引用本文
李智颖, 卢楠, 魏家玮, 唐弘, 吴宣艳, 庄稀尧, 徐蕾, 杨春, 何永林. Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(2): 131-137.
LI Zhi-ying, LU Nan, WEI Jia-wei, TANG Hong, WU Xuan-yan, ZHUANG Xi-yao, XU Lei, YANG Chun, HE Yong-lin. Effect and mechanism of Sigma E on drug sensitivity of Mycobacterium smegmatis to five antibiotics [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2019,35(2): 131-137.  
DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.233
Permissions
Copyright©2019, 中国人兽共患病学报
中国人兽共患病学报
Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究
李智颖, 卢楠, 魏家玮, 唐弘, 吴宣艳, 庄稀尧, 徐蕾, 杨春, 何永林
重庆医科大学基础医学院,重庆 400016
通讯作者:何永林,Email:heyonglinhyl@163.com; ORCID:0000-0002-6501-7685
基金资助: 重庆市科委项目(No.cstc2016jcyjA0196,No.cstc2016jcyjA0212,No.cstc2107jcyjAX0409);重庆市教委科学技术研究资助项目(No.KJ1500203)
摘要

目的 探讨Sigma E (sigma factor E,SigE)基因影响耻垢分枝杆菌对5种药物的敏感性及其作用机制研究。方法 PCR法扩增出耻垢分枝杆菌 sigE基因,克隆入质粒pMV261构建重组pMV261-SigE质粒,测序验证。重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测 SigE的表达。设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星和环丙沙星5种抗结核药物的敏感性。采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/mL的结核分枝杆菌复苏促进因子E (resuscitation-promoting factor E, RpfE)的7H9中静置培养2周,计数最大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制。结果 成功构建pMV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中表达。与对照组相比,表达SigE重组耻垢分枝杆菌组对异烟肼、利福平等5种药物的相对荧光百分比高,敏感性下降。5组抗生素中,异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组。结论 SigE可通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性。

关键词: Sigma E; 耻垢分枝杆菌; 药物敏感性; 持留
中图分类号:R378.91,Q786 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2019)02-0131-07
Effect and mechanism of Sigma E on drug sensitivity of Mycobacterium smegmatis to five antibiotics
LI Zhi-ying, LU Nan, WEI Jia-wei, TANG Hong, WU Xuan-yan, ZHUANG Xi-yao, XU Lei, YANG Chun, HE Yong-lin
The Basic Medicine College, Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China
Corresponding author: He Yong-lin, Email: heyonglinhyl@163.com
Fund:Supported by natural scientific foundation project of Chongqing Science and Technology Commission (cstc2016jcyjA0196,cstc2016jcyjA0212,cstc2017jcyjAX0409) and Scientific Research Project of Chongqing Municipal Education Commission (No.KJ1500203)
Abstract

The purpose of this study was to explore the effect of SigE on drug sensitivity of Mycobacterium smegmatis to five antibiotics (Isoniazid, Rifampin, Ethambutol, Levofloxacin, and Ciprofloxacin) and its’ mechanism. sigE gene was amplified and cloned into plasmid pMV261 to construct recombinant plasmid pMV261-SigE. The pMV261-SigE was transferred into M. smegmatis to construct recombinant M. smegmatis expressing SigE (pMV261-SigE/MS). Expression of sigE gene was detected by Western blot. M. smegmatis carrying only plasmid pMV261 (pMV261/MS) was used as control. We found that pMV261-SigE/MS group was more resistance to five antibiotics than control group by Resazurine Microtiter Assay and Colony-Forming Units (CFU). Further, the recombinant bacteria were induced into non-replication persistence phase treated with corresponding higher concentration antibiotic for 48 hours. Resuscitation-promoting factor E (RpfE) of M. tuberculosis was cloned and expressed to enhance resuscitation and growth of persistence phase bacteria. The bacteria in persistence phase were incubated in 7H9 containing 20 ng/mL of RpfE for 2 weeks. The bacterial CFU and most probable number (MPN) were measured to count resuscitation index (RI). RI was used to assess bacterial persistence ability which help us to understand the mechanism of SigE effecting drug sensitivity. Among five antibiotics, RI of pMV261-SigE/MS groups in Isoniazid and Ethambutol were significantly higher than that of the control group. So, SigE can influence the sensitivity of isoniazid and ethambutol by promoting M. smegmatis into the non-replication persistence phase.

