牛羊猪种布鲁氏菌快速鉴别PCR方法的建立及评价
刘志国1,2, 塔娜2, 李晓燕2, 王妙3, 赵鸿雁1, 朴东日1, 蔚瑞平2, 米景川2, 李振军1
1.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206
2.内蒙古自治区综合疾病预防控制中心,呼和浩特 010031
3.乌兰察布市地方病防治中心,乌兰察布 012000
通讯作者:李振军,Email: LIZhen-jun@icdc.cn;ORCID:0000-0003-0947-8839
摘要

目的 建立一种可在一个反应体系中同时鉴别布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的快速PCR鉴别方法。方法 将布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的扩增引物进行优化组合,建立全新的BAMS-PCR方法;随后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对现场分离的219株布鲁氏菌进行鉴别,评价其在布鲁氏菌鉴别中的应用价值。最后,用该方法对临床标本中布鲁氏菌的DNA进行扩增,评价其在临床诊断中的实用性。结果 BAMS-PCR方法可在同一反应中同时鉴别布鲁氏菌及牛种(1,2,4型),羊种(1,2和3型)和猪种(1型)布鲁氏菌,并有较好的特异性和敏感性。布鲁氏菌属,牛种,猪种和羊种布鲁氏菌引物的检测灵敏度分别为10 pg/μL,100 pg/μL, 10 pg/μL和100 pg/μL。BAMS-PCR对219株临床分离菌株的鉴定结果和常规生物分型方法的鉴定符合率为100%。经BAMS-PCR检测,97份临床血清样本仅6份为阳性,全血和组织(羊脾)样本全部为阴性。结论 BAMS-PCR是一种简便、快速、高效、准确的布鲁氏菌鉴别方法,可作为临床分离菌株的首选鉴别方法。

关键词: 布鲁氏菌; 聚合酶链式反应; 鉴别; 评价
中图分类号:R378.5 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2019)05-0399-05
Establishment and evaluation of rapid discriminate PCR assay for Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella suis
LIU Zhi-guo1,2, TA Na2, LI Xiao-yan2, WANG Miao3, ZHAO Hong-yan1, PIAO Dong-ri1, YU Rui-ping2, MI Jing-chuan2, LI Zhen-jun1
1. National Institute of Infectious Diseases Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention/Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease, Beijing 102206, China
2. Inner Mongolia Autonomous Region Central for Comprehensive Disease Control and Prevention, Huhhot 010031, China
3.Ulanqab Center for Endemic Disease Control and Prevention, Ulanqab 012000, China
Corresponding author: LI Zhen-jun, Emial: LiZhenjun@icdc.cn
Abstract

The aim of this study is to establish a rapid PCR discriminate assay for simultaneous identified Brucella genus, B. abortus, B. melitensis and B. suis in single reaction system. Amplification primers of Brucella genus and B. abortus, B. melitensis, and B. suis were combined and optimizated, a kind of novelty BAMS-PCR was established. Subsequently, specificity and sensitivity of BAMS-PCR were evaluated. In present study, 219 Brucella spp. were identified for assessed practicable of BAMS-PCR. Finally, DNA of Brucella clinical sample were detected by BAMS-PCR for evaluated using valuable in clinical diagnosis of Brucellosis. BAMS-PCR can simultaneous identified Brucella genus, B. abortus (bv.1,2 and 4), B. melitensis (bv.1-3) and B. suis (bv.1) in single reaction system, and this method had very higher specificity and sensitivity, detecting sensitivity of primers of Brucella genus, B. abortus, B. melitensis and B. suis with 10 pg/μL,100 pg/μL, 10 pg/μL and 100 pg/μL, respectively. There were 100% identification coincidence rate between BAMS-PCR and convention biotypes testing based on amplificated results of 219 Brucella spp. BAMS-PCR detected showing that there were only 6 serum samples were positive, others (whole blood and tissues (sheep spleen)) samples were all negative. BAMS-PCR was a simple, rapid, high efficiency and accuracy identification assay for Bruclla spp., could as first choice discriminate method of clinical isolates Bruclla spp.

Key words: Brucella spp.; PCR; discriminate; evaluation

布病是一种全球分布的人兽共患病, 可引起严重的经济损失和较大的公共卫生问题[1]。人感染后主要表现为发热、多汗、肌肉关节疼痛、乏力、全身不适等症[2, 3]; 母畜感染后最主要的临床表现为流产、死胎或胎盘滞留, 公畜则表现为睾丸炎或附睾炎[4]。染疫动物是人间布病的主要传染源, 直接或间接与感染动物接触以及进食被污染的动物产品或奶制品均可感染布鲁氏菌[5]。布病的预防和控制很大程度上依靠快速的检测和监测。快速、准确的鉴定布鲁氏菌的种型对布病的防控极为重要[6]。病原学分离是诊断布病的金标准, 但该方法耗时且需有相当级别的生物安全实验室, 并受实验技能及实验室生物安全风险等因素制约。另外, 由于布鲁氏菌高度保守, 各种型的区分鉴别较为困难。

