1.1.1 菌株来源 肠炎沙门氏菌CICC21482为阳性对照菌株, 大肠杆菌ATCC25922为阴性对照菌株, 均有中国动物卫生与流行病学中心实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿增菌液基础(TTB)、胰蛋白大豆肉汤、细菌琼脂粉、MH肉汤均购自北京陆桥生物技术有限公司, 沙门氏菌显色培养基(法国科马嘉), GoTaq Green Master Mix 酶, DNA Marker、PCR反应试剂均购自TaKaRa公司, 沙门氏菌血清型快速分型试剂盒(xMAP Salmonella Serotyping Assay RUO Kit)购自美国Luminex公司生物安全柜(美国NUAIRE)、电热恒温培养箱(美国NUAIRE)、PCR仪(美国BIO-RAD)、电泳仪(北京六一仪器厂)、GelDocXR凝胶成像分析仪(美国BIO-RAD)、Luminex 200液相芯片分析仪(美国Luminex)

1.1.3 引物 所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。

1.2.1 样品来源 2015年采自山东不同地区规模生猪屠宰场屠宰环节猪肉和环境棉拭子样品共1 480份。

1.2.2 细菌分离鉴定 按照GB 4789.4-2016方法进行沙门氏菌分离, 并挑取单个可疑菌落煮沸法提取DNA, 利用保守基因invA引物(上游:5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'; 下游:5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'), 以可疑菌落DNA为模板, 用PCR方法对筛选的可疑菌落进行基因水平鉴定, 产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像, 在284 bp位置有条带的细菌即为沙门氏菌。

1.2.3 xMAP液相芯片法分型 利用沙门氏菌血清型快速分型试剂盒和Luminex 200液相芯片分析仪进行沙门氏菌的血清分型, 能够准确鉴定出目前所有常见的沙门氏菌血清型, 该方法虽然成本较高但方便快捷, 准确率高。

1.2.4 毒力基因检测 参考文献[5, 6, 7, 8]发表的沙门菌mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、hisJ、fliC、stn、fimA毒力基因序列, 设计合成14对沙门菌毒力基因扩增引物, 见表1。

表1

Tab.1

表1(Tab.1)

表1 毒力基因引物序列 Tab.1 Primers sequence of virulence genes 引物 上下游序列5'-3 ' 大小/bp mogA ATTGGCTTAGTTTCTATCTCCG CCTTCCAGCGTTTCTTTGA 419 sseL CTATCCTATTGGGCTTAT GTTGGGTACATTGTTCTG 304 mgtC CGACGATCATTATTCTTTGC GACCGAACCTAACCCTTGT 200 bcfA CTTTGGCGGAATGTTGTC CTGGCTGGTCTGAGTATCG 235 araB AGGTAGACGTGCCGATGACTT CGAATGCGATGTTTGTGCT 558 spvA GCTAACTGTCGGGCAAAG GGACAATGGCACGAACCT 432 spvB CCTGATGTTCCACCACTTTC ATGCCTTATCTGGCGATGT 590 spvC AAGGTCGTTCAACAAGCC CATTTCACCACCATCACG 252 引物 上下游序列5'-3 ' 大小/bp spvD CCCCTGATGATGAGAAGT ACAGTGGGATTAGACAGC 316 spvR CTC TTC CGG TCT GCG TAT C CCA AGA CCA TTA GCC GAG 789 hisJ CGC TCC TAC ATA CGC ACC G AGT GCT CAT TGC CGA AGG TC 359 fliC CTC TTC CGG TCT GCG TAT C CCA AGA CCA TTA GCC GAG 537 stn CTC TTC CGG TCT GCG TAT C CTC TTC CGG TCT GCG TAT C 234 fimA CTC TTC CGG TCT GCG TAT C CTC TTC CGG TCT GCG TAT C 344

表1 毒力基因引物序列 Tab.1 Primers sequence of virulence genes

挑取适量过夜培养的菌落于1 mL灭菌超纯水中, 涡旋均匀后, 12 000r/min离心5 min, 弃上清后加500 μ L灭菌超纯水混匀后置于沸水浴中10 min, 取出立即冰浴10 min, 12 000 r/min离心10 min, 取上清即为PCR模板, 备用, 以大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)作为阴性对照、肠炎沙门氏菌标准菌株(ATCC13076)作为阳性对照。

PCR反应参数:5种毒力岛核心蛋白基因mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB的反应参数为:95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, Tm退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共进行30个循环, 最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。

5种毒力质粒基因spvA、spvB、spvC、spvD、spvR的反应参数:95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, Tm退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共进行35个循环, 最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。

其余4种毒力因子基因hisJ、fliC、stn、fimA的反应参数:95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性45 s, Tm退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共进行35个循环, 最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。

