实时荧光定量PCR在病毒检测中的应用
高鑫, 朱武洋, 卢学新
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所狂犬病室,北京 102206
通讯作者:卢学新,Email:15201586121@163.com
摘要

实时荧光定量PCR是通过荧光信号监测目的基因扩增数量的定量PCR技术,具有灵敏度高,检测速度快等优点。实时荧光定量PCR已被应用于乙肝病毒、登革热病毒、流感病毒、水疱口炎病毒等病毒的快速检测,在病毒快速分型、相似病毒的鉴别检测、耐药病毒突变体检测等临床和公共卫生领域得到广泛应用。狂犬病是危害严重的人兽共患病,病死率几乎为100%。实时荧光定量PCR技术已被应用于狂犬病病毒和狂犬病相关病毒的核酸检测,具有与金标准DFA相当的灵敏度和特异度,同时克服了金标准DFA的某些局限性,如检测速度更快,无需提取脑组织,对唾液、脑脊液等低病毒载量样本具有较好的检出效果,具有成为人间狂犬病诊断技术的潜力。灵敏度是传统RT-PCR的200倍以上,交叉污染的风险更低。实时荧光定量PCR也应用于欧洲蝙蝠病毒等狂犬病相关病毒的检测,可建立多重实时荧光定量PCR在单一检测体系对多种病毒进行快速鉴别,对于预防病毒性传染病具有重要的公共卫生意义。本文详细介绍了该技术的相关原理和方法,以及在病毒检测方面的国内外研究进展。

关键词: 实时荧光定量PCR; 核酸; 狂犬病病毒; 狂犬病病毒属
中图分类号:R511 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)07-0660-08
Real-time polymerase chain reaction in detection of viral pathogen
GAO Xin, ZHU Wu-yang, LU Xue-xin
Rabies Department, National Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: Lu Xue-xin, Email: 15201586121@163.com
Abstract

Real-time polymerase chain reaction, a sensitive and fast technology, is a quantitative PCR technology which can monitor the number of gene amplification products by capturing the fluorescence signal. This paper introduces the related principle of real-time PCR and research progress of viral pathogens detection by applying real-time PCR. This technology has been widely applied in quick viral pathogen detection such as HBV, dengue virus, influenza virus and VSV. Real-time PCR is also applied in quick genotyping of viruses, differentiating of similar viruses, detecting of drug-resistant virus mutants and other clinical and public health fields. Rabies is an incurable zoonosis and its mortality rate is almost 100%. This technology is applied in detection of rabies and lyssavirus which overcome the limitation of golden standard-DFA. It has equal sensitivity and specificity with DFA, and it is faster than DFA with no need for extracting brain tissues. It has good detection result of non-neural samples such as saliva, cerebrospinal fluid. Real-time PCR has potential to diagnose rabies. The sensitivity of real-time PCR in rabies detection is 200 times than conventional RT-PCR. Real-time PCR reduces the risk of cross contamination. It also has been applied in detection of rabies-related virus. Multiple real-time PCR can be applied in quick genotyping of many kinds of rabies-related virus in single reaction tube. Applying real-time PCR in detection of rabies and lyssavirus has important significance in public health.

Keyword: real-time polymerase chain reaction; nucleic acids; rabies; lyssavirus

艾滋病、非典型性肺炎、人禽流感、病毒性肝炎等病毒性传染性疾病(Viral Infectious Disease)具有传染性强, 容易引起大规模暴发流行等特点, 严重威胁公众健康。当前病毒主要快速检测方法包括基于抗原抗体反应的免疫学检测方法和基于病毒核酸的分子生物学检测方法。实时荧光定量PCR是在传统PCR技术基础上发展起来的新技术, 具有实时监测核酸拷贝数量、灵敏度高、检测速度快、不容易污染等优点, 被广泛应用于病毒性病原体的快速检测。本文就近年来实时荧光定量PCR在各种病毒的快速检测, 尤其是在狂犬病病毒及狂犬病病毒属检测中的应用和发展前景作详细介绍。

