福建省鼠伤寒沙门菌β-内酰胺耐药表型及ESBLs耐药基因分析
邱玉锋1, 陈建辉1, 黄梦颖1, 杨劲松1, 林杰1, 陈爱平1,2
1.福建省疾病预防控制中心, 福州 350001
2.福建省人兽共患病研究重点实验室,福州 350001

作者简介:邱玉锋,Email:416286133@qq.com; ORCID: 0000-0003-2842-6735

摘要
目的 调查福建省鼠伤寒沙门菌β-内酰胺耐药状况及其与ESBLs耐药基因之间的关系。方法 利用微量肉汤稀释法测定83 株鼠伤寒沙门菌对β-内酰胺类及ESBLs菌株其他18种药物的最小抑菌浓度(MIC)并计算耐药率;同时用PCR方法检测菌株ESBLs相关基因 blaTEM blaCTX-M blaOXA blaSHV的携带情况,并对 blaCTX-M阳性基因进行测序分型。结果 两类不同来源菌株均对氨苄西林和氨苄西林-舒巴坦的耐药率较高,腹泻患者来源株对第三、四代头孢有不同程度的耐药。腹泻患者来源株中检出10株ESBLs阳性菌株,检出率16.39%(10/61),该类菌株全部为多重耐药。腹泻患者来源株 blaTEM blaCTX-M blaOXA基因检出率分别为55.74%(34/61)、16.39%(10/61)和19.67%(12/61);健康人员来源株 blaTEM blaOXA基因检出率分别为22.73%(5/22)和18.18%(4/22),未检出 blaCTX-M基因,两类菌株均未检出 blaSHV基因。10株 blaCTX-M基因阳性株测序表明 blaCTX-M-14基因型4株、 blaCTX-M-15 blaCTX-M-55基因型各3株。相关性分析表明 blaTEM基因与氨苄西林耐药表型具有较好的一致性( P<0.001, Ka=0.546), blaCTX-M基因与头孢噻肟和头孢吡肟耐药表型高度一致( P<0.001, Ka=1.000),与头孢他定( P<0.001, Ka=0.626)和氨曲南( P<0.001, Ka=0.668)一致性较好。结论 福建省鼠伤寒沙门菌对头孢菌素及ESBLs耐药主要由 blaCTX-M基因介导且ESBLs菌株多重耐药现象严重。
关键词: 鼠伤寒沙门菌; 耐药表型; 耐药基因; ESBLs
中图分类号:R378.2;R446.5 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2019)10-0944-06
Analysis on the relationship between β-lactam resistance phenotype and ESBLs resistance gene of Salmonella typhimurium in Fujian,China
QIU Yu-feng1, CHEN Jian-hui1, HUNG Meng-yin1, YANG Jin-song1, LIN Jie1, CHAN Ai-ping1,2
1.Fujian Center for Disease Control and Prenention, Fuzhou 350001, China
2.Fujian Provincial Key Laboratory of Zoonosis Disease Research, Fuzhou 350001, China
Abstract

To investigate the prevalence of β-lactam resistance and relationship between resistance genotype of ESBLs and resistance phenotype in Salmonella typhimurium strains in Fujian. The minimal inhibitory concentration (MIC) of 83 strains of Salmonella typhimurium against β-lactam and ESBLs strains against other 18 drugs was determined by broth dilution and the drug resistance rate was calculated. The gene of blaTEM, blaCTX-M, blaOXA and blaSHV related to ESBLs in Salmonella typhimurium strains detected by PCR, then the blaCTX-M genotype was further confirmed by sequenciny. The strains from healthy persons and diarrheal patients were shown in different resistant rate to lactam drugs,with higher rate in diarrheal patients than others. Different degrees of resistance to third-generation and fourth-generation cephalosporins were found in strains from various diarrheal patients. 10 ESBLs strains in Salmonella typhimurium were detected from diarrheal patients, the detection rate was 16.39% (10/61), and they’re all multi-drug resistance. The detection rate of blaTEM, blaCTX-M and blaOXA gene of Salmonella typhimurium in diarrhea patients were 55.74%, 12.2% and 19.67% respectively. The detection rate of blaTEM, blaCTX-M and blaOXA gene of Salmonella typhimurium in healthy persons were 55.74%, 12.2% and 0% respectively. No blaSHV gene was detected in both healthy persons and diarrhea patients. Among blaCTX-M genes positive strains, 4 belongs to blaCTX-M-14 genotype, 3 belongs to blaCTX-M-15 and blaCTX-M-55 genotypes respectively. Correlation analysis indicated that blaTEM genes was better consistency with ampicillin resistant phenotype( P<0.001, Ka=0.546). The blaCTX-M gene was highly consistency with the cefotaxime and cefepime resistant phenotypes( P<0.001, Ka=1.000), and blaCTX-M gene also was better consistency with ceftazidime( P<0.001, Ka=0.626) and aztreonam( P<0.001, Ka=0.668) resistant phenotypes. The resistance of Salmonella typhimurium to cephalosporins and ESBLs was mainly mediated by blaCTX-M gene and the multi-drug resistance of ESBLs strains is serious in Fujian now.

