作者简介:(跃华和海岩对本文具有同等贡献,为并列第一作者)
目的 了解2015-2018年内蒙古自治区B Yamagata系流感病毒的全基因组序列特征。方法 采集流感样病例呼吸道标本进行流感病毒分离,提取病毒RNA,采用一步法RT-PCR扩增病毒全基因组序列并测序,通过生物信息学软件分析病毒基因特征。结果 本次研究的B Yamagata系流感病毒全基因与B/Phuket/3073/2013疫苗株的核苷酸同源性在97.7%~99.9%之间;B/Inner Mongolia/1200/2015和B/Inner Mongolia/1178/2015毒株发生抗原漂移,并出现HA-BY/NA-BV系间重配现象;所有毒株对神经氨酸酶抑制剂敏感。结论 2015-2018年内蒙古自治区B Yamagata系流感病毒抗原性和基因特征在逐渐发生变异,出现系间重配株,部分流感流行株与疫苗匹配性不佳。
To investigate genetic characteristics of influenza B Yamagata lineage viruses in Inner Mongolia from 2015 to 2018, respiratory specimens were collected from influenza like illness cases and influenza viruses were isolated from them. The complete genomes were amplified by one step RT-PCR and sequences were analyzed via bioinformation. There was 97.7%-99.9% homology in nucleotides between the complete genomes of influenza B Yamagata lineage viral strains and the B/Phuket/3073/2013 vaccine strain. Antigenic drift and intra-lineage reassortant between HA gene from B Yamagata lineage and NA gene from B Victoria lineage were showed in B/Inner Mongolia/1200/2015 and B/Inner Mongolia/1178/2015. All the viral strains were sensitive to neuraminidase inhibitors. The antigen and genetic characteristics of influenza B Yamagata lineage viruses in Inner Mongolia were mutated gradually, several intra-lineage reassortant influenza B viruses showed up, and influenza vaccine could not provide protection to part of B Yamagata lineage virus infection.
流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病, 其主要通过近距离飞沫传播, 具有高度传染性, 其发病率居法定报告传染病的首位, 是第一个实行全球性监测的传染病。由于流感病毒基因的高度变异性, 人群对其普遍易感, 易造成人群反复感染, 发病率高, 可在世界范围内广泛流行。每次流感流行后, 都会造成不同程度的超额死亡和巨大的经济损失[1, 2]。
流感病毒为单股负链RNA病毒, 属正粘病毒科, 其基因组由8 条分节段的RNA片段组成.根据其核蛋白(nucleoprotein, NP)和基质蛋白(matrixprotein, MP)的特性不同, 可将流感病毒分为甲型(A)、乙型(B)、丙型(C)3型, 最近有研究表明, 在饲养动物(猪、牛) 中发现了丁型(D) 流感病毒[3, 4]。与甲型流感相比, 乙型流感不分亚型而根据其抗原性和基因特征的不同分为2个谱系, 即B Victoria系和B Yamagata系[5]。2017年底至2018年初, 中国流感呈现了一个高于同期水平的流行高峰, 且以B Yamagata系流感病毒流行为主, 与此同时, 内蒙古自治区也出现相同的流行峰, 为进一步了解内蒙古自治区B Yamagata系流感病毒的变异变迁情况, 本文对2015-2018年内蒙古自治区的B Yamagata系流感病毒全基因特征进行分析, 为乙型流感防控提供依据。