1 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction, qPCR)是能够定量监测目的基因扩增数量的PCR新技术。原理是在PCR体系中加入荧光染料或荧光分子标记的寡核苷酸链, 与PCR扩增产物结合时荧光分子在紫外线的激发下发出荧光, 通过荧光信号探测器直接检测反应体系中荧光信号的变化, 来监测目的基因的拷贝数量, 并据此推断目的基因的初始量。Navarro等[1]将荧光标记的方法分为两类:1)双链DNA结合染料, 如SYBR Green I和Eva Green等; 2)应用荧光标记的寡核苷酸链, 包括3种类型:①荧光探针(Probe), 包括:水解探针(Hydrolysis probes)和杂交探针(Hybridization probe); ②荧光引物探针(Primer-Probe), 如:Scorpion primer-probes、AmplifluorTM primer-probes等; ③核酸类似物(Nucleic acid analogues), 如:LNA(Locked Nucleic Acids, 锁定核酸)、PNAs(Peptide nucleic acids)、ZNA(Zip nucleic acids)等。主要定量方法包括:1)绝对定量, 构建基因序列标准品并进行定量, 将标准品倍比稀释并检测得到每个稀释度的Ct值, Ct值是荧光达到荧光阈值的循环数, 以核酸数量为横坐标, 以log(Ct)为纵坐标绘制标准曲线, 通过待检样品的Ct值在标准曲线上的位置得到样本所包含的核酸量; 2)相对定量, 根据数学公式推导得到目的基因=2-Δ Δ Ct, Δ Δ Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组, 可直接得到目的基因相对管家基因的量, 不必制作标准曲线, 相对简便省时。

实时荧光定量PCR技术具有以下优势:实时监测目的基因扩增数量, 定量估计样本中目的基因初始量, 并通过荧光信号展示清晰的PCR过程; 操作简单, 检测时间短; 重复性和特异性良好、灵敏度很高; 在封闭的体系中完成荧光信号的实时监测, 降低了被污染的可能性。该技术已得到广泛应用, 如对mRNA表达的研究、各种基因定量分析、点突变分析和等位基因分析、单核苷酸多态性分析以及对各种传染病进行定性、定量分析[2]等。

2 主要实时荧光定量PCR检测方法
2.1 DNA结合染料法 SYBR Green

Ⅰ 等染料可与双链DNA相结合, 在紫外线的激发下发出荧光, 游离时在紫外线的激发下发出的荧光信号极低。在PCR体系中加入DNA结合染料, 随着PCR反应的进行, 荧光染料与逐渐增多的双链DNA结合, 荧光强度逐渐增强, 因此能够通过荧光信号的强度实时监测反应体系中目的基因扩增数量[1, 2, 3]。DNA结合染料可同时与特异性和非特异性扩增产物(主要为引物二聚体)相结合, 影响定量结果的可靠性。为消除此类影响, 可进行熔融曲线分析(Melting curve analysis)区分特异性产物和非特异性产物。SYBR Green I是当前使用最普遍的荧光染料, 与双链DNA具有高度的亲和力[4]。EvaGreen是第三代双链DNA结合染料, 相比SYBR Green Ⅰ 染料更加稳定和灵敏, 对富含AT和富含CG的DNA序列均具有相近的亲和力; 在PCR体系中允许加入更高浓度的EvaGreen染料, 产生的荧光信号更加稳定, 在熔融曲线中产生的峰更尖, 适用于高分辨率熔融曲线分析(High resolution melting curve analysis)[5]

