引用本文
王新敏, 王小芳, 卢洋, 杨菩, 韩玲, 王英姿, 张万江, 章乐. 阻断小鼠Mcl-1表达信号通路对BCG感染的影响[J]. 中国人兽共患病学报, 2018,34(9): 823-829.
WANG Xin-min, WANG Xiao-fang, LU Yang, YANG Pu, HAN Ling, WANG Ying-zi, ZHANG Wan-jiang, ZHANG Le. Influences of blocking the signals pathway of Mcl-1 expression on mouse infected with BCG[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2018,34(9): 823-829.  
DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.169
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中国人兽共患病学报
阻断小鼠Mcl-1表达信号通路对BCG感染的影响
王新敏1, 王小芳2, 卢洋2, 杨菩2, 韩玲2, 王英姿2, 张万江2, 章乐2
1.石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科,石河子 832002
2.石河子大学医学院病理生理学教研室,石河子 832002
通讯作者：章 乐, Email:1257067540@qq.com
基金资助: 国家自然科学基金(No.81660330)资助
摘要

目的 探讨下调Mcl-1表达信号通路对BCG感染的小鼠模型的影响。方法 首先制备好BCG菌悬液感染BALB/c 小鼠,再分别用调控Mcl-1表达的不同信号通路阻断剂腹腔注射感染小鼠模型,并同时设立对应的对照组,于处理后的1 d、3 d、5 d、7 d处死小鼠并收集腹腔巨噬细胞。应用TUNEL检测不同阻断剂在不同时间点处理后小鼠巨噬细胞凋亡率,细胞免疫化学分析不同阻断剂处理下Mcl-1的表达,HE染色和脏器指数分析不同阻断剂处理对小鼠脏器病变的影响。结果 与对照组比,信号通路阻断剂处理后,BCG感染组巨噬细胞凋亡率均有不同程度的增高,其中PD98059处理组巨噬细胞凋亡率最高( F=40.621, P<0.001)。而且阻断剂PD98059处理后,巨噬细胞内BCG的菌落数量明显减少( t=3.392, P<0.001),小鼠肝、肺、脾、肾的病变程度明显减轻( F=59.24, F=811.134, F=34.091, F=9.543, P<0.05),脏器病理损伤也有所改善。结论 应用阻断剂PD98059阻断Mcl-1表达信号通路可有效控制结核病的潜伏感染和持续感染。

关键词: 结核; Mcl-1信号通路; 巨噬细胞; 细胞凋亡
中图分类号:R378.91 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2018)09-0823-07
Influences of blocking the signals pathway of Mcl-1 expression on mouse infected with BCG
WANG Xin-min1, WANG Xiao-fang2, LU Yang2, YANG Pu2, HAN Ling2, WANG Ying-zi2, ZHANG Wan-jiang2, ZHANG Le
Corresponding author:Zhang Le, Email: 1257067540@qq.com
Fund:Funded by the National Natural Science Foundation of China (No.81660330)
Abstract

In the study, we aimed to investigate the impact of inhibiting the signals pathway of Mcl-1 expression on mouse model infected with BCG. Firstly, bacteria suspension of BCG was prepared to infect BALB/c mice, and then different signaling pathways inhibitors treatment was used to establish a mouse model, a corresponding control group at the same time was set up. The mice were executed and the mouse peritoneal macrophages at the treatment of 1 d, 3 d, 5 d, 7 d were collected. The apoptosis of the macrophages treated with BCG at different time points after different inhibitors-treated was analyzed by TUNEL technique, cell immunochemical analyzed the expression of Mcl-1 after different inhibitors-treated, HE staining analyzed the pathological injury of organs in mice after inhibitors-treated, and the degree of pathological changes was analyzed by the viscera index. Result showed that the apoptosis rate of macrophages was increased at different degree in inhibitors-treated BCG infection group compare with the control group, and PD98059 treatment group was highest ( F=40.621, P<0.001).Moreover, the number of BCG in macrophages was decreased significantly( t=3.392, P<0.001), the pathological injury of liver, lung, spleen, kidney organs in mice were relieved and organs lesions were decreased significantly ( F=59.24, F=811.134, F=34.091, F=9.543, P<0.05). In summary, the application of blocker PD98059 blocking Mcl-1 signaling pathway can effectively control the latent infection and persistent infection of tuberculosis. This study provides more theoretical basis for the introduction of Mcl-1 intervention to prevention and control of tuberculosis infection.

