引用本文
苏瑞景, 董辉, 朱瑶, 杨玉荣. IFN-γ基因敲除小鼠的繁育及其对TgCatCHn4弓形虫的感染研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(3): 250-253.
SU Rui-jing, DONG Hui, ZHU Yao, YANG Yu-rong. Reproduction of IFN-γ knockout mice and infection of TgCatCHn4 strain of Toxoplasma gondii [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2019,35(3): 250-253.  
DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.003
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中国人兽共患病学报
IFN-γ基因敲除小鼠的繁育及其对TgCatCHn4弓形虫的感染研究
苏瑞景, 董辉, 朱瑶, 杨玉荣
河南农业大学牧医工程学院,郑州 450002
通讯作者:杨玉荣,Email: yangyu7712@sina.com;ORCID:0000-0001-8971-4648
基金资助: 河南省高校科技创新人才支持计划(No.17HASTIT038)和河南省科技厅自然科学基金(No.162300410138)资助项目
摘要

目的 本研究目的是繁育和鉴别IFN-γ基因敲除小鼠,并探究IFN-γ基因敲除小鼠对TgCatCHn4弓形虫虫株的感染情况。方法 从美国Jackson 试验室购入IFN-γ基因敲除小鼠冷冻胚胎,由北京协和医院复苏。IFN-γ+/-小鼠按雌雄3:1合笼饲养繁殖,取小鼠尾尖组织,提取DNA,经PCR方法鉴定IFN-γ基因表达情况。IFN-γ-/-小鼠和BALB/c小鼠经皮下注射TgCatCHn4弓形虫,分析小鼠的感染率及存活情况,镜检小鼠大脑包囊数量和和肺脏中的速殖子形态。弓形虫阳性小鼠组织接种于Vero细胞,观察弓形虫的生长情况。结果 IFN-γ-/-小鼠的繁育和基因鉴定获得成功。感染TgCatCHn4弓形虫虫株后,IFN-γ-/-小鼠存活时间17.0±1.0 DPI,肺脏涂片可见大量弓形虫速殖子。BALB/c小鼠存活时间304.0±43.7 DPI,包囊数量2.6±1.7个/只小鼠大脑。结论 获得IFN-γ-/-小鼠,其感染弓形虫后存活时间短,是理想的急性弓形虫病的动物模型。

关键词: IFN-γ; 基因敲除小鼠; 弓形虫; TgCatCHn4
中图分类号:R382.5 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2019)03-0250-04
Reproduction of IFN-γ knockout mice and infection of TgCatCHn4 strain of Toxoplasma gondii
SU Rui-jing, DONG Hui, ZHU Yao, YANG Yu-rong
College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Corresponding author:Yang Yu-rong, Email: yangyu7712@sina.com
Fund:Supported by the Program for Science and Technology Innovation Talents in Universities of Henan Province (No.17HASTIT038) and Henan Natural Science Foundation (No.162300410138)
Abstract

The aim of this study is to breed and identify IFN-γ knockout mice and to investigate the infection of TgCatCHn4 Toxoplasma gondii strain in IFN-γ knockout mice. Frozen embryos of IFN-γ-/- mice were purchased from Jackson Laboratories, USA, and recovered by the Peking Union Medical College Hospital. IFN-γ+/- mice were bred, the ratio of female and male was 3:1. The tail tissues of the mice was collected and DNA was extracted. The expression of IFN-γ gene was identified by PCR. IFN-γ-/- mice and BALB/c mice were injected with TgCatCHn4 T. gondii subcutaneously, and the infection rate and survival of the mice were analyzed. The tachyzoites or number of cysts of mice were examined. T. gondii positive mice were inoculated into Vero cells to observe the growth of T. gondii. Results showed that the breeding and genetic identification of IFN-γ knockout mice were successful. After infection with TgCatCHn4 T. gondii, the survival time of IFN-γ-/- mice was 17.0±1.0 DPI, and a large number of T. gondii tachyzoites were observed in the lung. The survival time of BALB/c mice was 304.0±43.7 DPI, and the number of cysts was 2.6±1.7/mouse brain. It is indicated that IFN-γ-/- mice have a short survival time after infected with T. gondii, which was ideal animal model of acute toxoplasmosis.

