福氏志贺菌PFGE和MLVA分子分型方法的应用与评价
杨劲松1,2, 陈爱平1,2, 陈建辉1, 罗朝晨1, 林杰1, 郑恩惠1
1.福建省疾病预防控制中心,福州 350001
2.福建省人兽共患病研究重点实验室,福州 350001

第一作者:杨劲松,Email:sunuo 2001@163.com;ORCID:0000-0002-7260-1337

摘要

目的 比较和评价脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)和多位点可变数目串联重复序列分析技术(MLVA)在福建地区福氏志贺菌研究中的应用。方法 运用PFGE和MLVA技术对43株分离自福建地区的福氏志贺菌进行分子分型,结合流行病学资料分析比较分型效果。结果 43株福氏志贺菌经PFGE分型后相似度在61.70%100%之间,按照100%的相似水平可分为36个PFGE型,没有优势PFGE型别,分辨系数为0.992 2,存在4个优势簇(G1G4);福氏志贺菌经MLVA分型后,按照100%的相似水平可分为41个MLVA型别,遗传关联度介于6.207%~100%之间,没有优势MLVA型别,分辨系数为0.997 8,得到5个优势基因群(Cluster15)。在最小生成树上,部分F4c与Fx亲缘关系较近,并都由F2a和F1a分支而来,表现出一定的遗传关系。结论 两种分型方法的分辨率基本一致,PFGE分型结果与流行病学背景资料及血清型别基本吻合,MLVA在分析菌株种群进化关系上更具优势。

关键词: 福氏志贺菌; PFGE; MLVA; 遗传进化
中图分类号:R378.21 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2019)03-0245-05
Application and assessment of PFGE and MLVA molecular typing on Shigella flexneri
YANG Jin-song1,2, CHEN Ai-ping1,2, CHEN Jian-hui1, LUO Chao-chen1, LIN Jie1, ZHENG En-hui1
1.Fujian Center for Disease Control and Prevention,Fuzhou 350001,China
2.Key Laboratory of Fujian Province for Zoonotic Disease Research,Fuzhou 350001,China
Abstract

In order to compare and evaluate pulse field gel electrophoresis (PFGE) and multiple locus VNTRs analysis (MLVA) on the molecular typing of Shigella flexneri in Fujian Province. Totally 43 strains of Shigella flexneri were genotyped by PFGE and MLVA, and the results were compared with epidemiological data. The results indicated that the similarity coefficient among the 43 isolates was from 61.70 %to 100% by PFGE with D index value of 0.9922, which could be divided into 36 PFGE types according to the 100% similarity with no advantage one, but there were 4 dominant groups (G1-G4); while MLVA produced 41 types, the similarity coefficient among which was 6.207%-100% with D index value of 0.9978 and no advantage type, but there were also 5 dominant clusters. In the minimum spanning tree, some strains of F4c were close to Fx, and they all came from F2a and F1a, which show a certain genetic relationship. All the results suggest the discriminatory ability of the two methods is roughly the same. The typing result of PFGE is consistent with the epidemiological data and serotype, and MLVA has an advantage in analyzing the evolutionary relationship of bacterial strains.

Keyword: Shigella flexneri; pulse field gel electrophoresis; multiple locus VNTRs analysis; genetic evolution

细菌性痢疾(菌痢)是由志贺菌属感染引起的一种常见肠道传染病。全球每年发病人次估计达1.65亿, 死亡约110.6万, 010岁儿童占总发病数的40%以上, 死亡人数69%为5岁以下的儿童。因腹泻死亡病例中约有75%是由志贺菌感染引起的, 发展中国家发病率较高, 从近年的监测数据表明我国菌痢的总体发病率虽有下降的趋势, 但菌痢的发病率仍显著高于发达国家[1, 2]。2012年国家级监测点病原监测结果显示:我国以福氏志贺菌为主(69.93%), 宋内志贺菌次之(30.07%), 未分离到痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌; 福氏志贺菌以福氏2a为主(53.33%), 菌型分布存在地区差异[3], 前者仍是我国菌痢的主要血清型。随着分子生物学的不断发展, 多种分子分型方法已应用于细菌性病原菌的分型研究中, 如PFGE、MLVA、MLST等已广泛应用于传染病爆发溯源及流行监测。本研究选择2005-2015 年分离自福建地区的43 株福氏志贺菌, 应用PFGE和MLVA两种方法进行分子分型研究, 对两种技术在福氏志贺菌的分型能力和应用价值进行比较和评价, 现将结果报告如下。