Keyword: Sigma E; Mycobacterium smegmatis; drug susceptibility; persistence

SigE是结核分枝杆菌的重要毒力因子[1]。它在正常时不表达, 在低氧、营养缺乏、偏酸偏碱等不利环境下才转录表达, 参与细菌的应激反应, 维持细菌生存[2]。近年的研究发现, SigE与结核分枝杆菌的潜伏与持留密切相关, 灭活结核分枝杆菌的SigE会中断潜伏持留的细菌复苏过程[3]。抗生素对细菌也是一种应激, 但目前关于SigE参与抗生素应激、影响抗生素敏感性及机制的报道较少。SigE是否通过促进结核分枝杆菌进入持留状态, 从而影响抗生素的敏感性有待进一步研究。

本实验以耻垢分枝杆菌作为模式菌[4], 首先构建SigE表达的重组耻垢分枝杆菌, 采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法检测SigE表达菌对常用抗结核药物的敏感性。克隆表达结核分枝杆菌RpfE, 抗生素诱导细菌进入非复制持留状态, 利用RpfE促进持留菌的生长的作用, 通过测定复苏指数来了解持留对抗生素敏感性的影响机制。

1 材料与方法
1.1 质粒和菌株

pET-32a(+)质粒、 pMV261质粒、E.coli DH5和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, MS)由实验室保存, 结核分枝杆菌H37Rv灭活样本由重庆医科大学第一附属医院呼吸科提供。

1.2 主要试剂

通用型DNA纯化胶回收试剂盒、DNA marker从宝生物工程有限公司购买; 限制性内切酶XhoI、EcoRI等从Themo公司购买; KOD FX PCR 聚合酶买自 TOYOBO 公司; SDS-PAGE胶试剂盒从EpiZyme公司购买; 小鼠抗His单克隆抗体购自Bioworld Technology公司; DAB 显色剂于康为世纪生物科技有限公司购买; 异烟肼、利福平等抗生素买自北京睿博兴科生物技术有限公司。

1.3 引物设计和蛋白纯化

本实验相关的测序、引物合成由武汉擎科创新生物科技有限公提供; 结核分枝杆菌RpfE克隆部分由实验室完成, 纯化技术部分由通用生物科技有限公司完成。

1.4 sigE基因克隆与表达

设计上游下游引物扩增sigE基因(5'-ATAGAATTCCATCATCACCA TCACCATATGGAACACGACGACCGTCG-3', 5'- ACGAAGCTTTCAGGCGGACTGTGCGGTT-TC-3', 下划线为EcoR I、HindIII酶切位点, 斜体为6个组氨酸编码序列。用MS为模板, -80 ℃反复冻融两次, PCR扩增条件是:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 50 s, 共32次循环, 72 ℃ 15 min。经双酶切, 再将sigE基因连接到pMV261多克隆位点构建重组质粒(pMV261-SigE), 再双酶切、测序进行鉴定正确后, 电转仪调至2.7 kV、4 ms, pMV261-sigE重组质粒电转入MS感受态细菌中构建重组菌pMV261-sigE/MS, 重组菌经菌落PCR验证。同时构建只含pMV261的重组菌pMV261/MS用作实验对照。将细菌培养到OD600为0.8~1.0左右, 用42 ℃诱导3 h, 超声碎菌, Western blot检测SigE蛋白的表达。

1.5 rpf E基因克隆与表达

用MTB H37Rv灭活样本为模板, 设计引物(5'- CGTCTCGAGTTGAAGAACGCCCGTACGA-3', 5'-ATAGAATTCTCAGCCGCGGCGGCCGCAG -3'), 酶切位点分别为Xho I、EcoR I, PCR条件为:95 ℃ 8 min; 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共34次循环, 72 ℃ 10 mins; 双酶切后连接到pET-32a(+)质粒中构建pET-32a(+)-rpfE重组质粒, 酶切、测序鉴定正确。pET-32a(+)-rpfE转入BL21后经0.1 mol/L的IPTG诱导表达Rpf E, Western blot检测蛋白的表达。Rpf E蛋白的纯化复性由重庆通用生物科技有限公司完成。

1.6 微量滴定板药敏试验[5]

