转录因子Eha直接调控迟缓爱德华菌的靶基因
田畅1, 刘念1, 郑恩金1, 高大庆1, 陆承平2
1.东南大学医学院,南京 210009
2.南京农业大学动物医学院,南京 210095
通讯作者:高大庆,Email: dgao2@seu.edu.cn; ORCID:0000-0001-6087-8008
摘要

目的 Eha是一种重要转录调控因子,它可以影响迟缓爱德华氏菌(Et)的胞内存活,本实验探究Eha直接调控的靶基因如何抵御巨噬细胞杀灭细菌的分子机制。方法 构建pGEX-4T-ehaflag重组质粒,电击导入 eha基因缺失株的ET-13菌,得到Cehaflag ET13重组菌;用Western blot 检测重组菌Eha-Flag融合蛋白的表达,并用细菌胞内存活实验检测细菌EhaFlag融合蛋白的活性;我们釆用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术,用抗Flag标签抗体对靶基因沉淀Eha-DNA 片段,除去结合的蛋白并纯化DNA片段;以RNA-Sequencing的差异表达基因设计引物,以CHIP得到的DNA样品为模板,进行qRT-PCR; PCR扩增靶基因的启动子区域,构建了pBAD-P lac Z重组质粒,电击分别导入ET-13野生株和 eha基因缺失株,比较它们β-半乳糖苷酶活性的差异;SDS-PAGE电泳比较野生株和缺失株外膜蛋白、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA1和鞭毛钩蛋白FlgK表达的差异,并用细菌胞内存活实验比较野生株和缺失株的差异。结果 Western blot表明,Cehaflag ET13重组菌能够表达Eha-Flag融合蛋白;细菌胞内存活实验表明,该融合蛋白完全可以恢复缺失株在胞内降低的生存能力,Flag 融合标签不影响Eha蛋白的功能;通过qPCR鉴定CHIP,富集到Eha的结合靶点,最终筛选出10个Eha直接结合的基因; 通过野生株和缺失株中β-半乳糖苷酶活性的差异,证明 eha基因对5个靶基因启动子有直接调控作用;通过检测野生株和缺失株表型的差异,证明 eha基因对靶蛋白DcuA1,TnaA和FlgK的表达和活性有调控作用。结论 Eha可以通过直接调控这些靶基因,使Et菌在巨噬细胞内的存活受到影响。

关键词: 迟缓爱德华氏菌; 转录调控因子; eha基因; CHIP
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2019)04-0299-12
Transcription factor, Eha directly regulates the target genes of Edwardsiella tarda
TIAN Chang1, LIU Nian1, ZHENG En-jin1, GAO Da-qing1, LU Cheng-ping2
1.School of Medicine, Southeast University, Nanjing 210009,China
2. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Corresponding author: Gao Da-qing,Email: dgao2@seu.edu.cn
Abstract

Eha is a virulence regulator of Edwardsiella tarda replicating within RAW264.7 macrophages. Our studies try to demonstrate Eha to regulate the target genes to survive against killing bacteria by macrophages. We constructed pGEX-4T-ehaflag, introduced the combination vector into eha mutant strain by electric shock and obtained Cehaflag ET13 strain. The expression and the activity of Eha-Flag fusion protein were inspected by Western blot and intracellular survival experiment, respectively. The results suggested that Eha-Flag fusion protein could express and restore the survival ability within macrophages in the Cehaflag ET13 strain. We used monoclonal anti-Flag antibody to precipitate EhaFlag-DNA complex, removed the binding protein and purified the DNA fragment with CHIP. We designed primers according to the DEGs of RNA-sequencing and identified the genes combined with Eha enriched by CHIP in qPCR. Finally, we got the ten genes combined immediately with Eha. We amplified the promoter regions of the genes from ET-13 genome, constructed the promoter recombinant vector of pBAD-Ptarget LacZ, and introduced the combination vector into the eha mutant and the wild strain by electric shock. We compared the β-gal activity of pBAD-Ptarget LacZ-Δ eha strains with the one of pBAD-Ptarget LacZ-ET13 strains. The results indicated that the eha gene regulated immediately the promoters of five target genes. We compared the expression of the transporter protein DcuA1 of anaerobic C4 dicarboxylic acid and the flgellar hook protein FlgK in the eha mutant strain with the ones in the wild strain by SDS-PAGE. We compared the survival ability of Et13-pACYC184, Et13-tnaA, △eha-tnaA and △eha-pACYC184 strain within macrophages. The results suggest that the eha gene is able to regulate the expression and activity of TnaA, FlgK and DcuA1 proteins. Therefore, Eha can regulate directly these target genes to affect the survival ability of Edwardsiella tarda within macrophage.