1 材料与方法
1.1 菌株来源

2005-2015年福建地区菌痢监测中收集到的福氏志贺菌43 株, 均为历年肠道门诊散发病例中分离的菌株。血清型分布:F4c 17株、F2a 14株、F1a 5株、F2b2株、Fx4株、Fy1株。所有菌株均经生化反应及血清学鉴定后保存。

1.2 主要试剂和仪器

营养琼脂购自北京陆桥公司, NotⅠ 和XbaⅠ 限制性内切酶购自NEB公司, Seakem Gold Agarose PFGE 级琼脂糖购自Cam Brex公司, 蛋白酶K购自Merck公司, 引物由上海生工公司合成, PCR Premix反应体系购自TaKaRa公司, 所有试剂均在有效期内。

Bio Rad公司的CHEF MAPPER脉冲场凝胶电泳仪和Gel Doc XR+ 凝胶成像系统, 法国BioMerieux Vitek公司的DENSIMAT细菌浊度仪。Life Technologies公司的ProFlex PCR system, 中国台湾光鼎公司BiOptic Qsep100毛细管电泳仪。

1.3 方法

1.3.1 脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)分型 根据 PulseNet (美国CDC)网络实验室推荐的福氏志贺菌标准方法并予以条件优化[4]进行PFGE试验, 并做部分优化。采用NotI限制性内切酶(30U)对实验菌株进行酶切, 标准菌株H9812采用XbaI限制性内切酶(40U)酶切, 主要实验参数为电压梯度6 V/cm, 电泳夹角120° , 电泳温度14 ℃。电泳参数:5 s~35 s, 18.5 h。

1.3.2 多位点可变数目串联重复序列分型(MLVA) 挑取在营养琼脂培养基上培养18~24 h的菌落, 置于200 μ L超纯水中重悬, 煮沸10 min后, 13 000 r/min 离心10 min, 取上清作为PCR扩增反应的DNA模板。根据文献[5]选取8个VNTR位点进行PCR检测, 采用20 μ L反应体系, 包括Premix 10 μ L、上、下游引物(20 μ mol/L)各0.4 μ L、模板2 μ L、超纯水9.2 μ L。反应条件:预变性94 ℃ 5 min, 变性94 ℃ 30 s, 退火55 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 45 s, 30个循环, 最后72 ℃ 10 min。应用毛细管电泳读取PCR产物大小, 根据福氏志贺菌301标准株的基因组(GenBank Accession No.AE005674)作为参照, 计算每株菌各VNTR位点的重复单位数, 每个菌株8个位点的重复数组成一组数字编码作为MLVA等位基因类型。根据不同菌株VNTR的多态性进行分型分析。见表1

表1 福氏志贺菌8个VNTR位点信息 Tab.1 Information of 8 VNTR sites of Shigella flexneri

利用毛细管电泳得到各引物扩增片段的长度后, 每个位点选择两株菌进行序列测定, 将测序结果验证毛细管电泳后换算得到的重复数。

1.3.3 MLVA与PFGE数据分析 使用BioNumerics(Version 6.6)软件处理PFGE图谱, 选择Dice相似性系数和UPGMA方法进行聚类, tolerance设置为1.5%。对MLVA数组采用Categorical(Values)相似性系数和UPGMA方法构建聚类图和最小生成树。

1.3.4 Simpson分辨系数(index of diversity, DI) 两种方法的分辨能力采用基于Simpson的分辨系数(index of diversity, DI), 即D 值来表示[6], 计算公式为:

D=1-1N(N-1)j=1snj(nj-1)