用灭菌蒸馏水配1%的刃天青储存液, 然后过滤除菌分装, 放4 ℃保存。取对数生长期的细菌7H9洗涤两次, 用培养基重悬调OD600为0.5, 此时菌液的浓度为4× 106 CFU/mL左右, 取100 μ L于96孔板。参考文献, 稀释所需药物浓度, 按100 μ L/孔的量加入以上已加入菌液的96孔板中。放37 ℃孵育24 h。取刃天青稀释成0.1%, 每孔加入20 μ L继续37 ℃孵育12 h, 在酶标仪上读取相对荧光值(激发535 nm和发射590 nm), 每个样本设定阳性对照(只加菌液不加抗生素), 阴性对照(只加7H9不加菌), 计数每孔的荧光值相对阳性对照孔的百分比。

1.7 测定细菌生存率

取对数生长期的细菌用7H9洗涤2次, 用培养基重悬调OD600为0.5。取500 μ L菌液, 500 μ L稀释好的抗生素于一管, 37 ℃、180 r/min培养12 h。分别在0 h、12 h, 取每个浓度的菌液100 μ L, 7H9液体培养基等倍梯度稀释, 每个稀释浓度取10 μ L滴到7H9固体平板上, 每次3个平行, 放于37 ℃培养箱3~5 d后取出, 菌落形成单位(Colony-Forming Units, CFU)计数, 得到两次CFU值, 计算细菌生存率比较药敏情况。

1.8 复苏指数的测定[6]

将细菌培养到对数生长期, 调OD600一致为0.5, 7H9抗性培养基洗涤菌体两次, 离心后用浓度分别为异烟肼100 μ g/mL、利福平25 μ g/mL、乙胺丁醇10 μ g/mL、左氧氟沙星10 μ g/mL, 环丙沙星10 μ g/mL 的7H9培养基重悬, 放入37 ℃、180 r/min摇床培养。24 h后8 000 r/min离心去上清, 用新鲜的7H9培养基重悬, 此时将重悬液平均分为两管, 一管用等倍梯度稀释至106, 取每个浓度的菌液10 μ L滴到7H9固体平板, 于37 ℃培养, 3~5 d后计数CFU; 另一管用加有终浓度为20 ng/mL RpfE的7H9等倍梯度稀释至1010, 每浓度取200 μ L于96孔板, 每浓度做3个平行, 96孔板边缘四周不加样, 用200 μ L培养基封板, 将平板在37 ℃下静态培养2周, 观察记录阳性细菌的孔, 查表得到最大可能数(Most probable number, MPN)值[7]。复苏潜力以log10(MPN)-log10(CFU)计算的复苏指数(Resuscitation Index, RI)来表示, 所涉及的7H9培养基都加有50 μ g/mL的卡拉霉素。

1.9 统计分析

IBM SPSS Statistics 19软件进行, 数据用均值± 标准差来表示, 采用t检验, 进行连续变量的统计学差异分析, P< 0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 sigE基因和rpfE基因的克隆构建和表达结果

用MS基因组作为模板, PCR扩增出大小约为744 bp的sigE基因条带(图1), 经EcoR I、HindIII酶切质粒pMV261-sigE, 可见约4 400 bp 、744 bp 大小的两个片段与预期一致(图2)。灭活的MTB H37Rv菌株基因为模板扩增出519 bp 左右的rpfE基因条带(图3), pET-32a(+)-rpfE经Xho I、EcoR I双酶切鉴定得到约519 bp, 5 880 bp的两片段与预期一致(图4)。

图1 sigE基因的PCR扩增产物
M: DNA Marker 10 000Fig.1 PCR product of sigE gene

图2 pMV261-SigE双酶切鉴定
M: DNA Marker 10 000Fig.2 pMV261-SigE identification with double enzyme digestion

图3 rpfE基因扩增条带
M: DNA Marker 10 000Fig.3 PCR product of rpfE gene

图4 pET-32a(+)-rpfE双酶切鉴定
M: DNA Marker 10 000Fig.4 pET-32a(+)-rpfE identification with double enzyme digestion

用抗His标签作为一抗(1: 4 000), Western blot检测pMV261-sigE重组垢分枝杆菌后SigE表达, 大小为32 kDa左右; pET-32a(+)-rpfE转入BL21后经0.5mmol/L IPTG诱导表达, 大小为40 kDa左右, 与预期一致(图5)。