Key words: Edwardsiella tarda; transcriptional regulation factor; eha gene; CHIP

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda, 简称 Et)是革兰氏阴性短杆菌, 分布范围很广, 同时, 它可以感染爬行类、两栖类、鱼类及哺乳类等动物。Et菌对水产养殖业而言是一种重要的病原体, 它可以引起多种鱼类的感染[1]。迟缓爱德华氏菌的溶血相关基因(Et haemolysin activator gene, 简称eha)是一种重要的转录调控基因[2], 本实验采用RNA- Sequence技术比较在酸性条件下, ET-13野生株和eha基因缺失株转录组的表达, 发现了147个差异表达的基因(Differentially Expressed Genes, DEGs) [3]。本研究进一步用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation, CHIP)[4], 寻找Et菌Eha直接调控靶基因, 并结合ET13野生株和eha基因缺失株表型的差异, 进一步研究Eha参与调控的Et菌属抵抗巨噬细胞杀灭细菌的详尽分子机制。

1 材料与方法
1.1 Et 株

由南京农业大学陆承平教授赠予ET13菌株; 本实验室前期构建的eha基因缺失株; pBAD-lac Z购自南京铂莱生物有限公司; pGEX-4T购自武汉三鹰公司(表1所示)。CHIP-IT○R Express试剂盒购自ACTIVE MOTIF公司; 本实验于TaKara公司购试剂盒PrimeScriptTM RT Mix及SYBR○R Premix Ex TaTM。细菌培养基(Luria Broth, LB); 鼠源巨噬细胞RAW264.7为上海兽医研究所王少辉博士惠赠; 于Thermo购进胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)和细胞培养液(Dulbecco’ s Minimum Essential Medium, DMEM)。

表1 本研究所用质粒和菌株 Tab.1 Bacterial species and plasmids in the study
1.2 重组质粒

pGEX-4T-ehaflag的构建与鉴定 以ET13的基因组DNA为模板、引物ehaflag-F: CGGGATCCTTGGAATCGACATTGGGCTCG和ehaflag-R: GCGTCGACCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCATTTATTCTGTAAGTGAAT(划线部分为Flag标签序列), 扩增融合基因ehaflag。用Sal I和BamH I 限制性内切酶对ehaflag片段和pGEX-4T载体双酶切, 将双酶切后的片段进行连接, 构建重组质粒并命名为pGEX-4T-ehaflag, 进行测序, 鉴定重组质粒。

1.3 细菌EhaFlag融合蛋白的表达

采用电击转化法将重组质粒pGEX-4T-ehaflag导入eha基因缺失株, 命名为Cehaflag ET13。挑取ET13、△ eha和Cehaflag ET13三菌株的单菌落, 并接种于15 mL LB液体培养基中, 于摇床37 ℃过夜培养, 参照说明步骤制备3菌株的蛋白样品, 用样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。釆用Flag标签的单抗anti-Flag antibody(Sigma, USA), 单抗anti-DnaK (Cell Signaling Technology, USA), 用Western blot检测Cehaflag ET13中EhaFlag融合蛋白的表达, DnaK作为内参。

1.4 细菌的胞内生存实验研究

以100:1的感染复数MOI(multiplicity of infection) 用对数期生长的细菌感染鼠巨噬细胞, 参照文献方法[5], 横坐标为培养时间(h), 每个细胞内的活菌数(CFU/cell)为纵坐标, 绘制细菌胞内细菌数目和时间曲线。每个细胞内存活的活菌数目=规定时间分离的细菌数目/规定时间的细胞总数目, 该试验重复3次后进行统计学分析。

1.5 染色质免疫共沉淀

1.5.1 细菌的固定 根据参照文献[3]对数期ehaflag ET13株以pH=6.3 LB的酸性环境刺激2 h, 按参考文献[4], 加入甲醛, 室温固定, 然后加入甘氨酸混匀, 室温孵育。洗涤, 裂解菌体。