注:N 代表聚类菌株总数, s为型别数, nj为某一型别的菌株数。

2 结 果
2.1 PFGE分析

2.1.1 PFGE分型结果 43株福氏志贺菌用NotⅠ 酶切并进行脉冲场电泳后, DNA片段可得到较好地分离, 可见大小不一的电泳条带, 菌株条带数目在1222之间。利用Bionumerics软件的Cluster analysis模块进行聚类分析, 菌株间条带相似度在61.70%100%之间; 按照100%的相似度可将菌株酶切图谱分为36个PFGE型, 各型包含12株菌不等, 记为P1P36。各血清型菌株均无优势的PFGE型别。见图1。

图1 43株福氏志贺菌PFGE分型聚类图Fig.1 Cluster map for PFGE type among 43 strains of Shigella flexneri

2.1.2 优势PFGE簇的特征 根据聚类结果部分菌株酶切图谱可划为同一个簇, 得到4个主要的PFGE簇:G1、G2、G3和G4, 分别有4种(4株)、10种(15株)、6种(7株)和4种(4株)PFGE型别, 4簇共占到福氏菌株总数以及PFGE 型别总数的69.77%(30/43)和66.67%(24/36)。G1和G3簇以F2a为主, 占各到菌株数的100%(4/4)和71.43%(5/7); G2和G4簇以F4c为主, 各占到菌株数的73.33%(11/15)和100%(4/4)。

2.1.3 PFGE分型与血清分型的关系 不同血清型的菌株基本可分为不同的PFGE型别, 也有极少数不同血清型归为同一PFGE型别, 如P7型中包含1株F4c和1株Fx。F2a血清型菌株有11株归于G1和G2簇, 有3株归于其它型别; F4c菌株有15株归于G2和G4簇, 有2株归于其它型别。

2.2 MLVA分析

2.2.1 MLVA分型结果 经聚类分析后, 按照100%的遗传关联度可将43株菌株分为41个MLVA型别, 记作MT 1MT 41, 遗传关联度介于6.207%~100%之间, 各型别包含12株菌, 表现出明显的遗传多样性。43株福氏志贺菌根据聚类结果可归为5个基因群(Cluster15), 各基因群菌株血清型并不均一, 每个群都含有不同的血清型, Cluster1内菌株存在较大多态性。但群内也存在优势的血清型别, 其中Cluster 1 基因群以F2a为主, 占到菌株总数的62.5%(10/16); Cluster 2和Cluster 4以F4c为主, 分别占到菌株总数的60.0%(3/5)和70.0%(7/10)。见图2。

图2 43株福氏志贺菌MLVA分型聚类图Fig.2 Cluster map for MLVA type among 43 strains of Shigella flexneri

2.2.2 最小生成树 利用软件构建最小生成树, 大部分F1a和F2a的型别位于最小生成树的主干上, 部分F4c与Fx亲缘关系较近, 二者大多位于末端分支上, 并都由F2a和F1a分支而来, 表现出一定的遗传关系; F4c内部各菌株之间也表现出远近不等的亲缘关系。见图3。

图3 43株福氏志贺菌MLVA分型最小生成树(MST)
注:线条的粗细和长短表示基因遗传距离的远近, 粗线条和短线条表明遗传距离更近; 细线条和长线条表明遗传距离更远; 圆圈大小表示相同型别含有菌株的多少。
Fig.3 Minimum spanning tree of 43 strains of Shigella flexneri

2.3 PFGE与MLVA分型的比较

43株福氏志贺菌PFGE和MLVA分型方法的多态性指数D值分别为0.992 2和0.997 8。PFGE聚类图可分为G14 4个PFGE簇, MLVA聚类图可分为Cluster15 5个基因群, G1和G3中的F2a血清型分别包含4个和6个PFGE型, 而在MLVA分型中则分为Cluster1(7个型)、Cluster3(2个型); G2和G4中的F4c血清型分别包含8个和4个PFGE型, 而在MLVA分型中则分为Cluster1(2个型)、Cluster2(3个型)、Cluster3(2个型)和Cluster4(7个型)。