2.2 TaqMan探针法

TaqMan探针是当前使用最广泛的水解荧光探针, 其5'端标记了荧光发射分子(Fluorescence Reporter Molecule), 3'端标记了荧光淬灭分子(Fluorescence Quencher Molecule), 当TaqMan水解探针处于游离状态时, 两端的荧光分子相互靠近, 在紫外线的激发下荧光被吸收, 无法被荧光探测器检测到。随着PCR反应的进行, TaqMan探针与目的基因发生特异性结合, 5'端的荧光发射分子被DNA合成酶水解, 在空间上脱离了荧光受体分子的影响, 在紫外线的激发下产生荧光, 并被荧光信号探测器所捕获[6], 通过绝对定量或相对定量的方式对样本核酸量和扩增片段数量进行定量估计。可通过对不同基因型的病毒设计特异性探针, 并在不同的探针上标记不同的荧光分子, 建立多重荧光PCR来对病毒进行分型检测[7]

近年来出现在TaqMan探针的3'或5'端连接MGB配体来提高探针灵敏度和特异度的方法。MGB(Minor groove binding)配体是一种三肽分子, 能选择性地与富含AT两种碱基的双链DNA螺旋小沟发生非共价结合。MGB探针的一端以非荧光淬灭分子(Non-fluorescent Quencher Molecule)代替荧光淬灭分子, 减少了背景荧光信号强度。MGB探针与靶基因的结合更加稳定, MGB能提高探针的Tm(Melting Temperature, 熔融温度)值, 因此能够将探针设计地更短, 有利于针对病毒的多种基因型的相同位点而设计通用探针[1]; 同时使探针能够分辨一个碱基的差别, 当存在一个碱基不同时就无法在一定波长紫外线的激发下发出荧光, 因此能够进行基因点突变的检测; MGB探针发生错配的概率更少, 减少了非特异性扩增产物的出现。MGB探针已被应用于多重病原体检测、病毒载量分析、基因表达、等位基因分型以及SNP检测等领域中。

2.3 分子信标法

分子信标(Molecule Beacon)是呈现发夹结构的颈环双标记寡核苷酸探针, 5'端标记有荧光发射分子, 3'端标记有荧光淬灭分子。分子信标呈现发夹结构时, 荧光发射分子与淬灭分子相互靠近而不能在紫外线的激发作用下发出荧光[6]。随着PCR反应的进行, 热循环温度达到分子信标的解链温度, 构象发生改变, 与靶基因相结合而完全伸展成线性分子, 荧光报告分子和荧光淬灭分子在空间上足够的分离, 在紫外线的激发下发出荧光。其定量原理与TaqMan探针相同。分子信标能够区分只有一个核苷酸差异的不同DNA序列, 适用于点突变的检测。

2.4 核酸类似物法

LNA(Locked Nucleic Acids, 锁定核酸)是双RNA聚合的类似物, 其2'位的氧原子与核糖4'碳原子形成亚甲基的桥键[8]。在寡核苷酸链(如TaqMan探针、分子信标等)中掺入LNA分子, 可以增加寡核苷酸链的Tm值, 提高其稳定性, 与靶基因结合具有很高的特异性。LNA-分子信标和LNA-探针已被应用于结核杆菌的SNP检测、幽门螺旋杆菌的检测、转基因产品的检测、等位基因的特异性突变检测以及HBV病毒的的定量检测等领域中。PNA(Peptide nucleic acids)是电中性DNA类似物, 其磷酸戊糖骨架被N-2氨乙基甘氨酸代替, 标记噻唑橙等荧光分子与双链DNA和RNA结合, 用于实时荧光定量PCR。ZNA(Zip nucleic acids)是携带精胺衍生物的人工合成寡核苷酸链, 能够放置在探针的3'端、5'端或中间, 通过减少核酸之间的静电斥力来增加与靶基因结合的稳定性[1]

3 实时荧光定量PCR在病毒检测中的应用

实时荧光定量PCR在临床快速诊断、治疗效果的监测和评估、发现传染源、疾病流行暴发的处置等临床和公共卫生领域广泛应用。实时荧光定量PCR已被应用于乙肝病毒、登革热病毒、流感病毒、水疱口炎病毒等病毒性病原体的核酸检测, 在病毒性传染病的快速诊断、病毒分型、不同病毒的鉴别检测、耐药突变体检测、新发传染病病原体快速检测等方面发挥了重要作用。