Key words: Salmonella typhimurium; antibiotic resistance phenotype; antibiotic resistance gene; ESBLs

沙门菌是引起感染性腹泻和食物中毒最常见的肠道病原菌之一, 在我国沙门菌所引起的食源性疾病和食物中毒中一直位居前列[1]。目前临床上常用于治疗沙门菌病的药物主要是喹诺酮类和第三代头孢菌素类, 第三代头孢菌素因其独特的药效学、副作用较少成为治疗沙门菌侵袭性感染和严重腹泻的首选药物。但是近年来随着临床抗生素的大量使用, 世界各地均出现了大量三代头孢类抗生素耐药的沙门菌株[2], 特别是产超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)多重耐药沙门菌株的出现, 给临床和食品卫生安全造成巨大压力。鼠伤寒沙门菌是沙门菌中数量最多, 耐药现象最严重的沙门菌血清型, 鼠伤寒沙门菌对氯霉素、氨苄西林或卡那霉素等均已产生很强的耐药性[3], 对喹诺酮和三代头孢也产生了一定的耐药。本文对分离自健康体检者和腹泻患者的鼠伤寒沙门菌进行了β -内酰胺类药物敏感性试验及ESBLs相关耐药基因检测, 初步分析了福建省鼠伤寒沙门菌对β -内酰胺类药物耐药表型和耐药基因型的相关性及ESBLs阳性菌的耐药情况, 为临床使用β -内酰胺类药物治疗沙门菌及沙门菌的防控工作提供一定的依据。

1 材料与方法
1.1 菌株来源

选取2012-2016年福建省福安和永安腹泻患者临床分离株61株, 以及2000-2015年本单位食品从业者健康体检分离株22株。所有83株实验菌株均经系统生化(API20E)及丹麦SSI血清鉴定为鼠伤寒沙门菌。

1.2 药敏实验方法

1.2.1 药敏测定 药敏板购自上海星佰生物技术有限公司, 实验步骤按照说明书进行, 具体包括: ① 挑取纯菌培养的新鲜菌落于2~3 mL 灭菌生理盐水中, 用0.5麦氏浊度比浊, 调制菌液浓度为1.5× 108 cfu/mL左右。② 取上述菌液60 μ L, 加入12 mL 营养肉汤培养液混匀进行稀释, 用12 通道微量移液器吸取稀释液100 μ L加入96 孔微量药敏板条, 阴性孔加100 μ L无菌营养肉汤。③将板条放入恒温培养箱中35 ℃培养18~20 h, 孵育后人工判读菌株对各药物的最低抑菌浓度(MIC), 并根据CLSI 2018《抗微生物药敏敏感性实验的执行标准》[4]判断相应的敏感、中度敏感和耐药结果。大肠埃希菌ATCC25922 作为药敏试验质控菌株确保结果的可靠性。

1.2.2 产超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)菌株测定 采用最小抑菌浓度(MIC)法, 包括初筛试验和确认试验, 使用头孢噻肟/头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶/头孢他啶-克拉维酸, 结果以加克拉维酸和不加克拉维酸MIC值相差3个对倍稀释度以上作为确认。

1.3 耐药基因PCR筛选

1.3.1 模板制备 采用热裂解法制备模板, 挑取单个纯菌培养的新鲜菌落于100 μ L 纯水中, 制成悬浊液。100 ℃煮沸10 min, 12 000 r/min离心5 min, 取上清作为反应模板, -20 ℃保存以备用。

1.3.2 PCR反应体系及条件 PCR反应总体积为20 μ L, 其中2× Taq PCR MasterMix (TaKaRa公司) 10 μ L, 上下游引物(10 μ mol/L ) 各1 μ L(引物由福州尚亚生物技术公司合成, 序列见表1), DNA 模板4 μ L, ddH2O 4 μ L。PCR反应程序: 94 ℃预变性5 min, 然后94 ℃ 30 s, 50~57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30~60 s, 进行33个循环, 最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳条带与目标预计大小一致的送福州尚亚生物技术有限公司测序验证。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析, 采用χ 2检验或Fisher确切概率法, 检验水准α 设为0.05。