图5 Western blot检测SigE和RpfE蛋白
注:M:蛋白maker; 1:纯化的RpfE蛋白; 2:pET-32a(+)-RpfE/BL21碎菌后的上清; 3、4:分别是pMV261-sigE/MS热诱导3 h碎菌液的上清、沉淀; 5、6:pMV261/MS热诱导3 h碎菌液的上清、沉淀Fig.5 Detection of SigE protein and RpfE protein by western blot

2.2 微量滴定板药敏试验

用刃天青作为指示剂, 读取不同浓度药物作用后的相对荧光值, 检测活菌数比例以此来监测药敏情况。与仅含pMV261空载的重组耻垢分枝杆菌对相比, pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼(isoniazid, INH), 利福平(rifampin, RIF)、乙胺丁醇(ethambutol, EMB)、左氧氟沙星(levofloxacin, LVFX)、环丙沙星(ciprofloxaci, CPFX)几种抗结核药物相对荧光值高(图6), 差异有统计学意义(P< 0.05)。

图6 刃天青微量滴定药敏试验
注:* P< 0.05, * * P< 0.01, * * * P< 0.001。Fig.6 Resazurine microtiter assay (REMA)

2.3 纯化的RpfE蛋白的活性鉴定

抗生素治疗分枝杆菌可诱导不同代谢形式的分枝杆菌产生[8], 我们用INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX处理耻垢分枝杆菌2天, 然后用添加或不添加RpfE蛋白比较耻垢分枝杆菌复苏情况, 使用CFU和MPN计数, 计算复苏指数评估复苏情况。显示7H9对照组未观察到有意义的复苏, 复苏指数都显示为负值; 而添加RpfE蛋白进行复苏的耻垢分枝杆菌复苏指数均为正值(图7), 差异有统计学意义(t(INH)=-17.00, P< 0.000 1; t(RIF)=-6.37, P< 0.01; t(EMB)=-3.71, P< 0.05; t(LVFX)=-4.57, P< 0.05), 表明有复苏活性, 能促进药物诱导的持留耻垢分枝杆菌生长。

图7 纯化的RpfE蛋白活性鉴定
注: * P< 0.05, * * P< 0.01, * * * * P< 0.0001。Fig.7 Activity identification of purified RpfE protein

2.4 SigE表达影响药物诱导的持留菌复苏

分别用高浓度的INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX处理pMV261-SigE/MS 和pMV261/MS 48 h, 药物诱导非复制持留菌产生, 然后在含有20 ng/mL RpfE蛋白的7H9促进复苏, 比较两组菌复苏情况, 计算复苏指数。与对照相比, INH、EMB两种药处理后SigE重组菌复苏指数是明显高于对照组(图8), 差异有统计学意义(t(INH)=5.82, P< 0.01; t(EMB)=11.08, P< 0.001)。

图8 SigE表达对持留的影响
注: * * P< 0.01, * * * P< 0.001。Fig.8 Effect of overexpression of SigE on drug resistance retention

2.5 细菌生存率检测

通过菌落计数SigE重组菌株、空载菌株药物作用前后生存率。与对照组相比, SigE表达组细菌对INH、RIF、EMB几种抗结核药物生存率高; 而LVFX、CPFX 2个药物在活菌计数计算生存率的药敏方法中没有表现出差异(图9)。

图9 生存率药敏试验
注: * P< 0.05, * * P< 0.01, * * * P< 0.001。Fig.9 Drug sensitivity test by comparing survival rates

3 讨论

由于在普通的培养条件下不表达SigE分子, 不利于实验效应的观察。本实验构建表达SigE的重组耻垢分枝杆菌的实验菌株和空质粒重组耻垢分枝杆菌的对照菌株, 以便突显SigE分子的效应。在研究SigE对抗结核药物的敏感性检测中采用刃天青微量滴定板和菌落计数计算存活率两种方法来进行药敏试验。刃天青是一种氧化还原指示剂, 活性细菌可将其还原, 染料由深蓝色变为粉红色[9], 粉红色的刃天青能够产生很高的荧光信号, 无活性的细菌因无代谢能力, 所以不具有还原性, 不被还原的深蓝色刃天青不能产生荧光信号, 基于这样的原理, 用酶标仪记录 535Ex/590Em荧光值可以用于检测活性细菌[5]。刃天青微量滴定板法操作简便、快速、成本低廉和结果准确[10]。结果显示INH、RIF、EMB 3种不同药物浓度作用后两种方法结果一致, SigE表达菌比空质粒对照菌相对荧光值高, 同时细菌生存率高, 即细菌对药物表现出更强的耐受性; 氟喹诺酮类的LVFX、CPFX 2个二线抗结核药物表现出SigE表达菌比对照菌相对荧光值高, 然而菌落计数计算生存率的药敏方法没有显示出具有统计学意义的差异。两种方法不一致的具体原因还不明确, 我们分析首先可能是两种方法存在差异, 前一种我们评估细菌的活力(在液体培养氧化的能力), 而在后一种评估的活细菌的数量; 再者, 细菌暴露于各种压力条件下可能产生具有不同培养要求[11]和生物化学特性[8]的异质分枝杆菌种群。