3.1 实时荧光定量PCR在乙肝诊断、乙肝病毒和耐药突变体检测等的应用

乙肝病毒感染是造成急慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因之一, 在全球大约有20亿人感染乙肝病毒, 超过350万人是乙肝病毒的长期携带者[9], 乙肝病毒给全球带来了沉重的疾病负担。实时荧光定量PCR广泛应用于乙肝病毒检测、乙肝诊断、治疗过程监测等, 杂交探针法和TaqMan探针法是主要方法[10]

实时荧光定量PCR在乙肝病毒检测中的应用主要有以下几个方面:1)对临床患者进行确诊, 并对所感染乙肝病毒的型别进行区分。乙肝病毒存在多种基因型, 各基因型间的遗传序列差异较大, Welzel等[11]根据各基因型病毒全基因序列比对设计引物和探针, 能够同时测定乙肝病毒的A-G基因型。Wang等[12]应用LNA探针法检测HBV, 相比于普通TaqMan探针法具有更高的灵敏度, 更广的线性检测范围和更高效的扩增效率, 所需探针浓度更低。2)在耐药突变体检测中的应用。患者在长期使用拉米夫定抗乙肝病毒治疗过程中, 乙肝病毒P基因区的YMDD(酪氨酸-Y, 蛋氨酸-M, 天门冬氨酸-D, )基因序列容易发生变异而对拉米夫定耐药, 形成YVDD(缬氨酸-V)、YSDD(丝氨酸-S)、YIDD(异亮氨酸-I)耐药突变体。Cane[13]等最早在1999年针对P基因区容易发生耐药突变的密码子550序列周围设计4种杂交探针, 包含了针对野生型(密码子550为ATG)的探针和针对YMDD突变型(密码子550为GTG或ATT)的探针, 能够对耐药突变体进行快速检测。Geng[14]等使用双TaqMan-MGB探针对拉米夫定耐药乙肝病毒进行检测, TaqMan-MGB探针能检出至少一个碱基的差别, 灵敏度和特异度很高。Yang[15]比较了实时荧光定量PCR和PCR产物测序、焦磷酸测序3种技术在YMDD突变体检测中的应用, 结果显示实时荧光定量PCR灵敏度更高、检测时间更短。Shih[16]等通过全基因序列比对, 在高度保守区域设计引物和杂交探针, 通过熔融曲线分析, 根据不同突变体所产生的特异性Tm值的熔融曲线, 来对YMDD、YIDD、YVDD进行区分; 同时还能以标准曲线对病毒载量进行定量, 用于监测抗病毒治疗效果和监测耐药突变体的发生, 对于乙肝的抗病毒治疗有重要的临床意义。Ntziora[17]等采用了分子信标技术检测耐药突变体, 传统的检测方法在突变体载量小于总病毒载量的25%时无法发挥作用, 而分子信标技术在低病毒载量乙型肝炎病毒耐药突变体检测中发挥了很好的效果。第三是对某些核酸标志物进行检测。共价闭环DNA(Covalently Closed Circular DNA, cccDNA)是乙肝病毒复制的起始模板, 在血液中检测到乙肝病毒DNA的出现表示乙肝病毒在体内正在进行活跃复制, 是慢性乙肝的相关重要生物标志物, 但其在血浆中的来源尚不完全清楚。已有研究[18]应用实时荧光定量PCR对慢性乙肝患者的血浆样本cccDNA进行检测, 其检测限为15个拷贝, 灵敏度很高, 大部分的慢性乙肝患者血浆样本能被检出cccDNA的存在, 用于慢性乙肝诊断。