Keyword: tuberculosis; Mcl-1 signals pathway; macrophages; cell apoptosis

结核分枝杆菌(MTB)是肺结核(TB)的主要致病菌, 以呼吸道为主要传播途径, 机体感染结核分枝杆菌后, 有10.0%左右的机会发展成活动性肺结核[1]。在2016-2020年的结核病全球结核病战略报告中, 中国仍然是30个结核病高负担国家之一, 而且正面临着严重的TB、MDR-TB和TB/HIV混合的复杂局面[2]。我国每年因结核病死亡人数是其它传染病总人数的两倍, 结核病患者总人数就占全球总数的11%[3], 已被WHO列为需要特别引起警示的国家之一[4]。更严峻的局面是, 在2016年全球估算的新发结核病患者中, 有410万例未被诊断或未被登记, 占同年全球新发病例的39%[2]。漏诊问题不仅与当地诊疗条件及患者本身有关, 更与当前所用结核病诊断工具的敏感性和特异性不高等问题有关。因此, 尽早诊断潜伏结核感染者, 合理应用抗结核药物、控制结核是目前的当务之急。而有研究提出Mcl-1干预是结核潜伏感染防控的一个新方向[5]。故本研究探讨了下调Mcl-1表达的信号通路对BCG感染的小鼠模型的影响, 旨在为Mcl-1干预应用于结核病潜伏感染的防控提供更多的方向和理论依据。

1 材料与方法
1.1 实验所用菌株, 动物及阻断剂

实验所用BCG菌株由中国药物生物制品检定所提供并保存。实验所用小鼠为8周龄的SPF 级(无特定病原体动物)的健康雌性BALB / c小鼠, 重约18± 2 g, 购买于石河子大学实验动物中心。所有关于动物的研究及操作都是经过实验前批准的动物伦理委员会(IAEC)的协议进行的。阻断剂AG490、PD98059和LY29400的规格为5 mg。稀释时将其分别溶解, 按试剂说明每支加入0.5 mL的DMSO溶解, 稍微摇晃后混合均匀, 保存在-20 ℃的冰箱中备用。

1.2 主要试剂

10%的胎牛血清购置于美国Thermo公司, PD98059和LY294002购自于美国Sigma公司, 1640和DMEM 购自于美国HyClone公司, 辣根过氧化物酶(HRP山羊抗兔)购买于北京中杉金桥生物技术有限公司, Tween-80购置于中国天津, TritonX-100购买于中国南京森贝伽生物科技有限公司, Mcl-1 polyclonal Antibody购买于中国北京博奥森生物技术有限公司, 其余实验试剂均取自石河子大学病理实验室。

1.3 方 法

1.3.1 实验分组

将实验小鼠分为阻断剂组, 阻断剂+BCG组和空白对照组, 再将AG490+BCG组、PD98059+BCG组、LY294002+BCG组, 同时设1 d、3 d、5 d、7 d 共4个时间点, 每组每个时间点各设3只小鼠(经过预实验的筛选, 时间点的选择是根据Mcl-1的表达水平确定; 实验中小鼠数量是根据收集并提取的小鼠腹腔巨噬细胞的数量确定)。阻断剂注射剂量为100 μ g/只(注射剂量为实验组前期筛选所得)[6]。

1.3.2 结核分枝杆菌感染小鼠模型构建

室温下, 在生物安全柜内, 用苏通培养液与生理盐水的混合物(0.5 mL; 体积比为3∶ 1)来稀释细菌, 取100 μ L细菌稀释液涂抹在改良罗氏培养基上。在2~3周后, 灭菌接种环取罗氏培养基上生长状态良好的结核分枝杆菌菌落, 置于灭菌的磨菌器中, 加入少量的含有0.05%的Tween-80的生理盐水充分研磨, 使其成均匀浑浊的菌悬液。将细菌悬液按照麦氏比浊法的标准调整至1.0× 107菌落(CFU)/毫升。将0.3 mL的菌悬液通过小鼠腹腔注射的方式注射到对应分组的小鼠体内[7]。将感染后的小鼠置于生物安全三级实验室内, IVC 笼具中饲养。在上述时间点将阻断剂AG490、PD98059、LY294002经腹腔注入各组小鼠体内。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬细胞的收集与提取