Keyword: IFN-γ; gene knockout mice; Toxoplasma gondii; TgCatCHn4

γ 干扰素(Interferon gamma, IFN-γ ), 又名Ⅱ 型干扰素或免疫干扰素, 主要由单核巨噬细胞、T细胞和NK细胞产生[1]。IFN-γ 的主要生物学作用是促进免疫、抗病毒和抗肿瘤[2]等, 同时还具有抗寄生虫作用[3]。弓形虫作为食源性寄生原虫, 会导致人和动物的流产, 畸胎或死胎, 对人和动物的健康造成威胁[4, 5]。弓形虫基因型丰富多样, 表现出不同的遗传多样性和致病性, 我国主要流行Chinese 1(ToxoDB#9)型弓形虫, 不同分离株毒力差异较大, 部分Chinese 1型弓形虫虫株感染小鼠后呈慢性经过[6, 7, 8, 9]。目前基因敲除小鼠用于感染性疾病及其免疫应答的研究较多, 但还未见关于IFN-γ -/-小鼠对我国弓形虫虫株的感染情况研究。为获得弓形虫弱毒株的急性动物模型, 从美国Jackson实验室购入IFN-γ -/-小鼠冷冻胚胎, 经复苏培养及6个月的饲养和繁育, 最终成功获得了大量IFN-γ -/-小鼠, 并对比研究了IFN-γ -/-小鼠和BALB/c小鼠对TgCatCHn4(Chinese 1)弓形虫虫株的感染率及宿主存活情况。

1 材料与方法
1.1 试验材料

TgCatCHn4分离于猫组织[9], 由河南农业大学兽医病理实验室保存。

1.2 试验动物

IFN-γ -/-小鼠胚胎购于美国Jackson实验室(Stock No:002287), 经北京协和医院医学实验动物研究所复苏, 获得6只小鼠, 其中雄性3只(纯合子1只, 杂合子2只), 雌性3只(纯合子1只, 杂合子2只)。另从郑州大学试验动物中心购入BALB/c小鼠40只。

1.3 IFN-γ -/-小鼠的饲养、繁育及鉴定

小鼠置于实验室SPF环境中, 按照相应饲养标准进行饲养。饲养过程中, 每日添加饮水、补充饲料, 适时更换垫料。小鼠繁殖时, IFN-γ +/-小鼠以雌雄按3:1比例合笼饲养。哺乳期满的仔鼠与母鼠分开, 雌雄分笼饲养, 并打耳标、记录数量。

剪取仔鼠(3周龄)尾尖组织0.5 cm, 按照组织DNA提取试剂盒(天根生化科技有限生物, 批号:DP304)说明提取尾尖DNA。IFN-γ 扩增引物1:5'-CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG-3', 引物2:5'-AGA AGT AAG TGG AAG GGC CCA GAA G-3', 引物3:5'-AGG GAA ACT GGG AGA GGA GAA ATA T-3'。目的片段大小为500 bp的条带为IFN-γ -/-小鼠, 210 bp的条带为IFN-γ +/+小鼠, 两条210 bp和500 bp的条带为IFN-γ +/-小鼠。

1.4 小鼠感染弓形虫及弓形虫负载量

从Vero细胞培养瓶中收集TgCatCHn4弓形虫速殖子, IFN-γ -/-小鼠(n=5)和BALB/c小鼠(n=24)分别经背部皮下注射1 mL弓形虫(104个/mL)。常规饲养, 每日观察临床表现、死亡日期并记录。接种后30 DPI(30 days post inoculation, 30 DPI)的小鼠, 对肺脏及肠系膜淋巴结进行涂片镜检, 观察是否含有弓形虫速殖子。存活大于30 DPI的小鼠面静脉采血, 采用改良凝集试验(Modified Agglutination Test, MAT)检测血清中弓形虫抗体, 检查其感染情况。存活大于30 DPI并自然死亡的小鼠, 取脑组织压片镜检观察包囊并计数[10]。

将含有弓形虫包囊的小鼠脑组织或含有速殖子的小鼠肺脏或淋巴结, 接种于生长良好的Vero细胞培养瓶中, 每周更换两次细胞培养液, 并在倒置显微镜下观察速殖子。

1.5 统计分析

采用软件Graph Pad Prism 5.0 software (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA) 对数据进行统计分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 小鼠繁殖结果及生长情况

经IFN-γ +/-小鼠雌性和雄性交配的方法繁育, 成功获得了子代小鼠。IFN-γ +/-小鼠毛发光亮顺滑, 四肢有力, 尾长, 行动灵活; IFN-γ -/-小鼠身形较为瘦小, 行动灵活, 善跳跃。平均每只IFN-γ +/-母鼠每胎生产1012只幼鼠, 经过6个月的繁育共生产小鼠799只, 存活758只, 存活率达94.9%。

2.2 子代小鼠IFN-γ 基因鉴定结果(图1)

亲代为IFN-γ +/-杂合子小鼠交配, 子代小鼠有杂合子、野生型、纯合子3种表现型。使用琼脂糖凝胶电泳进行IFN-γ 基因鉴定, 引物1和引物3的扩增产物为500 bp大小的片段, 引物2和引物3的扩增产物为一条210 bp大小的片段, 结果如图1所示。经基因鉴定, 获得IFN-γ +/+308只, IFN-γ +/-404只, IFN-γ -/-46只, 各种基因所占比例为:IFN-γ +/+占40.6%; 杂合子IFN-γ +/-占53.3%; 纯合子IFN-γ -/-占6.1%, 野生型:杂合子:纯合子的比例约为7:9:1。