1.5.2 超声处理 参考文献[4], 超声波将细菌的基因组DNA片段化至500~1 000 bp, 超声条件:200 W, 5 s/20 s, 共超声6到7次使细菌悬液变澄清。

1.5.3 除杂与抗体孵育 按参考文献[4]的方法, 为了降低非特异性结合, 向上清液中加入预处理过的Protein G Magnetic Beads, 孵育; 依次加入CHIP反应体系各组分, 实验组加入anti-Flag antibody, 对照组加入IgG antibody, 孵育过夜。

1.5.4 免疫复合物的沉淀与洗涤, 解交联 按参考文献[5]的方法, 向过夜孵育的样品中分别加入预处理过Beads, 离心, 洗涤。 加入蛋白酶K, 分离结合在一起的DNA 和蛋白。

1.5.5 荧光定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR) 以CHIP得到的DNA样品为模板, 根据RNA-Sequence的结果设计引物(表2), 参照试剂盒的说明书进行实验操作, 在ABI7300型荧光定量仪上进行PCR反应, 内标参照为细菌中16S rRNA的表达量, 采用2-Δ Δ ct法计算细菌在实验组(anti-Flag antibody)基因转录水平相对对照组(IgG antibody)的倍数。

表2 用于qRT-PCR鉴定Eha直接结合基因的引物及产物大小 Tab.2 qRT-PCR Primer sequences and product sizes to identify the genes combined directly by Eha
1.6 构建靶基因启动子和LacZ融合质粒及检测β -半乳糖苷酶

以ET-13基因组DNA为模板, 扩增靶基因的启动子区(引物见表3), 将该片段插入 pBAD-lac Z 载体中, 构建了靶基因的启动子载体 pBAD-Plac Z, 然后将这些载体分别电击导入 ET-13野生株和eha基因缺失株中。检测对数期细菌以pH=6.3 LB的酸性环境刺激2h的β — 半乳糖苷酶活性。

表3 基因启动子区的产物大小和引物序列 Tab.3 Primer sequences and product sizes to amplify the promoters of genes by PCR
1.7 SDS-PAGE检测细菌外膜蛋白表达

将相同数目对数期的 ET-13野生株和eha基因缺失株超声波破碎, 离心, 取上清, 再超速离心, 沉淀为细胞膜成分。用BCA法测定蛋白浓度, 取等量的蛋白样品, 进行10% SDS-PAGE 蛋白电泳检测, 考马斯亮兰 R-250 染色液中染色, 脱色后观察结果。

1.8 SDS-PAGE检测细菌鞭毛蛋白表达

将相同数目对数期的ET-13野生株和eha基因缺失株, 离心沉淀, 提取细菌鞭毛蛋白, 分别溶于5 mL PBS, 加样15 μ L /每孔, 进行SDS-PAGE检测, 方法同1.7。

1.9 统计学分析

使用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行分析两组数据之间的比较采用t检验, 当P< 0.05时表示结果有统计学差异。

2 结 果
2.1 细菌EhaFlag融合蛋白的表达

结果如图1所示, 可以在Cehaflag ET13株中检测到大约21 kDa的条带, 而在对照组的ET-13野生株和eha缺失株中未检测出条带, 说明在Cehaflag ET13株中EhaFlag的融合蛋白是可以表达的。

图1 Western blot检测在Et菌中EhaFlag融合蛋白的表达
1.Cehaflag ET13株 2. ET13野生株 3. eha基因缺失株
Fig.1 EhaFlag fusion protein of expression in Et inspected by Western blot

2.2 细菌EhaFlag融合蛋白活性的检测

结果如图2所示, Cehaflag ET13株与野生型ET-13株在巨噬细胞内的生存能力无明显差异, 它们和eha基因缺失株的生存能力分别有明显差异(P< 0.05), 说明Cehaflag ET13株中表达的EhaFlag融合蛋白与ET-13野生株中表达的Eha蛋白具有一样生物活性。

图2 比较ET13与Cehaflag ET13在巨噬细胞内活差异Fig. 2 Comparison of the differences between the intracellular survival rates of Cehaflag ET13 and the one of the wild type ET13