本研究选取的2015-2018年B Yamagata系流感病毒株均来自于内蒙古自治区流感网络实验室。这些毒株是由各哨点医院上送的流感样病例咽拭子经犬肾传代细胞(MDCK Cell)培养和(或)鸡胚培养后所分离, 再由血凝实验和血凝抑制实验复核确认后保存于-70 ℃冰箱。其中, 2015年3株, 2017年3株, 2018年2株。
病毒RNA提取采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit, 具体操作方法见试剂盒说明书; 一步法PCR扩增试剂采用TaKaRa公司的PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2, 配置扩增反应体系见说明书, 全基因组扩增引物参照文献[6], 由上海伯杰生物科技有限公司合成。一步法RT-PCR反应程序如下:50 ℃ 30 min, 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30 cycles; 72 ℃ 10 min, 4℃保温。反应结束后取PCR产物5 μ L进行1%琼脂糖凝胶电泳核实扩增目的条带, PCR产物测序由上海伯杰生物科技有限公司完成。
测序所得片段用DNAStar中的Seqman进行拼接, 利用NCBI网站中的Blast比对验证所得的全基因序列, 并用MEGA6.0软件使用Neighor-Joining(NJ)法绘制系统进化树, 构建全基因系统发育树, 并使用Bootstrap法进行检验, 重复次数为1 000次。分析毒株基因遗传进化特征, 并与WHO 推荐的疫苗株与和参比株的核苷酸进行比较分析毒株的遗传性、抗原性、耐药性等基因特征。分析中用到的疫苗株和参比株序列均来自GenBank和GISAID网站。
以WHO推荐北半球疫苗株B/Phuket/3073/2013为标准, 对2015-2018年内蒙古自治区的8株B Yamagata系流感毒株全基因组序列进行核苷酸同源性分析。结果发现, 所有毒株的8个基因节段与疫苗株的核苷酸同源性在97.7%~99.9%之间, 其中, B/Inner Mongolia/1200/2015和B/Inner Mongolia/1178/2015毒株的NA基因核苷酸序列与疫苗株的同源性相对较低, 分别为97.7%和97.8%, 见表1。
通过绘制全基因进化树图发现, 除NP基因外, 其他节段在进化树中均形成明显的B Yamagata系和B Victoria系两大分枝。内蒙古自治区2015-2018年度的大部分B Yamagata系流感病毒株的各节段基因在进化树中共同处于同一独立分枝中, 且与B/Phuket/3073/2013疫苗株距离较近; 但B/Inner Mongolia/1178/2015和B/Inner Mongolia/1200/2015两个毒株的NP和NA基因与疫苗株处于不同分枝中, 遗传距离较远, 且出现HA-BY/NA-BV系间重配现象。HA、NA和NP基因进化情况见图1, 其余节段基因进化树均与HA类似。
2.3.1 血凝素基因(HA)氨基酸分析结果
内蒙古自治区2015-2018年B Yamagata系流感病毒株相对于B/Phuket/3073/2013疫苗株均出现L172Q和D196N变异, 2017-2018年毒株均出现M251V突变, 其中B/Inner Mongolia/1178/2015和B/Inner Mongolia/1200/2015两个毒株相对于疫苗株还出现T75N、K116R和D232N(近受体结合位点)变异, 见表2。
2.3.2 神经氨酸酶基因(NA)氨基酸分析结果
由于乙型流感病毒缺乏M2蛋白离子通道[7], 故其对金刚烷胺类药物不敏感, 故神经氨酸酶抑制剂为其首选治疗药物。NA基因的一些氨基酸突变会导致病毒对神经氨酸酶抑制剂敏感性降低, 本次研究发现病毒株的神经氨酸酶活性中心仍保持较高的保守性, 其功能部位的氨基酸序列为:E117、R150、D197、I221、H273、R292、N294、R374和G407(B Yamagata Number)[8], 故病毒株仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。
2.3.3 HA糖基化位点分析