在室温在, 于上述不同的时间点, 将各组小鼠脱颈处死后, 用75%乙醇消毒小鼠腹部皮肤, 置于超净台中; 用无菌的镊子将小鼠下腹部皮肤提起撕开, 完全暴露出腹膜; 提起腹膜, 用5 mL注射器向小鼠腹腔中注入5 mL 1640培养基, 反复按摩腹部约10 min, 避开肠和脂肪, 不同的方向反复抽吸数次并收集所有吸出的腹腔液; 将其在1 200 r/min条件下离心5 min, 弃上清, PBS液洗涤1次, 用DMEM培养液(含10%胎牛血清)将细胞重悬; 将收集处理好的细胞接种到6孔细胞培养板中, 置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 h, 贴壁细胞即为小鼠腹腔巨噬细胞[8, 9]。

1.3.4 TUNEL技术检测细胞凋亡

将各组小鼠于上述不同时间提取并培养小鼠腹腔巨噬细胞。在室温下, 将其固定于4%的多聚甲醛(pH 7.4)上, 固定约15 min, PBS冲洗3次5 min后, 加入0.1% Triton X-100裂解细胞, 放在冰上约8 min, PBS冲洗3次5 min。按照TUNEL试剂盒说明操作, 凋亡的细胞被TUNEL反应混合物标记出来, TUNEL阳性细胞的数量被观察到。

1.3.5 结核分枝杆菌菌落计数(CFU)

将收集提取的腹腔液放入离心机中, 6 000 r/min离心20 min, 去上清后, 加入 1 mL 1% Triton X-100 对巨噬细胞进行裂解, 显微镜下观察巨噬细胞全部裂解后(约 10 min), 加入1 mL DMEM 培养基(含 10% 胎牛血清)终止裂解, 微型振荡器上振荡混匀约5 min, 分别进行10-2、10-3和10-4倍稀释, 最终接种于罗氏培养基上。 每个稀释浓度涂抹3个平板, 置于 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养, 21 d后对其菌落进行计数。

1.3.6 细胞免疫化学检测Mcl-1的表达

将收集并提取的小鼠腹腔巨噬细胞制成细胞涂片, 于4 ℃固定在4%多聚甲醛过夜。PBS洗涂片2次后, 10%的胎牛血清中放置30 min, 然后将其在4 ℃抗体孵育过夜。一抗为兔抗鼠Mcl-1, 浓度为1∶ 1 000, 二抗为PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物, 浓度为1∶ 200。在室温下, 使用streptavidinper氧化酶复合物孵育30 min, 在黑暗中应用3'-氨基苄苯胺3~5 min。然后用苏木素和伊红(H& E)清洗和复染。两个病理学家进行了免疫组织化学分析, Mcl-1表达的亚细胞位置(核和胞质)被记录在400× 放大。参照文献[10], 以阳性和负染色的巨噬细胞计数, 并以Mcl-1阳性巨噬细胞的百分比表示。

1.3.7 HE染色观察小鼠脏器的变化

在小鼠被处死后, 立即将其肺、肝、脾、肾取出, 固定于10%的福尔马林中, 并用石蜡包埋。经过95%乙醇和无水乙醇进行脱水处理后, 用二甲苯进行30 min的处理。然后, 石蜡包埋、切片、脱蜡处理后, 分别用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇依次脱水5 min。最后, 通过苏木精和伊红着色。显微镜下观察和评估每个图像中存在的炎症水平, 炎症区会比非炎症区染得更浓。由于不同的成分, 细胞质表现出不同的颜色, 从而观察到细胞或组织的组成和病变。