部分菌株具有相同的MLVA型别和相同的PFGE型别, 如P10型、P36型分别与MT29型、MT40型所含菌株对应, 但也存在部分菌株具有相同的PFGE型别, 却分为不同的MLVA型别, 如P7、P8、P11、P13和P19所含菌株被分为不同的MLVA型别。

3 讨 论

福氏志贺菌血清型种类较多, 至少可被分为20种[7], 近年来, 我省出现一些新发血清型, 如F4c、Fx、Fy[8]等, 并且研究表明我省分离的大部分F4c志贺菌具有较强的毒力特征, 某一克隆群的F4c菌有可能逐步演变成为我省主要且稳定的福氏志贺菌流行菌株[9]。因此应用新的分型方法研究志贺菌尤其是新发福氏血清型在分子水平的菌型分布, 优势菌型的相似性与亲缘关系, 逐步建立志贺菌分子识别数据库已成为志贺菌疫情防控的迫切需要。PFGE对细菌的分型能力强、易于标准化, 可以有效判断菌株之间的亲缘关系远近, 被誉为细菌分子分型技术的“ 金标准” 。多位点的可变串联重复(MLVA)分析是近年发展起来的以PCR技术为基础的分子分型方法, 由于其操作简单、快速、可重复性好、分辨率高并且不同的实验室之间结果易于比较等优点, 已应用于多种细菌的分子分型[10]。辛普森指数可作为评价某种分型方法分辨率高低的指标, 当辛普森指数D值大于0.9即可认为该分型方法可信和具有较好的分辨能力[11]。本研究运用PFGE技术对43株福氏志贺菌进行分子分型, 得到36个PFGE型, 不同血清型菌株被分为不同的PFGE型别, D值为0.992 2; 运用MLVA技术把43株福氏志贺菌分为41个MLVA型别, D值为0.997 8。从分型效果来看, PFGE和MLVA都可以在血清分型的基础上将菌株进一步细分, 如PFGE和MLVA将14株F2a分别分为12个型和14个型, 将17株F4c分别分为13个型和15个型, 显示出较好的分型能力, MLVA分辨力略高于PFGE, 二者均可应用于福氏志贺菌的分型研究。

两种分子分型结果均显示福氏志贺菌呈现基因组的多态性, 一方面同研究菌株为散发病例分离株相吻合, 另一方面说明在福建省腹泻人群中流行的福氏志贺菌在流行传播过程中存在着基因变异现象, 形成基因组流行形式的多样性。进一步的聚类表明两种分子分型都有优势的型别簇或者基因群, PFGE聚类中可出现 4个优势簇G1-G4, 结合流行病学资料分析, 优势簇分类结果与福氏志贺菌的血清型别有比较好的重叠性, 并在时间和地区分布上呈现出一定规律。G1簇全部为分离自2010、2013和2014年芗城地区的F2a菌株, G3簇也以2009-2014年芗城F2a分离株为主; G2和G4簇各以2007-2010年和2005-2007年分离的F4c为主, 没有明显的优势地区分布, 说明福氏志贺菌在流行传播过程中存在不同年代、地区优势的克隆分化群, 某些血清型别可能演变为具有一定流行能力的菌株, PFGE在研究福氏志贺菌流行趋势和能力方面具有一定应用价值。MLVA聚类中各基因群菌株血清型并不均一, 每个群都含有不同的血清型, Cluster1菌株存在较大多态性, 其它各群血清多态性也比较明显; 各优势基因群中菌株分离年份和地区没有特殊规律, 其原因可能是在未发生爆发流行的情况下, 外环境选择性压力导致菌株自身变异度较高, 菌株可变串联重复基序数目波动很大, 因而MLVA多态性明显。