3.2 实时荧光定量PCR在登革热病毒检测中的应用

登革热病毒为蚊媒传染性病毒, 属于黄热病毒科, 分为1-4型血清型[19], 当前主要检测技术包括RT-PCR检测病毒核酸和使用ELISA检测中和抗体, PCR技术是当前唯一能够判定病毒血清型的方法[20]。Taqman法[21]SYBR Green I法[19]是最早应用于急性感染血清样本中登革热病毒的实时荧光定量PCR方法, 设计针对4种血清型的引物, 特异性检测登革热病毒的4种血清型。有研究建立多重检测体系, 使用4种标记不同荧光分子的TaqMan特异性探针在单一体系中完成检测, 达到对登革热病毒4种血清型鉴别诊断的目的[22]

3.3 实时荧光定量PCR在流感病毒检测中的应用

实时荧光定量PCR已被应用于流感病毒检测。甲型流感病毒曾在世界范围内造成多次大流行, 2009年在全球发生了甲型H1N1流感大流行, 之后H1N1病毒的检测能力得到日益提高。Ellis[23]做了对H1N1检测的4种实时荧光定量PCR方法的对比评估。Song HO等[24]建立Polymeric LabChip实时荧光定量PCR, 使用了针对H1N1病毒H基因的新型特异性引物, 具有成本低、灵敏度高、特异性高、检测速度快、检测设备重量轻等特点。

甲型流感病毒分为包括H1N1在内的很多高致病性亚型, 如:H3N2、H5N1、H7N9, 2004年Stone等[25]使用特异性杂交探针的双重实时荧光定量PCR进行H1N1和H3N2两种甲型流感病毒亚型的分型检测。Wang等[26]开发了多重实时定量PCR技术, 同时检测4种荧光信号, 来对甲型流感病毒的4种亚型(H1、H3、H7、H9)进行鉴别检测, 检测方法采用SYBR Green或者TaqMan技术, 在针对4种亚型的H基因的高度保守区域设计特异性引物和探针, 在每种探针两端分别标记不同的荧光集团和荧光淬灭集团, 达到分型鉴别检测的目的。Zhang等[27]建立了MGB多重实时荧光定量PCR方法对H5亚型禽流感进行检测。

流感病毒分为甲、乙、丙三型, Wu等[28]也应用多重实时荧光定量PCR对甲型、乙型流感病毒进行鉴别诊断。同时有研究应用多重实时荧光定量PCR鉴别检测很多导致临床症状类似的病原体, 如流感病毒和呼吸道合胞病毒的多重检测[29, 30], 用于引起呼吸道疾病暴发流行的病原体快速鉴别, 对于呼吸道传染性疾病防控具有重要意义。

3.4 实时荧光定量 PCR在狂犬病病毒和狂犬病病毒属检测中的应用

狂犬病病毒(Rabies Virus, RABV)是狂犬病的主要病原体, 属于狂犬病病毒属、弹状病毒科, 核酸为单股负链RNA, 全长约为12 kb, N、L基因为高度保守序列, 其他部分仍然具有高度的遗传多样性; 狂犬病病毒是狂犬病病毒属中地理分布范围、宿主分布范围最广的病毒, 几乎能感染包括人在内的所有哺乳动物。狂犬病是一种急性病毒性脑炎, 病死率几乎为100%, 与其他某些病毒引起的急性脑炎症状很难区分, 快速可靠的临床诊断非常重要[31]。狂犬病病毒属(Lyssavirus)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae), ICTV(国际病毒分类委员会, International Committee of Taxonomy Virus)明确了狂犬病病毒属的3个谱系:谱系Ⅰ 包括RABV, Aravan virus[ARAV]、Khujand virus[KHUV]、Bokeloh bat lyssavirus[BBLV]、Duvenhage virus[DUVV]、European bat lyssavirus 1[EBLV-1]、European bat lyssavirus 2[EBLV-2], Australian bat lyssavirus[ABLV]和Irkut virus[IRKV]; 谱系Ⅱ 包括Mokola virus[MOKV], Shimoni bat virus[SHIBV]和 Lagos bat virus[LBV]; 谱系Ⅲ 包括Ikoma lyssavirus[IKOV]、West Caucasian bat virus[WCBV]和Lleida bat virus[LLBV]; 另外还有尚未明确分类的在西班牙蝙蝠中分离的LLEBV(Lleida bat lyssavirus)。当前又发现了新的病毒— — Gannoruwa bat lyssavirus。欧洲蝙蝠病毒等病毒的感染均有可能造成狂犬病死亡病例, 因此也被称为狂犬病相关病毒(Rabies-related Viruses), 狂犬病病毒属的检测对于狂犬病预防控制同样重要。