1.3.8 小鼠脏器指数测定

在上述时间点解剖小鼠, 立即摘取小鼠的肝、脾、肺、肾进行精密称重和测量。脏器指数=脏器重量(mg)/小鼠体重(g)× 100%, 用脏器的重量与动物体重的比值表示感染脏器的病变程度, 即脏器重量指数, 则该指数愈大, 表示病变程度愈重。

1.4 统计学分析

数据通过SPSS17.0统计软件处理, 计量资料以均数± 标准差( x¯± s)描述, 利用SPSS17.0统计软件对实验结果进行分析处理, 实验所得数据资料进行t检验或单因素方差分析(ANOVA), 应用SNK-q检验进行多个样本均数间的两两比较; 计数资料或计量资料不服从正态性且方差不齐时采用非参数检验, 以P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果
2.1 阻断Mcl-1蛋白信号通路促进了小鼠腹腔巨噬细胞凋亡

由于调控Mcl-1表达的信号通路有3条, 不同阻断剂对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导效果有何差异呢?因此, 我们应用TUNEL技术检测了阻断剂AG490、PD98059、LY294002阻断Mcl-1表达的信号通路后小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率。而在本研究中, 由于实验前期研究发现阻断剂处理后第5 d作用效果最好[6], 因此本实验仅分析了阻断剂处理后第5 d对小鼠巨噬细胞的影响。TUNEL结果显示, 与对照组相比, BCG感染组巨噬细胞的凋亡率高于对照组, 差异具有统计学意义(t=-9.048, P< 0.05; 图1A; 表1)。阻断剂AG490、PD98059、LY294002作用于BCG感染的小鼠后, 与未感染组相比, 小鼠腹腔巨噬细胞凋亡率均呈现不同程度的升高(t=-7.076, t=-10.662, t=-8.994, P< 0.001), 其中阻断剂PD98059的巨噬细胞凋亡率显著高于AG490和LY294002, 差异具有统计学意义(F=40.621, P< 0.001; 图1A)。

图1 抑制剂处理的BCG感染的小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率和菌落计数
注:(A) * P< 0.05 为抑制剂处理组与未处理组相比, #P< 0.05为感染组与未感染租相比; (B) * P< 0.05 为 BCG感染组与PD98059处理的BCG感染组相比Fig.1 Apoptosis rate and CFU in inhibitors treated mouse peritoneal macrophages infected with BCG

表1 抑制剂处理的BCG感染的小鼠巨噬细胞中Mcl-1的表达和凋亡率 Tab.1 The expression of Mcl-1 and apoptosis rate in inhibitors-treated mouse peritoneal macrophages infected with BCG
2.2 阻断剂PD98059作用减少了巨噬细胞内结核杆菌的数量

为了判断阻断Mcl-1表达的信号通路对小鼠巨噬细胞内结核分枝杆菌清除的效果, 我们检测了阻断剂PD98059处理后小鼠巨噬细胞内BCG的菌落数量。菌落计数结果显示, 与未处理感染组相比, 阻断剂PD98059处理后小鼠巨噬细胞内BCG的数量显著减少(t=3.392, P< 0.001; 图1B), 而且比处理前减少了约58%(处理前为4.3× 107, 处理后为1.8× 107)。

2.3 阻断剂PD98059处理抑制了Mcl-1的表达

考虑到阻断剂的应用不同程度增加了宿主巨噬细胞的凋亡率, 而 MAPK信号通路阻断剂PD98059比PI-3K和JAK / STAT通路阻断剂诱导更多的小鼠腹腔巨噬细胞凋亡, 因此, 我们推测MAPK信号通路是结核感染小鼠巨噬细胞时调控Mcl-1表达的主要通路。因而我们通过细胞免疫化学检测了不同阻断剂应用下Mcl-1的表达。细胞免疫化学数据结果显示, 感染了BCG的小鼠腹腔巨噬细胞中, Mcl-1的染色呈现阳性表达(表1)。用阻断剂AG490、 LY294002处理的H37Ra感染的小鼠腹膜巨噬细胞中Mcl-1的表达受到抑制, 而阻断剂PD98059处理组Mcl-1的表达受到明显抑制。这些结果证实了我们之前的猜测, 与BCG感染组相比, 阻断剂PD98059处理BCG感染的小鼠腹腔巨噬细胞后, Mcl-1的表达显著降低, 其阳性细胞只达到30%(表1)。