2.3 染色质免疫共沉淀超声条件的摸索

结果如图3所示, 200 W, Plus 5 s/10 s, 超声6或7次后DNA片段在500~1 000 bp的集中程度更高。

图3 检测不同超声条件下ET13细菌基因组DNA的片段化程度
A 1-8:200W, Plus10s/30s的超声2、3、4、5、6、7、8、9次; B 1-8: 200W, Plus 5s/10s的超声4、5、6、7、8、9、10、11次
Fig.3 Fragmentation degree of bacterial genomic DNA of ET13 on different ultrasonic conditions

2.4 寻找Eha蛋白直接结合的基因

qRT-PCR 检测CHIP实验获得的DNA样品中基因的量, 在实验组(anti-Flag antibody)与对照组(IgG antibody)之间相差10倍以上即为转录调控因子Eha的基因。结果如图4所示, CHIP共富集10个基因的启动子片断分别编码:镰刀菌酸抗性蛋白(ETATCC_ RS01555)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(ETATCC_RS08025)、分支酸合酶(ETATCC_ RS14735)、 rRNA胞嘧啶-C5-甲基转移酶(ETATCC_RS10595)、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA(ETATCC_RS15225)、异柠檬酸裂合酶CitC(ETATCC_RS06125)、热休克蛋白IbpB(ETATCC_RS00925)、鞭毛钩蛋白flgK(ETATCC_RS14855)、色氨酸酶(ETATCC_RS07650)和一个未知功能蛋白(ETATCC_ RS10185)。

图4 qPCR鉴定转录因子Eha直接结合的基因Fig.4 qPCR used to identify the genes combined immediately with the transcriptive factor Eha

图5 比较野生型ET13株和eha基因缺失株中 β -半乳糖苷酶活性的差异Fig.5 Comparison of the differences between the β -galactosidase activities of the wild type ET13 and the ones of the eha mutant
(* P< 0.05; * * P< 0.01)

2.5 检测eha基因对靶基因启动子直接调控作用

对数期细菌pH=6.3的酸性环境刺激2 h后, 比较ET13野生株和eha基因缺失株中pBAD-Plac Z的β -半乳糖苷酶活性的差异, 结果如图5所示, 在该条件下, eha基因直接正调控靶基因编码的蛋白是:分支酸合酶(ETATCC_ RS14735)、色氨酸酶TnaA(ETATCC_ RS07650)、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA(ETATCC_ RS15225)、热休克蛋白IbpB(ETATCC_ RS00925)和鞭毛钩蛋白flgK(ETATCC_RS14855)。

2.6 比较野生株和eha基因缺失株外膜蛋白表达的差异

分别提取野生株和缺失株的外膜蛋白, SDS-PAGE 蛋白电泳检测, 结果见图 6。在加等量蛋白的情况下, 野生株约 17 kDa、30 kDa 和 37.7 kDa外膜蛋白的表达水平明显高于eha基因缺失株的表达水平, 其中37.7 kDa的大小和厌氧C4二羧酸转运蛋DcuA1的大小一致。

图6 用SDS-PAEG比较ET13、△ eha和互补株中外膜蛋白的表达差异
M. 蛋白marker; 1.野生型ET-13; 2. eha基因缺失株; 3. 互补株
Fig.6 Comparison of the differences between the out membrane proteins expressed by the wild type ET13 and the one did by the eha mutant by SDS-PAEG

2.7 比较野生株和eha基因缺失株鞭毛蛋白表达的差异

分别提取ET13、互补株和△ eha的鞭毛钩蛋白, 进行蛋白电泳检测, 结果如图所示(图7), E.tarda鞭毛蛋白的分子量为54 kD, 图中的条带主要位于43 kD和56 kD之间, 与鞭毛钩蛋白的分子量一致。因此, 当三种菌株上样量相同时, 野生株与互补株的鞭毛钩蛋白的表达量接近且都高于eha缺失株。

图7 SDS-PAEG比较ET13、△ eha和互补株的鞭毛钩蛋白flgK表达差异
M蛋白marker; 1. 野生型ET13; 2. 互补株; 3. eha基因缺失株
Fig.7 Comparison of the differences between the flagellar hook protein flgK expressed by the wild type ET13 and the one did by the eha mutant by SDS-PAEG