3.4.1 实时荧光定量PCR在狂犬病病毒检测中的应用 当前狂犬病诊断的金标准是直接免疫荧光法(Direct Fluorescent Antibody Test, DFA), 灵敏度和特异度很高, 但是存在很多局限性, 如适用于检测脑组织样本, 对腐败样本和唾液等非神经样本检出效果不好, 检测时间长, 需要荧光显微镜, 不能用于现场快速检测等。已有研究应用传统RT-PCR检测狂犬病病毒, 包括巢式、半巢式RT-PCR, 相比于金标准具有更高的灵敏度和特异度, 对样本类型限制较少其局限性有对于大量样本工作负担较重, 同时存在交叉污染的风险。实时荧光定量RT-PCR克服以上局限性, 能够对样本病毒载量进行定量, 检测时间更短, 减少污染的风险, 结果更可靠。

Nagaraj等[32]最早使用SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR检测了21份阳性狂犬病患者唾液样本, 设计了位点为64-82和201-183的一对引物, 荧光曲线图显示大多数阳性样本Ct值在26-19个循环之间, 少数样本的Ct值超过了35个循环为非特异性荧光(引物二聚体), 判断荧光信号是否来源于特异性产物需进行熔融曲线分析(Melting curve analysis), 对扩增产物进行重新升温并实时监测荧光信号, 如果荧光信号来源于特异性产物则会出现一个很高的尖峰, 结果为阳性样本在78 ℃出现尖峰, 表明有特异性产物; 某些样本出现小的峰值表示为非特异性产物如引物二聚体。与传统巢式RT-PCR对相同样本检测结果相比较, 显示实时荧光定量PCR具有更高的灵敏度(75%), 并能在更短的时间内完成对狂犬病患者唾液样本检测。SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR也被用于对感染动物的死前检测, Saengseesom等[33]研究结果表明大部分唾液样本能够检出狂犬病病毒, 脑脊髓液相比于唾液较难检出。

狂犬病病毒核酸检测主要应用TaqMan法, 探针容易和模板序列发生错配, Hughes等[7]发现错配发生数量会严重影响PCR扩增。Supaporn等[34]开始使用TaqMan技术应用于动物的口腔粘膜拭子、毛囊组织, 结果显示口腔粘膜拭子检测灵敏度大于80%, 毛囊组织的检测灵敏度为60%。Mani等[35]应用TaqMan技术对唾液、皮肤组织、脑脊髓液和血清进行被感染动物的死前检测, 检出率很高。

Martin等[36]以N基因和L基因为靶基因分别设计引物和探针, 构建了两套TaqMan实时荧光定量PCR体系检测RABV, 采用绝对定量的方式, 通过构建重组质粒合成标准RNA序列, 对标准RNA序列10倍倍比稀释测定Ct值构建标准曲线。两种检测体系对非洲本地RABV分离株均能检出, 与MOKV、LBV等狂犬病病毒属的其他病毒无交叉反应, 特异性均为100%, 相比于传统RT-PCR减少工作负担和检测时间; 基于L基因的PCR反应体系具有更优秀的表现, 检测限是0.00 067 TCID50/mL, 为传统半巢式RT-PCR的万分之一, 因此可用于检测病毒载量较少的动物唾液等样本, 对尚存活患者临床样本(唾液、皮肤组织、脑脊液)检测中检测结果与传统方法检测结果完全一致, 并且相比于基于N基因的PCR反应体系具有更高的灵敏度, 可作为人间狂犬病的诊断技术。