PFGE分子分型针对的是全细菌的基因组, 对于同一次暴发流行的菌株, 理论上菌株的基因组应该表现为100%的相似度, 但是PFGE无法检测基因组结构和序列差异的能力, 所以不能阐明两个带型不同的菌株之间是否存在进化关系。另外, PFGE分型中, Fx和Fy与其它血清型指纹图谱的相似度较低, 而MLVA最小生成树则揭示F4c、Fx与F2a、F1a具有一定的遗传进化关系, 表明MLVA方法在分析菌株的亲缘进化关系方面具有一定的优势, 提示我们可以结合MLVA分型与传统的血清学分型来分析菌型进化变迁的规律和发现新的菌株。虽然PFGE广泛应用于暴发疫情中病原菌的溯源和调查处置, 但PFGE试验操作繁琐、耗费时间、成本较高, 对结果的分析有时需要人工判断。本研究MLVA试验中采用8个VNTR位点, 并优化了PCR扩增条件, 操作简便, 结果客观, 可用于实验室间数据的比对, 在分辨率上也略优于PFGE技术, 在福氏志贺菌的分子分型和揭示菌株种群进化的内在关系上有较高的应用价值。

根据菌株的流行病学背景资料, 本次研究选取的菌株大都来自散发病例, 缺乏来自暴发流行及分离自食品的菌株, 对两种分型方法在志贺菌暴发流行的分型及溯源调查的能力尚待进一步评价; 另外还需增加各血清型菌株及分离地区的数量以完善两种分型方法的评价。在今后的监测工作中, 可将PFGE和MLVA分型相结合, 不仅能在早期监测到病原菌的爆发疫情, 为及时启动流行病学调查和开展防控措施提供依据, 还能有助于追踪志贺菌亚型的流行趋势, 分析优势菌群及菌株的遗传多态性, 及时发现新亚型的出现。

利益冲突:无

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 卫生部疾病预防控制局. 痢疾防治手册[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2006: 9. [本文引用:1]
[2] 中华人民共和国卫生部. 全国细菌性痢疾监测方案(试行)[S]. 2005. [本文引用:1]
[3] 常昭瑞, 孙强正, 裴迎新, . 2012 年中国大陆地区细菌性痢疾疫情特点与监测结果分析[J]. 疾病监测, 2014, 29(7): 528-532. DOI: DOI:10.3784/j.issn.1003-9961.2014.07.006 [本文引用:1]
[4] Ribot EM, Fair MA, Gautom R, et al. Stand ardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157: H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet[J]. Foodborne Pathog Dis. 2006, 3(1): 59-67. DOI: DOI:10.1089/fpd.2006.3.59 [本文引用:1]
[5] Wang YW, Watanabe H, Phung DC, et al. Multilocus variable-number tand em repeat analysis for molecular typing and phylogenetic analysis of Shigella flexneri[J]. BMC Microbiol, 2009, 9: 278. DOI: DOI:10.1186/1471-2180-9-278 [本文引用:1]
[6] Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of simpson’s index of diversity[J]. J Clin Microbiol. 1988, 26(11): 2465-6. [本文引用:1]
[7] Sun Q, Lan R, Wang J, et al. Identification and characterization of a novel Shigella flexneri serotype Yv in China[J]. PLoS One, 2013, 8(7): e70238. DOI: DOI:10.1371/journal.pone.0070238 [本文引用:1]
[8] 陈爱平, 李海丹, 熊美琴, . 福建省2005-2010年志贺菌分离株的毒力基因分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2012, 28(6): 583-586. DOI: DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2012.06.014 [本文引用:1]
[9] 陈爱平, 杨劲松, 李海丹, . 福建省福氏志贺菌4c亚型的分子特征分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2012, 28(12): 1191-1194. DOI: DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2012.12.007 [本文引用:1]
[10] Lindstedt BA. Multiple-locus variable number tand em repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria[J]. Electrophoresis, 2005, 26(13): 2567-82. DOI: DOI:10.1002/elps.200500096 [本文引用:1]
[11] Al Dahouk S, Flèche PL, Nöckler K, et al. Evaluation of Brucella MLVA typing for human brucellosis[J]. J Microbiol Methods, 2007, 69(1): 137-45. DOI: DOI:10.1016/j.mimet.2006.12.015 [本文引用:1]