氨基酸的潜在糖基化位点是通过N-糖苷键结合在Asn(天冬氨酸)-X-Thr(苏氨酸)或Asn(天冬氨酸)-X-Ser(丝氨酸)的Asn残基上形成的。本次研究发现所有毒株HA蛋白中存在固定的11个潜在糖基化位点, 分别位于:第25、59、145、167、196、303、332、491、517、530和577位, 其中第196位位于抗原决定簇190螺旋中, 而B/Inner Mongolia/1588/2017、B/Inner Mon-golia/1200/2015和 B/Inner Mongolia/1178/2015毒株在第232位出现D→ N突变, 增加了一个潜在糖基化位点。NA蛋白中存在固定的5个潜在糖基化位点, 分别位于:第56、64、144、284和463位, 而HA-BY/NA-BV重配株则缺少了第463位潜在糖基化位点。
自1983年以来, 乙型流感根据其抗原性和基因特征分成了Yamagata和Victoria两大谱系。乙型流感虽然不会引起世界性大流行, 但常常导致流感的局部暴发, 其也是通过病毒表面蛋白的不断变异来改变病毒抗原性, 逃避宿主免疫, 从而导致不断的流行[9]。乙型流感的HA基因的抗原决定簇包含了4个区域, 分别为:120环(116-137)、150环(141-150)、160环(162-167)和190螺旋(194-202), 还包括120环的第75和77位氨基酸。上述氨基酸的改变会导致乙型流感病毒抗原发生漂移甚至发生转变。本次研究的病毒株在上述区域中的氨基酸序列相对保守, 相对于B/Phuket/3073/2013疫苗株均出现L172Q和D196N变异。然而, B/Inner Mongolia/1178/2015和B/Inner Mongolia/1200/2015两个毒株除上述2个位点变异外, 还出现T75N、K116R和D232N变异。流感病毒出现具有流行意义的新变异被定义为:在其抗原决定簇上有4个以上位点发生氨基酸替换, 且替换涉及2个以上抗原决定簇[10], 故上述2个毒株可以初步判断出现抗原漂移现象, 可进一步结合抗原表型分析来确定是否为疫苗低反应株。流感病毒血凝素糖基化位点对蛋白的结构和功能十分重要, 其主要作用是稳定血凝素蛋白结构, 防止血凝素被水解以及阻碍被抗体识别等。本次糖基化分析中发现, 8个毒株HA1区均有6个潜在糖基化位点, 而B/Inner Mongolia/1178/2015和B/Inner Mongolia/1200/2015毒株还增加了第232位潜在糖基化位点, 这些均可导致抗原表位被掩盖, 可能会造成存在于宿主体内的原有抗体不能与抗原位点结合, 成为流感流行的优势株。本次研究的病毒株NA基因的酶活性中心均保持了高度的保守性, 未发现神经氨酸酶抑制剂耐药位点变异, 故奥司他韦、扎那米韦等抗病毒药物仍是乙型流感的首选药物。
在同源性分析中发现, 2015-2018年内蒙古自治区的B Yamagata系流感病毒与B/Phuket/3073/2013疫苗株保持高度同源, 但B/Inner Mongolia/1200/2015和B/Inner Mongolia/1178/2015毒株的NA和NP基因核苷酸序列与疫苗株的同源性相对较低, 结合遗传进化树图也可发现, 这两株毒株的NA和NP基因距离疫苗株较远, 其NA基因且出现了HA-BY/NA-BV的谱系间重配现象, 进一步佐证疫苗可能对其不具有保护效果。上世纪80年代起, B型流感NP基因从Ⅲ 型进化至如今的Ⅱ 型, 其中B Victoria和B Yamagata系流感病毒的NP基因在Ⅱ 型进化树中交织进行[11, 12], 在进化过程中上述两株病毒的NP基因仍倾向于B Victoria系流感, 如图所示, 其进化距离已和B/Phuket/3073/2013疫苗株相距较远, 推测NP基因可能发生了内部重排, 或许与其他节段蛋白的协同作用有关, 可进一步开展分子生物学深入研究。通过流感病原学监测发现[13], 内蒙古自治区2013年以甲型H1N1流感为流行优势株, 2014年以H3N2流感为流行优势株, 而2015年初B Yamagata系流感成为人群主要流行优势株, 这或许也与本次病毒基因研究发现2015年的毒株发生抗原漂移, HA和NA发生基因谱系间重配, NP发生基因内部重排, 而导致人群免疫屏障无法建立有效保护有关。其余6份毒株的8个基因节段与疫苗保持了高度同源, 同源性均达99.0%以上, 并且在进化树中同处一分枝中, 故可以判断疫苗对其具有较好的保护效果。
由于B Yamagata和B Victoria系流感病毒可在人群中同时流行, 增加了二者发生基因重配的机会, 通过全基因分析发现本次重配仅发生在HA和NA基因之间, 未见其他基因的重配现象, 重配是否影响乙型流感病毒的生长特性、毒力、致病性等, 可进一步深入研究。
The authors have declared that no competing interests exist.
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