3.4.2 实时荧光定量PCR在狂犬病病毒属检测中的应用 狂犬病病毒属具有高度遗传多样性, 开发单一、方便使用的诊断技术很困难。金标准DFA以及分子生物学方法, 如RT-PCR和实时荧光定量PCR, 目前都不能完全对狂犬病病毒属的所有病毒进行快速检测。

Elizabeth[37]最早使用TaqMan实时荧光定量PCR检测了狂犬病病毒属的6种基因型, 以JW12为逆转录引物, 以JW6(DPL)/JW6(M)/JW6(E) 混合引物为PCR扩增引物; N基因是进行病毒分型并且是最保守的序列, 因此以N基因为靶基因设计均标记了FAM荧光报告分子和TRAMA荧光淬灭分子的8种特异性探针(TQM1(a\b\c)、TQM2~6), 探针的特异性很高, 某一种病毒的特异性探针在其他基因型检测中不会产生荧光信号, 能够在单一反应体系中对狂犬病病毒属的6种基因型进行检测。Coertse[38]等开发了使用单一探针(620lyssa)的TaqMan实时荧光定量PCR体系对狂犬病病毒属基因1-4型(RABV、LBV、MOKV、DUVV)进行检测, 以CVS为标准RNA作为阳性对照, 以相比β -actin扩增效率更加稳定可靠的18s rRNA为内参基因作为内对照, 灵敏度高于巢式RT-PCR 1 000倍。Ashutosh[39]设计了新的荧光定量PCR— — LN34法, 检测所有狂犬病病毒和另外的13种具有代表性的狂犬病相关病毒, 以N基因的高保守非编码序列和部分编码序列为靶基因设计引物和TaqMan探针, 并将探针链接LNA和MGB分子, 能够提高探针的熔解温度(Melting Temperature, Tm值), 减少非特异性产物的扩增; 两种探针具有相近的灵敏度和特异度, MGB探针能够识别探针靶基因的单个碱基的变化, 而LNA探针能够允许出现单个碱基的错配, 因此LNA-探针更适合于更广范围的狂犬病相关病毒的检测。

多重实时荧光定量PCR已经被应用于狂犬病病毒属中不同病毒的鉴别检测。Wakeley[40]等首次开发了TaqMan多重实时荧光定量PCR对狂犬病病毒、欧洲蝙蝠病毒-1/2进行分型检测, 通过识别3种基因型的保守序列, 设计了通用型引物N165-146, 并设计3种被标记了不同荧光报告/淬灭分子(FAM/TAMRA、HEX/Blackhole Quencher 1、Cy5/Blackhole Quencher 2)的特异性TaqMan探针(LysGT1、LysGT5、LysGT6), 分别对应3种病毒, 不同的荧光分子在波长不同的紫外线照射下产生荧光, 达到鉴别检测的目的, 同时设立了β -actin内参基因以排除样品完整性、核酸提取过程所带来的系统误差。Deubelbeiss[41]等在Wakeley所设计的2种探针的基础上新加了7种探针, 在两套探针体系下能对狂犬病病毒属的9种基因型进行分型检测, 并以Sandai Virus为内参基因。

Hayman[42]等N165-146引物基础上建立了只使用两种引物的SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR, 能检测当时已发现的11种狂犬病相关病毒, 其灵敏度是传统半巢式RT-PCR的200倍。SYBR GreenⅠ 检测法存在出现假阳性的风险, 而TaqMan法的灵敏度相对较低, 而且要设计多种特异性探针, 使用两种技术相结合能够有效提高病毒检测范围和灵敏度[43]