图1 子代小鼠IFN-γ 基因鉴定结果
M: DNA Marker 700; 1-16:小鼠DNA扩增结果; 1-3、7-11、15-16为野生型; 4-5为纯合子; 6、13-14为杂合子。Fig.1 Identification of IFN-γ gene in offspring mice

2.3 TgCatCHn4弓形虫对IFN-γ -/-小鼠和BALB/c小鼠的致病性研究(表1)

由表1, IFN-γ -/-小鼠感染104个TgCatCHn4弓形虫速殖子后, 存活时间为17.0± 1.0 DPI(16DPI18DPI), 急性感染期死亡率为100%, 死亡小鼠肺淤血, 肺脏涂片可见大量弓形虫速殖子。30 DPI, 小鼠血清弓形虫IgG抗体结果显示, BALB/c小鼠的弓形虫感染率为100%, 临床表现未见明显异常, 急性感染期死亡率为0%, BALB/c小鼠存活时间为304.0± 43.7 DPI(51 DPI726 DPI), 自然死亡小鼠只有10%的大脑研磨液中检出弓形虫包囊, 包囊数量2.6± 1.7个/只小鼠大脑。弓形虫阳性小鼠组织接种Vero细胞后, IFN-γ -/-小鼠肺脏组织和BALB/c小鼠大脑组织内的TgCatCHn4弓形虫在Vero细胞培养后, 初次观察到速殖子的时间分别为2 d和19 d。

表1 TgCatCHn4株弓形虫对IFN-γ -/-小鼠和BALB/c小鼠的致病性 Tab.1 Pathogenicity of TgCatCHn4 Toxoplasma gondii on IFN-γ -/- mice and BALB/c mice
3 讨 论

研究表明, IFN-γ 在抗弓形虫感染中起重要作用。体外试验发现, IFN-γ 能够抑制弓形虫速殖子繁殖, 并可抑制弓形虫包囊活化[11], 调控免疫细胞限制弓形虫在大脑的生长[12]。小鼠感染试验也证实, IFN-γ 具有抑制弓形虫缓殖子转变为速殖子的作用[13]。

全世界共鉴定了231种弓形虫基因型, 1 457株弓形虫虫株(http://ToxoDB.org), 我国弓形虫虫株分离较少, 目前已从人和动物分离得到约122株弓形虫虫株[9], 89%的虫株基因型为ToxoDB#9(Chinese 1), Chinese 1不同分离虫株间毒力差异较大, 部分虫株毒力较弱[6, 7, 8, 9], 动物模型中常难以收获虫体。可使用猫进行弓形虫卵囊的收获, 具有较高的收获率, 且耗时短(21 DPI)[9]。因此在弓形虫的致病机制和疫苗研究中, 获得弓形虫弱毒株的急性感染模型十分重要。

近年来, 有大量试验构建小鼠模型研究弓形虫的致病机理。弓形虫的易感性和致病性与小鼠品系有一定关系, 降序排列依次为:IFN-γ 基因敲除小鼠、人白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA)A1101转基因小鼠、HLA A0201转基因小鼠、HLA B0702转基因小鼠、Swiss Webster、C57/black、BALB/c[10]。本研究使用IFN-γ -/-小鼠进行弓形虫感染试验研究发现, 感染TgCatCHn4弓形虫虫株后, IFN-γ -/-小鼠死亡率100%, 均在急性期死亡, 肺脏涂片可见大量速殖子阳性, 与BALB/c小鼠比较, 可在较短时间收获弱毒弓形虫虫体, 利于后续研究。本研究结果显示IFN-γ -/-小鼠对弓形虫的易感性强于BALB小鼠, 这与报道结果一致。IFN-γ -/-小鼠和BALB/c小鼠分别感染100个Me49株弓形虫卵囊, 100% 的IFN-γ -/-小鼠(25/25)呈弓形虫急性感染而死亡, 存活期小于14 DPI, 但BALB/c小鼠(23/1)的死亡率是4%, 大脑平均包囊126个[10]。IFN-γ -/-小鼠和Swiss小鼠感染TgCatCHn1-2, TgCatCZg 1-4后, IFN-γ -/-小鼠均呈弓形虫急性感染, 存活期20-27 DPI, 而Swiss小鼠未见明显临床症状, 存活期超过42DPI[14]。可见, 与BALB小鼠和Swiss小鼠比较, IFN-γ -/-小鼠对弓形虫更易感。

对IFN-γ 基因敲除小鼠进行繁育, 可为饲养繁育该品系小鼠提供技术参考依据。IFN-γ 基因敲除小鼠对弓形虫的临床表现, 也说明IFN-γ 在弓形虫感染过程中具有重要的抗虫免疫作用, 为深入研究弓形虫急性感染的免疫机制提供了理想模型。

利益冲突:无

The authors have declared that no competing interests exist.

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