小RNA病毒科基因组为单正链RNA, 大小为6.7~10.1 kb, 病毒颗粒呈球形, 无被膜包被, 病毒衣壳为二十面体结构^[1]。小RNA病毒基因组结构高度保守, 包括5'非编码区(5'-noncoding region, 5'-NCR)、开放阅读框、3'非编码区(3'-NCR)和3'端的polyA尾。5'-NCR包含多个RNA二级结构元件, 其中一个重要的二级结构元件是内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES), IRES三叶草结构与细胞蛋白质相互作用后招募核糖体, 启动病毒基因组的翻译。病毒基因组开放阅读框包括3个部分, 分别为P1区、P2区和P3区。P1区经翻译加工后形成结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4, 组成病毒的衣壳结构。P2区和P3区分别翻译加工形成非结构蛋白2A、2B、2C以及3A、3B、3C、3D。其中, 2A蛋白和3C蛋白分别参与病毒蛋白的剪切。3'-NCR和病毒的复制效率相关, 3'端的polyA尾参与病毒的复制和翻译^[2]。

小RNA病毒科包括35个属, 80个种^[1]。许多小RNA病毒可引起人和动物的脑部、心脏、肝脏、皮肤、胃肠道或上呼吸道疾病, 且目前无有效的疫苗用于治疗。常见的小RNA病毒包括肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV-71)、肠道病毒D68型(Enterovirus D68, EV-D68)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus, CV)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus, PV)、甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)、鼻病毒(Human rhinovirus, HRV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)、脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)等。EV-71、CV-A2、CV-A16、CV-A6和CV-A10可导致每年亚太国家数百万儿童患手足口病, 甚至引起更严重的临床症状, 如无菌性脑膜炎、急性迟缓性麻痹和神经呼吸系统综合征^[3]。CV-B4可引起新生儿心肌炎、Ⅰ 型糖尿病以及神经性疾病^[4]。EV-D68可引起世界范围内人类呼吸道疾病的流行^[5]。EMCV可引起动物脑炎、心肌炎为主要特征的急性传染病, FMDV可导致牛羊等动物口蹄疫的暴发流行, 对农业生产造成重大的经济损失^{[6, 7]}。

由于自身基因组的限制, 许多病毒依赖于宿主细胞来完成自身的复制。研究发现3C蛋白可裂解多种蛋白如poly-A结合蛋白(poly(A)-binding protein, PABP)、剪接因子脯氨酸和谷氨酰胺(Splicing factor proline and glutamine rich, SFPQ)、蛋白激酶R (protein kinase R, PKR)等。这些蛋白对病毒复制的影响是不同的。Sun等研究表明鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus, DHAV)的3C蛋白可裂解PABP蛋白中 Q367和G368之间的特异性位点, PABP蛋白被裂解为N端片段和C端片段, N端片段的存在利于DHAV的复制, 而C端片段则截然相反。C端片段的功能被细胞所抑制的机制尚不清楚^[11]。Kobayashi等研究结果显示EMCV的3C蛋白可裂解PABP蛋白中的Q437和G438之间的特异性位点, 导致一个N端45 kD的蛋白在病毒感染的细胞中累积, 促进病毒的复制。而当PABP的裂解受到干扰时, 病毒的复制明显受到抑制。因此, EMCV的3C蛋白可通过裂解PABP而促进病毒复制^[12]。此外, Dylan等研究显示HRV的3C/3CD 可裂解SFPQ, 而SFPQ水解片段的产生导致病毒复制以及病毒颗粒的增多^[13]。Chang等人发现EV-71感染宿主时, 3C通过裂解PKR增强了病毒的复制^[14]。Yao等发现槲皮素能够结合EV-71 3C蛋白的底物识别位点从而抑制其活性, 以及抑制宿主体内的病毒复制, 推断槲皮素抑制病毒复制的机制可能与3C蛋白的活性有关^[15]。