3.5 实时荧光定量PCR在其他病毒检测中的应用

实时荧光定量PCR在寨卡、水疱口炎病毒等的检测中也被广泛应用。已有研究建立了水疱口炎病毒的实时荧光定量PCR检测法, 如花群义[44]等建立的TaqMan法对印第安型和新泽西型进行检测; Tolardo等[45]建立的SYBR Green检测法, 能够检测水疱口炎病毒属的Piry、Carajas、Alagoas、Indiana 4种病毒种, 并对黄病毒、甲病毒等不会发生交叉污染, 其中Priy、Alagoas、Indiana均对人致病。Kate[46]等建立了MGB实时荧光定量PCR检测和分型Indiana病毒1-3型和New Jersey病毒, 以L基因7 230-7 465位点为靶基因设计通用引物和特异性MGB探针, MGB能够提高探针的退火温度和特异性, 因此能够在单一体系中进行多重实时荧光定量PCR检测, 同时以159个自然感染的牛上皮细胞样本进行实际检测, 检测结果与补体结合实验相一致, 同时还能够进行分型, 具有一定的检测优势。

已有少数研究建立了某些新发病毒性病原体如寨卡病毒的实时荧光定量检测方法[47, 48, 49, 50], 但是大部分研究并没有覆盖寨卡病毒的大部分株系, 同时寨卡病毒与黄热病毒、登革热病毒、脑炎病毒等具有同源性, 引物设计不当会降低检测方法的特异性。

4 实时荧光定量PCR在病毒检测中的意义及展望

实时荧光定量PCR是一种成熟的核酸快速检测技术, 具有良好的应用前景, 目前已经被广泛应用于传染性疾病病原体的快速检测, 为传染性疾病的诊断提供实验室诊断依据。实时荧光定量PCR已经被应用于病毒的定性检测, 病毒各基因型和基因亚型的分型检测, 类似病毒之间的鉴别检测, 用于提供传染性疾病的临床诊断证据, 了解病毒的流行状况, 监测病毒的流行型别, 发现病毒传染源, 对于制定有针对性病毒性传染性疾病的防控策略和措施具有重要意义。实时荧光定量PCR技术能够检测感染患者和动物组织、体液样本的病毒载量, 检测病毒耐药突变体以及患者体内的感染标志物等, 对于监测患者体内病毒的耐药状况, 跟踪治疗进程, 评估疫苗预防效果或药物治疗效果等具有重要的临床意义。

在狂犬病诊断中, 可应用实时荧光定量PCR对患者的唾液、脑组织等样本进行检测, 为狂犬病诊断提供证据; 还能够对被感染动物进行死前检测, 如对低病毒载量的唾液、脑脊液、血清等样本进行检测, 无需提取动物脑组织进行DFA检测, 灵敏度很高, 检测速度快, 具有很大的检测优势。狂犬病病毒属中包含14种病毒, 均有造成人间狂犬病的可能, 而狂犬病疫苗并非对所有狂犬病相关病毒都有预防效果。多重实时荧光定量PCR技术在狂犬病诊断中应用广泛, 使用单一方法对狂犬病病毒属中的大部分病毒进行检测成为可能, 且检测方法高效、快速、灵敏, 具有替代金标准进行狂犬病诊断的潜力, 具有一定的临床意义; 同时在国际交流日益频繁的今天, 对于防控外来病毒具有一定的国际意义。大部分病毒都有特定的流行区域, 如欧洲地区主要流行RABV和欧洲蝙蝠病毒-1/2, 其主要感染和传播动物种类并不相同, 对这些流行病毒进行分型诊断, 从而了解某地区的主要流行病毒的型别, 加强其主要感染和传播动物的管理, 对于狂犬病的防控具有重要意义。

本文主要针对于实时荧光定量PCR在病原检测方面的应用, 在基因表达定量、高度多态性HLA位点的识别、等位基因识别、基因甲基化检测、遗传性疾病检测等领域也被广泛应用, 将此技术与狂犬病病毒等病原体的复制、表达、突变、致病毒力等方面相结合, 探索病毒致病机制, 研究抗病毒治疗方法都需要进一步研究。

(本文工作在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所完成, 在此谨向帮助我的各位老师和同学致谢。)

The authors have declared that no competing interests exist.

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