每个样品取7 μ L扩增产物于1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳, DL2000 DNA Marker 作为参照, 140V恒压电泳30 min, 电泳结束后用凝胶成像仪进行成像分析, 记录结果。

1.2.5 ERIC-PCR 分子分型 引物序列:AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。反应体系与参数:ERIC-PCR方法反应体系为25 μ L, Go Taq^○RGreen Master Mix 12.5 μ L, Nuclease-Free Water 9.5 μ L, ERIC引物1 μ L, 核酸模板2 μ L。反应程序, 94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性1 min, 52 ℃退火1 min, 72 ℃延伸3 min, 循环35次, 最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。扩增产物于1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳, 电压140V电泳25 min, 结束后用凝胶成像系统处理图像。

对2015年采集自山东不同地区规模生猪屠宰场屠宰环节1 480份棉拭子进行沙门氏菌分离鉴定后, 共得到298株沙门氏菌菌株, 分离率为20.14%。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 部分疑似沙门氏菌PCR产物电泳图 M: DNA Maker DL1000; A:阳性对照; B:阴性对照; 1-7:疑似样品Fig.1 Suspected salmonella strains electrophoresis results

298株分离菌共分为9种血清型, 检出率较高2种主要血清型分别为德尔卑沙门氏菌(78株)、鼠伤寒沙门氏菌(59株), 其次是汤普逊沙门氏菌(45株)、阿贡纳沙门氏菌(40株)、肠炎沙门氏菌(25株)、罗米他沙门氏菌(18株)、策维埃沙门氏菌(15株)、拉古什沙门氏菌(12株)、奥里塔蔓林沙门氏菌(6株)。不同屠宰环节沙门氏菌血清型不同。详见表2。

表2

Tab.2

表2(Tab.2)

表2 不同屠宰环节血清型个数统计结果 Tab.2 Serotype results of different slaughter links 血清型 剥皮前 剥皮后 开膛后 劈半前 劈半后 冲洗水 屠宰工具 出库前 合计 德尔卑沙门氏菌 13 26 16 9 6 2 5 1 78 鼠伤寒沙门氏菌 1 2 5 9 33 4 4 1 59 汤普逊沙门氏菌 5 3 9 3 7 14 3 1 45 阿贡纳沙门氏菌 0 0 1 1 1 2 0 35 40 肠炎沙门氏菌 0 0 0 0 0 4 20 1 25 罗米他沙门氏菌 3 4 0 9 0 0 2 0 18 策维埃沙门氏菌 3 0 0 0 0 12 0 0 15 拉古什沙门氏菌 2 0 0 10 0 0 0 0 12 奥里塔蔓林沙门氏菌 3 2 1 0 0 0 0 0 6

表2 不同屠宰环节血清型个数统计结果 Tab.2 Serotype results of different slaughter links

对298株分离沙门氏菌中14对毒力基因进行检测发现, 除毒力基因spvB未被检出外, 其余毒力基因均有检出。其中, 所有分离株均携带毒力岛SPI3和SPI4的核心蛋白mgtC、bcfA基因; 98.32%的分离菌株携带肠毒素stn基因; 毒力岛SPI1、SPI5核心蛋白基因mogA、araB以及菌毛基因的携带率, 分别为97.99%、97.99%以及96.64%。详见表3。

表3

Tab.3

表3(Tab.3)

表3 生猪屠宰环节毒力基因检出数 Tab.3 Detected number of virulence genes of pig slaughter links 毒力基因 不同屠宰环节毒力基因检出数 剥皮前 剥皮后 开膛后 劈半前 劈半后 冲洗水 屠宰工具 出库前 合计 检出率% mogA 30 37 32 41 47 38 30 37 292 97.99 sseL 15 16 15 22 47 29 26 30 200 67.11 mgtC 30 37 32 41 47 38 34 39 298 100.00 bcfA 30 37 32 41 47 38 34 39 298 100.00 araB 30 36 32 41 47 38 29 39 292 97.99 spvA 1 2 0 0 0 3 0 0 6 2.01 spvB 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.00 spvC 1 0 0 0 0 0 2 4 7 2.35 spvD 1 2 0 0 0 3 0 0 6 2.01 spvR 2 0 0 0 0 0 1 0 3 1.01 hisJ 15 12 15 0 9 28 31 38 120 40.27 fliC 2 6 10 0 8 5 2 1 34 11.41 stn 30 37 32 41 47 38 32 36 293 98.32 fimA 30 37 32 41 47 38 29 34 288 96.64

表3 生猪屠宰环节毒力基因检出数 Tab.3 Detected number of virulence genes of pig slaughter links

图2

Fig.2

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	图2 沙门氏菌分离株部分毒力基因PCR产物的电泳图 M:DNA Maker DL2000; 1: spvC基因; 2: mogA基因; 3: hisJ基因; 4: sseL基因; 5: fliC基因; 6: spvR基因Fig.2 Electrophoresis results of Salmonella strains virulence genes