根据已有的研究结果, 潜伏在肉芽肿细胞或巨噬细胞内的结核分枝杆菌SigE高表达, 这提示SigE与结核分枝杆菌的潜伏和持留密切相关[12]。当结核分枝杆菌在体外缺氧或饥饿条件下的研究表明, 会启动SigE的转录表达, 促使结核分枝杆菌可以进入非复制持留状态[13]。因此, 我们推测SigE是否通过促进细菌持留而使细菌的敏感性降低。实际上, 结核分枝杆菌处于非复制的持留状态对药物的失去敏感性已被广泛关注, 预防或阻止分枝杆菌进入非复制的持留状态成为研究的新型治疗策略和靶点[14]。由于结核分枝杆菌复苏促进因子(Rpf)可以促进非复制的持留菌复苏生长[15], 我们构建了重组的有活性RpfE因子来观察SigE诱导持留菌形成的情况。在抗生素处理后的SigE表达菌在含RpfE因子的培养基中观察到最大可能数MPN包括持留菌在内的所有活菌, 在不含RpfE因子培养基的菌落CFU则只含活菌不含持留菌, 两种之差表现为复苏指数RI反应持留菌的多少。实验采用INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX几种抗生素作用于SigE表达菌, 观察到INH、EMB两种药处理后SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数是明显高于对照组, 而其他几种抗生素的复苏指数与对照组无明显差异。不同抗生素处理出现持留菌不同的结果, 我们推测可能与SigE的作用特点和抗生素的作用机制有关。SigE属于胞浆外选择性σ 因子家族, 该家族因子主要对胞外刺激信号或作用于细胞表面应激信号有关[16], INH和EMB都是作用于细胞壁合成的抗结核药物[17]。我们研究的结果与Pendzich和Pisu等观察到的结果类似[5]。

近年来耐药结核病不断涌现[18], 增加了结核病控制和治疗的难度[19]。通过本实验, 我们发现SigE的表达可促进细菌进入持留状态影响INH和EMB作用的敏感性, 这可能是影响作用分枝杆菌细胞壁表面成分合成类抗结核药物敏感性的重要原因。虽然耻垢分枝杆菌是结核分枝杆菌的模式菌, 但必定不是致病菌, 所以有必要后续在结核分枝杆菌中验证SigE是否也有相同的作用。此外, 结核分枝杆菌持留涉及的信号通路复杂, 且SigE是一个转录调节因子, 那么它影响细菌持留的具体通路是怎样的, 有待进一步深入研究, 有利于抗持留菌新药的开发。