病毒感染宿主后可导致宿主细胞发生凋亡。研究表明小RNA病毒的3C蛋白可通过激活半胱天冬酶(caspase)活性, 裂解PinX1蛋白、真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor 4GI, eIF4GI)和受体相互作用蛋白激酶Ⅰ (Receptor-interacting protein kinase-1, RIPK1)调控细胞凋亡^[16]。Li等研究结果显示, 当神经细胞表达EV-71的3C蛋白时, 细胞以DNA片段化和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase, PARP)裂解的形式发生凋亡。其中, PARP裂解是caspase被激活的特异性标志, 说明3C蛋白可激活caspase诱导细胞凋亡^[17]。Song等发现EV-71感染宿主后, 3C蛋白可与caspase -8, 9相互作用而激活caspase-3诱发凋亡, 当3C失去水解活性后, 细胞caspase -8, 9活性明显降低, 细胞凋亡明显减少^[18]。Chau等发现CV-B3的3C蛋白裂解宿主细胞的eIF4GI, 导致细胞翻译过程受到抑制, 最终细胞发生形态改变, 皱缩等形式的凋亡^[19]。Li等研究表明当EV-71感染宿主细胞时, 3C蛋白能裂解PinX1蛋白中Q50-G51的特异性位 点, PinX1表达降低可使细胞DNA损伤, 增加细胞凋亡的易感性^[20]。与上述不同的是, Sarah等发现HRV-16的3C蛋白和caspase 8能裂解外在凋亡途径的关键中间体, 即RIPK1。二者裂解RIPK1的位点和功能不同, caspase 8裂解RIPK1产生一个38 kD的蛋白, 促进细胞发生早期凋亡, 而3C蛋白进一步裂解38 kD的蛋白产生C末端23 kD的片段, 抑制了凋亡的进一步发展^[21]。

病毒感染宿主后, 宿主启动固有免疫应答, 如产生干扰素(interferon, IFN)和免疫因子抵御感染, 而病毒通过一些策略逃避固有免疫应答的清除。研究表明3C蛋白通过抑制IFN的产生和核转录因子-κ B(NF-κ B)通路逃避免疫应答(图2)。Rui等研究发现CV-A6、CV-A16、和EV-D68等小RNA病毒感染细胞, 3C蛋白能与黑色素瘤分化相关基因(Melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)、维甲酸诱导基因-I(Retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)相互作用, 破坏了RIG-I 和MAD5与通路下游线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)的结合, 从而使MDA5、RIG-I介导的IFN I的产生受到抑制。3C蛋白还可抑制IRF3的磷酸化, 从而抑制IFN I的产生^[22]。Lei等研究表明EV-71的 3C蛋白与RIG-I的N端相互作用, 抑制RIG-I与MAVS形成复合物, 同时3C蛋白与β 干扰素TIR结构域衔接蛋白 (TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β , TRIF)相互作用后诱导TRIF裂解, 3C蛋白还可直接裂解IRF7 Q189和S190之间的位点, 最终上述现象都抑制IFN I产生^{[23, 24, 25]}。

NF-κ B通路对于宿主抵抗病毒感染也至关重要。病毒感染后宿主可通过激活NF-κ B通路, 刺激机体产生抗病毒相关的免疫因子与细胞因子。3C蛋白可通过裂解TRAF家族与转化生长因子激酶1(transforming growth factor-β activating kinase 1, TAK1)、TRIF、NF-κ B相关激活因子(TRAF family member-associated NF-κ B activator, TANK)抑制NF-κ B通路活性。Lei等研究发现EV-71的3C蛋白裂解TAK1、TAK1结合蛋白1(TAK1 binding protein 1, TAB1)、TAB2和TAB3, 破坏TAK1与TAB1、TAB2和TAB3形成复合物, 从而抑制TAK 1复合物对NF-κ B通路的激活和细胞因子的产生^[26]。Xiang等研究表明在EV-D68中, 作为半胱氨酸酶的3C蛋白可裂解TRIF的312和653位点, 而导致TRIF失活。失活的TRIF抑制对NF-κ B通路的激活, 最终抑制宿主的免疫应答^[27]。Huang等人研究EMCV发现3C蛋白能裂解TANK 蛋白的197和291谷氨酰胺位点。TANK即TRAF家族与NF-κ B相关激活因子(TRAF family member-associated NF-κ B activator, TANK), 是NF-κ B的关键调控因子。3C蛋白对TANK的裂解破坏这种抑制作用, 可抑制TRAF-6介导的NF-κ B通路的激活, 这是一种新的小RNA病毒逃避宿主免疫的策略^[28]。总而言之, 小RNA病毒通过3C蛋白逃避免疫应答较为复杂, 对3C蛋白的功能的探索有助于进一步阐明小RNA病毒的致病机制。

图2

Fig.2

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	图2 小RNA 病毒3C蛋白调控免疫应答的机制Fig.2 Mechanisms of picornavirus 3C protein regulate the immune response