%, respectively］（P<0.01）. Conclusion Hypericin has a remarkable killing effect on T. gondii tachyzoites, and the efficacy positively correlates with the dose and treatment duration.

目的观察金丝桃素对体外培养的刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株速殖子的杀伤作用，探讨金丝桃素抗弓形虫的效果。方法将生理盐水（A组）和终浓度为5 μg/ml（B组）、50 μg/ml（C组）、500 μg/ml（D组）的金丝桃素分别加入含弓形虫速殖子1×106个/孔的24孔培养板中，于2、4、6 h后收集虫体，台盼蓝染色检测速殖子着色率，吉氏染色观察速殖子形态和结构变化，透射电镜观察速殖子超微结构的变化，流式细胞仪检测相同处理的携带黄色荧光蛋白的弓形虫的存活情况。结果弓形虫速殖子经不同浓度金丝桃素作用2 h后，B组、C组和D组虫体的台盼蓝着色率分别为（11.0±3.6）%、（25.0±6.3）%和（40.0±2.7）%，D组着色率高于C组和B组（P 0.05）。作用4 h后，D组着色率为（97.0±2.0）%，高于C组（30.0±7.2）%、B组（20. 0±3.0）%和A组（10.0±1.0）%（P<0.01）；作用6 h后，D组着色率为（98.0±1.7）%，亦高于C组（42.7±5.5）%、B组（34.0±6.6）%和A组（19.3±4.9）%，两两比较，各组间差异均有统计学意义（P<0.01）。吉氏染色观察发现，随时间的延长和剂量的增高，虫体两端逐渐变圆、肿胀、坏死。透射电镜观察结果显示，随金丝桃素作用时间延长，虫体逐渐肿胀，胞膜与基质间出现明显空隙，虫体内空泡增多、变大，胞膜破裂，内部结构溶解。流式细胞仪检测结果表明，弓形虫速殖子存活率在金丝桃素作用后的各时间段内与对照组间差异有统计学意义（P<0.01）；金丝桃素作用2 h后，D组无弓形虫存活，C组弓形虫存活率为（7.9±1.9）%，低于B组（38.1±5.5）%和A组（81.8±6.0）%（P<0.01）；作用4 h后，C组无弓形虫存活；B组在作用4 h和6 h后，弓形虫存活率分别为（14.3±7.9）%和（1.4±1.8）%，均低于A组的（73.8±11.3）%和（64.1±14.4）%（P<0.01）。结论金丝桃素具有较强的体外抗弓形虫速殖子效果，且随剂量增高和作用时间延长抗虫效果更明显。

... 本实验室的前期研究证实Hy具有显著的体外抗弓形虫速殖子的效果^[9] ...

... 本研究前期实验已经证实Hy体外抗弓形虫速殖子效果显著^[9] ...

2015

0.0

... 上述化学药物毒副作用大,且无法有效对抗弓形虫组织包囊^[10] ...

2016

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... 植物源性药物一直被用于治疗人与动物的许多疾病,包括寄生虫病^[11] ...

2016

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... 8%),并使小鼠的存活率提高到67%^[12,13] ...

2017

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... 8%),并使小鼠的存活率提高到67%^[12,13] ...

2013

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... 近年研究发现,Hy不仅具有抗病毒、抗肿瘤及抗抑郁的效应,还能激活单核吞噬细胞从而增强机体抗感染的免疫功能^[14,15] ...

2015

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... 近年研究发现,Hy不仅具有抗病毒、抗肿瘤及抗抑郁的效应,还能激活单核吞噬细胞从而增强机体抗感染的免疫功能^[14,15] ...

2017

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... 有研究显示Hy可通过调变亚精胺在寄生虫中的氧化还原平衡作用进而诱导利什曼原虫的死亡^[16] ...

2014

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王旗, 杨小迪, 薛洪宝, 等. 金丝桃素对急性弓形虫感染小鼠脾脏CD4+和CD8+ T淋巴细胞亚群的影响[J]. 中国病原生物学杂志, 2014, 9(12): 1091-1093.

摘　要：目的观察金丝桃素对急性弓形虫感染小鼠脾脏CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞亚群的影响。方法将40只昆明种雌性小鼠随机分为4组：空白对照组（A组）、弓形虫感染组（B组）、金丝桃素对照组（C组）和金丝桃素治疗组（D组）,每组各10只小鼠。除A组和C组外,B、D两组每组小鼠腹腔接种RH株弓形虫速殖子1×10^3个,建立急性弓形虫感染动物模型。C、D组于感染12h后腹腔注射给药,A、B组同时进行生理盐水腹腔注射,连续7d后,用流式细胞仪检测小鼠脾脏中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞水平。结果C组和D组CD4^＋T细胞百分率分别为20.57±1.76和23.33±1.82,CD4^＋与CD8^＋T细胞比值分别为2.04±0.40和2.29±0.65,A、B组CD4^＋T百分率及CD4^＋/CD8^＋值分别为12.13±2.35、15.96±2.71和1.35±0.30、0.77±0.92,差异有统计学意义（P〈0.01）;A、B、C、D组CD8^＋T细胞百分率分别为8.95±0.40、20.74±1.50、10.42±2.43和10.86±3.18,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论金丝桃素可显著改善急性弓形虫感染小鼠的细胞免疫功能,增强小鼠抗弓形虫感染的能力。

... 王旗等^[17]发现Hy可以调节宿主体内细胞因子水平的变化,通过抑制CD8⁺ T细胞介导的细胞毒作用改善急性弓形虫感染小鼠的细胞免疫功能,提高小鼠抗感染的能力 ...