利益冲突:无

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Bansal R, Anil KV, Sevalkar RR, et al. Mycobacterium tuberculosis virulence-regulator PhoP interacts with alternative sigma factor SigE during acid-stress response[J]. Mol Microbiol, 2017, 104(3): 400-411. DOI: DOI:10.1111/mmi.13635.Epub2017Feb24 [本文引用:1]
[2] Manganelli R. Sigma Factors: Key Molecules in Mycobacterium tuberculosis physiology and virulence[J]. Microbiol Spectr, 2014, 2(1): MGM2-0007-2013. DOI: DOI:10.1128/microbiolspec.MGM2-0007-2013 [本文引用:1]
[3] Du P, Sohaskey CD, Shi L. Transcriptional and physiological changes during Mycobacterium tuberculosis reactivation from non-replicating persistence[J]. Front Microbiol, 2016, 7: 1346. DOI: DOI:10.3389/fmicb.2016.01346 [本文引用:1]
[4] 金琨琪, 施晓晨, 张巧丽, 等. 耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因的敲除对其生物被膜产量的影响[J]. 中国兽医学报. 2015, 35(3): 378-382. DOI: DOI:10.16303/j.cnki.1005-4545.2015.03.005 [本文引用:1]
[5] Pisu D, Provvedi R, Espinosa DM, et al. The alternative sigma factors SigE and SigB are involved in tolerance and persistence to antitubercular drugs[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2017, 61(12): e01596-17. DOI: DOI:10.1128/AAC.01596-17 [本文引用:3]
[6] Loraine J, Pu F, Turapov O, et al. Development of an in vitro assay for detection of drug induced Resuscitation-promoting factor dependent mycobacteria[J]. Antimicrob Agents Chemother. 2016, 60(10): 6227-6233. DOI: DOI:10.1128/AAC.00518-16 [本文引用:1]
[7] Sutton S. The most probable number method and its uses in enumeration, qualification, and validation[J]. J Validation Technol, 2010, 16(3) 35-38. DOI: DOI:10.1097/RLI.0b013e318234e75b [本文引用:1]
[8] Manina G, Dhar N, Mckinney JD. Stress and host immunity amplify Mycobacterium tuberculosis phenotypic heterogeneity and induce nongrowing metabolically active forms[J]. Cell Host & Microbe, 2015, 17(1): 32-46. DOI: DOI:10.1016/j.chom.2014.11.016 [本文引用:2]
[9] Gallo JF, Jmw P, Saraceni CP, et al. Evaluation of the BACTEC MGIT 960 system and the resazurin microtiter assay for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to second-line drugs[J]. J Microbiol Meth, 2017, 139: 168-171. DOI: DOI:10.1016/j.mimet.2017.06.007 [本文引用:1]
[10] Pina RZ, Caleffi-Ferracioli KR, Campanerut-Sá PA, et al. Pyrazinamide susceptibility testing in Mycobacterium tuberculosis using the fast resazurin microtiter assay plate[J]. Int J Tuber Lung Dis, 2016, 20(11): 1535-1538. DOI: DOI:10.5588/ijtld.16.0304 [本文引用:1]
[11] Turapov O, Glenn S, Kana B, et al. The in vivo environment accelerates generation of resuscitation-promoting factor-dependent mycobacteria[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2014, 190(12): 1455-1457. DOI: DOI:10.1164/rccm.201407-1289LE [本文引用:1]
[12] Datta P, Shi L, Bibi N, et al. Regulation of central metabolism genes of Mycobacterium tuberculosis by parallel feed-forward loops controlled by Sigma factor E (σE)[J]. J Bacteriol, 2011, 193(5): 1154. DOI: DOI:10.1128/JB.00459-10 [本文引用:1]
[13] Gengenbacher M, Rao SP, Pethe K, et al. Nutrient-starved, non-replicating Mycobacterium tuberculosis requires respiration, ATP synthase and isocitrate lyase for maintenance of ATP homeostasis and viability[J]. Microbiol, 2010, 156(Pt 1): 81. DOI: DOI:10.1099/mic.0.033084-0 [本文引用:1]
[14] Baker JJ, Abramovitch RB. Genetic and metabolic regulation of Mycobacterium tuberculosis acid growth arrest[J]. Sci Rep, 2017, 8(1): 4168. DOI: DOI:10.1038/s41598-018-22343-4 [本文引用:1]
[15] Uhía I, Krishnan N, Robertson BD. Characterising resuscitation promoting factor fluorescent-fusions in mycobacteria[J]. Bmc Microbiol, 2018, 18(1): 30. DOI: DOI:10.1186/s12866-018-1165-0 [本文引用:1]
[16] Gottesman S. Stress Reduction, Bacterial Style[J]. J Bacteriol, 2017, 199(20): e00433-17. DOI: DOI:10.1128/JB.00433-17 [本文引用:1]
[17] Dookie N, Rambaran S, Padayatchi N, et al. Evolution of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: a review on the molecular determinants of resistance and implications for personalized care[J]. J Antimicrob Chemother. 2018, 73(5): 1138-1151. DOI: DOI:10.1093/jac/dkx506 [本文引用:1]
[18] Carette X, Platig J, Young DC, et al. Multisystem analysis of Mycobacterium tuberculosis reveals kinase-dependent remodeling of the pathogen-environment interface[J]. Mbio, 2018, 9(2): e02333-02317. DOI: DOI:10.1128/mBio.02333-17 [本文引用:1]
[19] 魏淑贞, 赵永, 梁庆福, 等. 福建省耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物表型耐药与 gyrA基因突变特征分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2016, 32(10): 876-879. DOI: DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.005 [本文引用:1]