2.4 Mcl-1信号通路抑制剂处理减轻了结核感染的小鼠脏器的病理损害

2.4.1 BCG感染组肺脏

肺毛细血管轻度淤血(图2A-b); AG490+BCG组肺脏:肺毛细血管淤血(图2A-c); PD98059+ CG组肺脏:肺毛细血管淤血减轻(图2A-d); LY294002+BCG组肺脏:肺毛细血管轻度扩张、淤血(图2A-e)。

图2 阻断剂AG490、 PD98059和LY294002处理的BCG感染的小鼠脏器组织化学变化Fig.2 Histological changes in BCG-infected mice organs treated with the inhibitors AG490, PD98059, LY294002

2.4.2 BCG感染组肝脏

中央静脉扩张淤血不明显, 汇管区淋巴细胞浸润不明显(图2B-b); AG490+BCG组肝脏:中央静脉扩张淤血, 部分区肝细胞轻度增大, 胞浆细颗粒状红染, 汇管区少量淋巴细胞浸润(图2B-c); PD98059+BCG组肝脏:中央静脉轻度扩张淤血, 汇管区淋巴细胞浸润减少(图2B-d); LY294002+BCG组肝脏:中央静脉扩张淤血减轻(图2B-e)。

2.4.3 BCG感染组脾脏

脾红髓淤血水肿, 散在出血(图2C-b); AG490+BCG组脾脏:脾红髓淤血水肿、出血(图2C-c); PD98059+BCG组脾脏:脾红髓轻度水肿、出血减少(图2C-d); LY294002+BCG组脾脏:脾红髓水肿, 出血程度减轻(图2C-e)。

2.4.4 BCG感染组肾脏

肾小球轻度淤血(图2D-b)。AG490+BCG组肾脏肾小球和肾间质毛细血管和小静脉部分区扩张淤血(图2D-c); PD98059+BCG组肾脏:肾间质毛细血管和小静脉扩张淤血减轻(图2D-d); LY294002+BCG组肾脏:肾间质毛细血管和小静脉扩张淤血, 肾小球扩张淤血(图2C-e)。

2.5 阻断剂PD98059的应用减轻了小鼠脏器病变程度

为了直观的分析Mcl-1信号通路阻断剂对小鼠脏器的影响, 我们还计算了小鼠肺脏、肝脏、脾脏和肾脏的脏器指数。与对照组相比, BCG感染后, 各组脏器重量均有不同程度的增加, 其中以BCG感染组肺、肝、脾脏器坏死比例减轻最为明显(t=-14.495, t=9.648, t=-11.013, P< 0.001; 图3), 而肾脏的差异较小(t=-2.45, P=0.04)。当阻断剂 AG490、PD98059、LY294002作用于BCG感染的小鼠模型后, 小鼠肺、肝、脾脏器的脏器指数明显减少, 而肾脏只有PD98059处理组减少; 不同干预方式比较发现, 阻断剂PD98059处理组效果最为显著, 差异具有统计学意义(F=59.24, F=811.134, F=34.091, F=9.543, P< 0.05; 图3)。

图3 阻断剂AG490、PD98059和LY294002处理的BCG感染组小鼠脏器指数变化
注:* P< 0.05 为抑制剂处理组与未处理组相比, #P< 0.05为感染组与未感染组相比Fig.3 Viscera index changes of mice in inhibitors AG490, PD98059, LY294002 treated BCG infection group

3 讨 论

MTB是一种典型的细胞内病原体, 可以通过多种机制躲避机体的免疫系统的杀伤和清除, 从而影响宿主细胞(单核细胞-巨噬细胞)的调控。它还能改变巨噬细胞的功能, 抑制细胞凋亡通路的激活, 从而使病原体复制、繁殖并生活在巨噬细胞内[1]。因此, 有效的控制结核的潜伏感染是目前结核病预防与控制的主要策略。如若能够激活宿主巨噬细胞正常的凋亡过程, 则可以有效消除结核的潜伏感染, 并能够防止结核病在体内的持续传播。而研究发现抗凋亡蛋白骨髓细胞白血病-1(Mcl-1)与宿主巨噬细胞的这一凋亡过程密切相关[11]。