图3

Fig.3

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	图3 沙门氏菌分离株部分毒力基因PCR产物的电泳图 M:DNA Maker DL2000; 1:mgtC基因; 2:stn基因; 3:bcfA基因; 4:spvD基因; 5:fimA基因; 6:spvA基因; 7:araB基因Fig.3 Electrophoresis results of Salmonella strains virulence genes

山东省不同地区沙门氏菌的主要血清型不同, 选择不同地区的主要血清型的沙门氏菌共26株菌, 其包括A地区4株德尔卑、3株鼠伤寒和1株阿贡纳沙门氏菌, B地区3株汤普逊和1株拉古什沙门氏菌, C地区2株德尔卑、2株肠炎和1株阿贡纳沙门氏菌, D地区2株肠炎和1株阿贡纳沙门氏菌, E地区2株罗米他、1株策维埃和1株肠炎沙门氏菌, F地区1株阿贡纳纳和1株鼠伤寒沙门氏菌。来自不同地区的26株沙门氏菌遗传相似性在70%~100%之间, 按90%的同源性可以分为 9个基因型(Ⅰ ~IX)。Ⅰ 类为主要基因型, 共有 8 株, 包括3个地区3种血清型。其中4株为德尔卑沙门氏菌, 2株肠炎和2株汤普逊沙门氏菌。且剩余8个基因型主要为同一地区同一血清型的菌株。26株沙门氏菌的ERIC-PCR见图4、图5。

图4

Fig.4

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	图4 26株沙门氏菌分离株ERIC-PCR指纹图谱Fig.4 ERIC-PCR fingerprints of 26 Salmonella isolates

图5

Fig.5

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	图5 沙门氏菌分离株的遗传关系聚类树状图 注:“ -” 之前字母表示地区, “ -” 之后字母为血清型英文的首字母。Fig.5 Genetic relationship of Salmonella isolates

本研究中所鉴定出的德尔卑沙门氏菌, 均携带stn、fimA、mogA、mgtC以及bcfA基因; 所有携带毒力质粒基因沙门氏菌分离株血清型均为肠炎沙门氏菌, 且肠炎沙门氏菌均检测到5种毒力岛基因; 鼠伤寒沙门氏菌中80%均携带hisJ基因, 需大量实验进一步证实鼠伤寒沙门氏菌与hisJ毒力基因是否具有一定的联系; 汤普逊沙门氏菌血清型均检测出stn、fimA基因以及5种毒力岛基因, 但是除未检测到毒力质粒基因去外, 均未检测到hisJ以及fliC基因, 同时, 同实验者在关于鸡源毒力基因的检测研究中, 也未检测到这两种毒力基因, 因而需进一步研究其携带状况与沙门氏菌血清型的关系。 本实验中其他血清型沙门氏菌菌株毒力基因检出情况没有一定的规律性, 需进一步深入研究。

本实验中5种毒力岛核心蛋白基因检出率较高, 大多数沙门氏菌均同时携带这5种毒力岛核心蛋白基因, 需进一步研究其致病性是否一致, 才能更深入的了解其作用机制; 5种毒力质粒基因的检出率较低, 分析可能是因为目前研究表明, 毒力质粒基因仅存在于几种特定的沙门氏菌血清型^[9], 如肠炎沙门氏菌; 鞭毛蛋白基因fliC检出率不高, 但是同实验者对鸡源沙门氏菌毒力因子的检测中, 均未检测出此种基因, 分析其可能具有一定的宿主特异性^[6], 或是产生于特定的血清型, 但是还需大量实验研究进一步确定; 组氨酸转运基底蛋白hisJ 检出率较高, 但是对于hisJ的研究较少, fimA和stn的检出率较高, 与王德宁^[4]检出情况比较接近, 初步表明猪源与鸡源沙门氏菌具有相同的菌毛和肠毒素基因, 但是具体的致病机制及原理有待研究。同时表明猪源沙门氏菌对其有较高的携带率, 因而本实验的沙门氏菌分离株具有很大的潜在危险性, 值得重视, 应采取措施控制沙门氏菌的污染, 从而降低这种潜在的风险。

山东省不同地区主要血清型的ERIC-PCR结果表明, 山东省不同地区主要血清型之间存在相同的基因型, 这可能与屠宰场中生猪的来源相同有关, 山东省是养殖大省, 生猪养殖量大, 但养殖规模参差不齐, 有些屠宰场具有固定的规模化养殖场, 屠宰来源相对比较单一, 而周边的中、小型养殖场送往同一大型屠宰场进行屠宰导致不同地区的沙门氏菌具有同一基因型。