2.8 eha基因调控tnaA基因影响Et菌胞内生存的作用

结果显示, Et13-pACYC184、Et13-tnaA、△ eha-tnaA和△ eha-pACYC184株在巨噬细胞内的生存曲线随培养时间呈上升趋势, 结果表明以上菌株均可在巨噬细胞内存活。并且与Et13-pACYC184菌株相比, 继续培养6 h以后, Et13-tnaA组胞内存活的细菌数量呈增高(P< 0.05), △ eha-pACYC184组细菌数目明显降低(P< 0.05), 表明eha基因和tnaA基因均影响Et13在巨噬细胞内的繁殖速率。而和△ eha-pACYC184组相比, △ eha-tnaA组细菌数量增高(P< 0.05); 和Et13-pACYC184组相比, △ eha-tnaA组细菌数量差异没有统计学意义(P> 0.05), 结果提示, tnaA基因可以回复eha基因缺失对Et13胞内繁殖速率的影响。

图8 eha基因调控tnaA基因影响ET13株在巨噬细胞胞内的生存率(* * P< 0.01)Fig. 8 The eha gene regulated tnaA genes to affecte the intracellular survival rates of ET13 strains within macrophages

3 讨 论

我们通过转录组测序技术, 发现 ET-13 野生株与eha缺失株间的差异表达基因, 但其中有些基因是eha直接调控的靶基因, 而有的基因是受环境等因素影响或者eha间接调控的基因。本实验借助免疫共沉淀实验技术(CHIP), 研究体内DNA与蛋白质的相互作用, 从而在细胞的内环境条件下, 找出能够与Eha蛋白相结合的靶基因。此技术的关键是需要一种特异性好的抗体才能有效地富集目标蛋白。通过检测Eha融合蛋白的功能发现, Flag标签并会不干扰Eha蛋白的功能。本实验借助商品化的Flag标签替代Eha的单抗, 从而实现对融合蛋白Eha-Flag蛋白的高度富集, 最终筛选出5个可以和Eha蛋白直接结合的基因。此外, 通过直接检测转化入pBAD-Plac Z的ET-13和△ eha株中的β -gal活性的差异, 说明eha基因对靶基因的启动子区具有直接的调控作用。此外, 我们通过比野生株和缺失株表型的差异, 如厌氧C4二羧酸转运蛋DcuA1和鞭毛钩蛋白FlgK, 验证eha基因对靶基因的启动子有直接的调控作用。

Eha直接调控靶基因编码的蛋白, 如分支酸合酶是莽草酸通路中的一种酶, 存在于大多数原核生物中, 能够催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为分支酸, 是该通路的最后一步。 由于分支酸是合成芳香族氨基酸的前体, 对于细菌的生长繁殖至关重要[6]。C4-二羧酸盐作为碳和电子受体分子, 参与非糖物质代谢。在空肠弯曲杆菌中, C4-二羧酸盐转运子dcuA和dcuB由双组分系统RacR / RacS直接调节, 响应缺氧氧气环境和硝酸盐的存在[7]。小分子热休克蛋白IbpA和IbpB与胁迫条件下细胞内蛋白的稳态和生存有着密切联系, 具有分子伴侣功能、稳定细胞结构功能和调节细胞凋亡功能。巨噬细胞吞噬非致病大肠埃希菌, 产生ROS(Reactive Oxygen Species)杀死细菌时, IbpAB提供一定的保护作用。IbpB的靶蛋白, 如色氨酸降解酶、延伸因子EF-Tu和过氧化氢酶等, 并发现IbpB可以稳定这些靶蛋白[8]。FlgK和FlaL共同构成鞭毛钩环状结构, 是鞭毛形成并发挥功能的重要组成部分, ETATCC_RS14855鞭毛钩丝 FlgK, 鞭毛是细菌的运动器官, 鞭毛的运动方向受到细菌趋化作用系统的控制, 鞭毛对于细菌的环境适应性及致病性至关重要[9]。色氨酸酶能够催化色氨酸形成吲哚和丙酮酸, 直接参与氨基酸的代谢过程, 其中吲哚的产生可以参与很多细菌的生理活动调节, 比如抗药性、抗酸性、毒力、运动性、生物膜形成等[10]。这些结果说明, Eha可以通过调控靶基因, 影响Et菌物质和能量代谢过程, 抵御巨噬细胞杀菌能力。

利益冲突:无

编辑:林丹

The authors have declared that no competing interests exist.

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