表1 耐药目的基因及其PCR引物序列 Tab.1 Drug resistant gene and its PCR primer sequence
2 结 果
2.1 鼠伤寒沙门菌β -内酰胺类耐药情况

除健康体检者中分离的鼠伤寒沙门菌对头孢菌素类和腹泻患者中分离的菌株对亚安培南和美罗培南敏感外, 两类菌株对其他β -内酰胺类药物均有不同程度的耐药, 其中以氨苄西林和氨苄西林-舒巴坦的耐药率较高。不同种类抗生素中腹泻患者鼠伤寒分离株对头孢菌素类具有一定的耐药而健康体检者均敏感, 健康体检者菌株中分别检出1株亚胺培南和2株美罗培南耐药菌株, 而腹泻患者菌株没有检出。10种β -内酰胺类药物的耐药率在腹泻患者和健康体检者中比较, 差异不具有统计学意义(见表2)。

表2 鼠伤寒沙门菌β -内酰胺类药物耐药情况 Tab.2 Prevalence of β -lactamases antibiotic resistance in Salmonella typhimurium
2.2 鼠伤寒沙门菌超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)基因筛查

blaSHV基因未检出外, ESBLs基因中blaTEMblaCTX-MblaOXA基因总体检出率分别为46.99%(39/83)、12.05%(10/83)和19.28%(16/83)。其中61株分离自腹泻患者菌株的blaTEMblaCTX-MblaOXA基因检出率分别为55.74%(34/61)、19.39%(10/61)和19.67%(12/61); 22株分离自健康体检者菌株的blaTEMblaOXA基因检出率分别为22.73%(5/22)和18.18%(4/22), 未检出blaCTX-M基因(见表3)。腹泻患者和健康体检者blaTEM基因检出率比较, 差异具有统计学意义(χ 2=7.073, P=0.008), blaCTX-MblaOXA基因检出率比较, 差异无统计学意义。另外, 同时携带blaTEMblaCTX-M基因的菌株5株, 同时携带blaTEMblaOXA基因的菌株4株, 同时携带blaCTX-MblaOXA基因的菌株4株, 同时携带blaTEMblaCTX-MblaOXA 3种基因的菌株2株。

表3 鼠伤寒沙门菌β -内酰胺酶耐药基因检出情况 Tab.3 Detection of β -lactamase resistance genes in Salmonella typhimurium

通用引物检出的10株blaCTX-M基因阳性菌株, 分别用4组分组引物PCR扩增后阳性结果产物送测序, 序列在NCBI比对结果表明blaCTX-M-14基因型4株、blaCTX-M-15blaCTX-M-55基因型各3株。其中blaCTX-M-15blaCTX-M-55型属于I组, blaCTX-M-14型属于IV组。

2.3 腹泻患者鼠伤寒沙门菌耐药表型与耐药基因型分析

61株腹泻患者鼠伤寒沙门菌耐药表型与基因型分析发现blaTEM基因与氨苄西林和氨苄西林-舒巴坦的相关性较高, 一致性分析表明blaTEM基因与氨苄西林具有较好的一致性(P< 0.001, Ka=0.546), blaTEM基因与氨苄西林-舒巴坦的一致性较差(P=0.019, Ka=0.291), (见表4)。blaCTX-M基因与氨苄西林、苄西林-舒巴坦、头孢噻肟、头孢他定、啶氨曲南和头孢吡肟相关性较高, 一致性分析表明blaCTX-M基因与头孢噻肟和头孢吡肟具有很好的一致性(P< 0.001, Ka=1.000), 与头孢他定(P< 0.001, Ka=0.626)和氨曲南(P< 0.001, Ka=0.668)也有较好的一致性。blaOXA基因与氨苄西林、苄西林-舒巴坦和阿莫西林-克拉维酸具有一定的相关性, 但只有阿莫西林-克拉维酸具有较好的一致性(P=0.001, Ka=0.407)。

表4 腹泻患者鼠伤寒沙门菌耐药基因与表型关系 Tab.4 Correlation between drug resistance gene and phenotype of Salmonella typhimurium in diarrhea patients
2.4 ESBLs阳性菌株耐药特征及其耐药基因分析

83株鼠伤寒沙门菌检出ESBLs阳性10株, 全部来源于腹泻患者, 检出率16.39%。10株ESBLs阳性菌多重耐药均在8耐或以上, 其中一株对20种抗生素耐药(见表5)。10株ESBLs阳性菌对亚胺培南和美罗培南均敏感, 对氨苄西林、头孢唑林、头孢噻肟、头孢他啶氨曲南和头孢吡肟均耐药, 其他药物10株菌株各有不同的耐药谱(见表5)。10株检出的ESBLs菌株blaCTX-M基因全部阳性, 其中5株同时blaTEM基因阳性, 2株同时blaOXA基因阳性, blaCTX-M基因与ESBLs表型具有较好的一致性(P< 0.001, Ka=1.000)。