而近年来, 对Mcl-1基因的研究主要集中在与肿瘤相关的疾病[12]。因此, 将该基因用于控制结核病感染将是一个新的挑战。在当前的研究中, TUNEL的结果发现, 应用阻断剂AG490、PD98059和LY294002抑制Mcl-1的表达后, 导致小鼠巨噬细胞凋亡率呈现不同程度的增加(图1)。而且阻断剂PD98059处理后, 小鼠巨噬细胞内存活的结核杆菌的菌落数量显著减少(图1)。此结果说明将Mcl-1干预引入到结核病的预防与控制中是可行的, 而且它将是很有潜力的一个应对结核潜伏感染的预防和控制策略。

不同的组织和细胞中, 调控Mcl-1表达的信号通路有差异, 主要通过JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)、MAPK(Mitogen activated protein kinase)和PI-3K(Phosphatidy linositol 3-kinase)等胞内信号通路的激活来调控[13, 14, 15]。在本实验中, 应用JAK/STAT、MAPK和PI3K信号通路阻断剂下调Mcl-1的表达, 都增加了BCG感染的小鼠巨噬细胞的凋亡。但细胞免疫化学的结果显示, 当应用MAPK信号通路阻断剂处理BCG感染的小鼠腹腔巨噬细胞时, Mcl-1的表达被明显的抑制了(表1)。此结果说明MAPK通路为结核感染的小鼠巨噬细胞中调控Mcl-1表达的主要通路。

MAPK信号通路其亚族主要包括细胞外调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2), P38, c-Jun氨基末端激酶(JNK)和ERK5等[16], 多种细胞因子诱导Mc1-1的转录上调都依赖于MAPK的活性[17]。PI3K(磷脂酰肌醇激活) 信号通路通过影响下游多种效应分子发挥其抗凋亡作用[18]。JAK/STAT信号转导通路阻断剂AG490可阻断多种细胞因子引起的JAK2/STAT3的磷酸化激活, 继而阻断JAK/STAT信号转导路径。结核杆菌感染巨噬细胞后, 诱导其生成大量的TNF-α , 使得Caspases酶活性增强以启动细胞凋亡。而Caspases酶系可以分解Mcl-1导致其上调。阻断剂抑制Mcl-1的表达后, TNF-α 的生成受到抑制以拮抗Mcl-1的下调。MAPK通路通过三条支路共同发挥作用, 以致于Mcl-1的表达显著下调; 而JAK/STAT和PI3K途径阻断后Mcl-1的表达较少。因此, MAPK通路阻断后造成更多的Mcl-1表达, 诱导更多的小鼠腹腔巨噬凋亡。

为了证实Mcl-1引入结核感染的有效性, 我们观察和分析了BCG感染后小鼠的肺脏、肝脏、脾脏和肾脏的脏器指数和HE染色变化。HE染色的结果发现, 阻断剂应用后能够有效改善小鼠肺脏、肝脏和脾脏的病理损伤, 特别是在阻断剂PD98059处理后(图3)。除此之外, 阻断剂的应用还能够减轻小鼠脏器的病变程度。然而, 阻断剂应用后对肾脏的影响较小, 主要原因可能是肾脏发生结核所需要的病程时间应当较长, 而本实验的研究时间较短, 并不能观察到肾脏的明显病理改变。

综上所述, 阻断Mcl-1表达的信号通路可以有效促进小鼠巨噬细胞凋亡, 减少宿主巨噬细胞内潜伏的结核杆菌的存活, 改善小鼠脏器因结核感染造成的病理损伤, 减轻病变程度。而MAPK通路为结核感染的小鼠巨噬细胞凋亡调控的主要通路。此研究为结核病潜伏感染和持续感染提供了一个新的方向。然而, 对于MAPK信号通路的研究仅仅是初步的, 其各个支路如何发挥调控作用将在后续的实验中进行深入探讨。

The authors have declared that no competing interests exist.

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