表5 ESBLs鼠伤寒沙门菌耐药谱特征 Tab.5 Antimicrobial resistance patterns of ESBLs in Salmonella typhimurium
3 讨 论

β -内酰胺类抗生素的使用为人类抵御细菌性感染做出了巨大贡献, 但随着抗生素的大量广泛使用, 细菌耐药特别是由产超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)介导的耐药日益严重[11]。产β -内酰胺酶是革兰阴性菌对β -内酰胺类抗菌药物耐药最重要的原因, 近年来陆续有报道人群中产生耐β -内酰胺类抗生素的沙门菌[12, 13]。本研究的药敏结果表明两类不同来源的鼠伤寒沙门菌对不同类型的β -内酰胺类抗生素均有一定的耐药, 特别是青霉素类的氨苄西林和氨苄西林-舒巴坦具有较高的耐药率。其中氨苄西林-舒巴坦高耐药率可能与β -内酰胺酶外的其他耐药机制有关。腹泻患者鼠伤寒已经对头孢菌素类也有了一定的耐药, 而健康体检鼠伤寒对头孢菌素比较敏感, 这可能与健康体检菌株来源年代比较久远以及临床头孢菌素的大量使用有关, 这与谭丽丽[14], 李柏生等[15]的研究结果相似。

沙门菌尤其是鼠伤寒沙门菌对β -内酰胺类药物耐药主要也是由于产生β -内酰胺酶特别是ESBLs所导致的, ESBLs常见的型别为blaTEM型、blaCTX-M型、blaOXA型和blaSHV型, 最近有研究认为, blaCTX-M型超广谱β -内酰胺酶已成为世界主要流行的ESBLs 分子表型[16], 而我国也以blaCTX-M型最为常见[17, 18]。本研究共检出blaTEMblaCTX-MblaOXA 3个型别, 未检出blaSHV型, 这与岳美娜[19]和魏金凤[20]的检出结果相似。3个耐药基因型与相关β -内酰胺类药物的耐药表型关系分析表明blaCTX-M基因主要介导头孢菌素类耐药, 而blaTEMblaOXA基因可能主要介导青霉素类耐药, 这与林兰等[21]和陆彦等[22]的观点相似。3个耐药基因型与ESBLs菌株的表型分析进一步说明我省鼠伤寒沙门菌的ESBLs主要也是由blaCTX-M基因介导, 由于本次检出的ESBLs菌株数量较少, 有待后续菌株更多时进一步分析。blaCTX-M型基因进一步测序分型表明其主要属于blaCTX-M-14型、blaCTX-M-15blaCTX-M-55型, 其中5株ESBLs阳性菌株3株属于blaCTX-M-55型, 2株属于blaCTX-M-15型, 这与国内近年blaCTX-M型β -内酰胺酶类型的流行情况相同[23]blaCTX-M基因可以通过依赖于质粒和转座子的水平传播和垂直克隆扩增两种方式, 这使blaCTX-M基因可以在不同细菌之间以及亲代与子代之间进行广泛传播, 而携带blaCTX-M基因的ESBLs 阳性菌株通常都带有多重耐药, 这给多重耐药菌的防控造成巨大压力。由于本研究监测地区局限及健康体检者来源株数量和年限有限, 还需加大监测范围和食品来源的菌株进行监测分析, 以提供更全面的监测资料。

综上所述, 福建省鼠伤寒沙门菌对β -内酰胺酶类药物中的青霉素类的耐药率较高, 对第三、四代头孢菌素类和碳青霉烯类的耐药率较低。但已检出ESBLs耐药基因blaTEM型、blaCTX-M型和blaOXA型且头孢菌素类和ESBLs阳性主要由传播方式多样的blaCTX-M型基因介导, 加上ESBLs菌株多耐药现象严重, 给防控工作带来巨大挑战。所以进一步研究沙门菌的耐药传播机制, 检测和监测其耐药性和耐药基因, 控制多重耐药的产生和扩散是未来工作的重点。

利益冲突:

引用本文格式:邱玉锋, 陈建辉, 黄梦颖, 等. 福建省鼠伤寒沙门菌β⁃内酰胺耐药表型及ESBLs耐药基因分析[J].中国人兽共患病学报, 2019, 35(10):944-949. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.096

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