PCR方法不仅具有良好的特异性和较强的敏感性, 而且能够降低实验人员的劳动强度和生物安全风险, 减少试验成本等多种优势[7, 8]。基于差异基因建立鉴别布鲁氏菌的PCR方法对布病的快速检测、分子流行病学调查和监测具有重要意义。本文基于布鲁氏菌的差异基因建立能够鉴定和鉴别布鲁氏菌的PCR方法, 并对其实用性进行评价, 进而为布鲁氏菌的快速鉴别提供技术手段。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器 ClassⅡ A2型生物安全柜、CO2培养箱(赛默飞世尔科技(中国)有限公司), Gene Amp PCR仪(Applied Bio systems Inc, USA), DYY-6C-电泳仪(北京六一生物科技有限公司), Gel Doc XR自动凝胶成像系统 (Bio-Rad, USA)。

1.1.2 试剂 布氏琼脂和肉汤培养基[碧迪医疗器械(上海)有限公司]; 布鲁氏菌阳性血清, A、M因子血清、Tb、Wb、BK2噬菌体均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所布鲁氏菌病室提供; 2× Easy Taq PCR Super mix、DNA Marker 2000 (TranS 2K)、6× Loading Buffer由北京全式金生物技术有限公司提供; 细菌基因组提取试剂盒由北京凯杰[Qiagen]生物有限公司提供, PCR引物名称、序列及扩增产物见表1。PCR引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表1 BAMS-PCR引物名称、序列及扩增产物 Tab.1 Products size, sequence and primers name of BAMS-PCR

1.1.3 菌株及临床样本 219株来自全部的7个生物型的布鲁氏菌被用于评价Bams-PCR的实用性, 菌株信息见表2。各97份血清、全血以及30份动物组织(羊脾)被用于扩增, 评价该方法在临床样本中的应用。在97份血清中70份为布病抗体阳性, 27份为阴性; 97份全血中, 80份为布病抗体阳性, 17份为阴性, 血清和全血样本全部来自通辽市地方病防治中心布病检验科, 30份组织标本(羊脾)来自乌兰察布市集宁区某屠宰场(20份为布病琥红试验阳性, 10份为琥红试验阴性)。牛种544, 羊种16M, 猪种1330标准菌株DNA作为扩增对照。大肠O:157, 小肠结肠炎耶尔森氏菌O:9, 巴尔通体, 人苍白杆菌DNA由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所布鲁氏菌病室提供。

表2 布鲁氏菌种型, 数量及地区分布 Tab.2 Brucella spp. distribute of species (biovars), numbers and provinces
1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 将新鲜传代培养布鲁氏菌经95 ℃, 30 min灭活, 高速瞬时离心后, 严格按照QIAamp DNA Mini Kit (250次)(细菌核酸提取试剂盒)操作步骤进行, 提取完毕后用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度, -20 ℃保存备用; 涉及活菌操作在生物安全L3级实验室完成。大肠O:157, 小肠结肠炎耶尔森氏菌O:9, 巴尔通体, 人苍白杆菌DNA来自中国疾病预防控制中心传染病所各专业实验。血清、全血和组织中布鲁氏菌DNA提取分别按照凯杰DNA提取试剂盒说明书中的操作步骤进行。

1.2.2 BAMS-PCR扩增 扩增采用20 μ L体系, 其中2× Master Mix10.0 μ L, 上/下游引物各0.4 μ L, DNA模板1.0 μ L, ddH2O 8.2 μ L。扩增参数为:预变性95 ℃ 4 min; 变性94 ℃ 30 s; 退火52 ℃ 30 s; 延伸72 ℃ 45 s; 30个循环; 终末延伸72 ℃ 5 min。PCR产物经2.0%的琼脂糖凝在120 V电泳30 min用凝胶成像仪进行检测并记录结果。

1.2.3 AMS-PCR敏感性评价 将已知浓度的DNA样本进行连续的倍比稀释(原液~10-9), 随后用该方法进行扩增, 判定该方法的灵敏度。

1.2.4 菌株的鉴别评价 用该方法对临床分离的菌株进行鉴别, 并与经典方法进行比较, 确定其在菌株鉴定中的实用性。

1.2.5 临床样本的检测评价 用该方法对临床采集的血清、全血或动物组织中的DNA进行检测, 从而确定在临床样本检测中的使用价值。

2 结 果
2.1 BAMS-PCR特异性评价

用BAMS引物同时对牛种8个生物型(1~7, 9)、羊种3个生物型(1~3)、猪种5个生物型(1~5)、犬种、绵羊附睾、沙林鼠种布鲁氏菌及阴性对照菌株进行了扩增。扩增结果经电泳检测显示所有布鲁氏菌均有特异性的208 bp的扩增条带, 牛种1, 2, 4型有113 bp的预期扩增条带, 羊种1~3型有252 bp的预期扩增条带, 猪种1型有170 bp扩增条带, 见图1; 阴性对照菌株未见扩增。

图1 AMS-PCR扩增结果
M:分子量标(Marker, DL2000), lane 1~8, 牛1~7, 牛9; lane 9~11, 羊1, 羊2, 羊3; lane 12~16, 猪1~5; lane17~19分别为犬种、绵羊附睾种和沙林鼠布鲁氏菌; lane 20为阴性对照。
Fig.1 Amplification of AMS-PCR

2.2 BAMS-PCR灵敏度评价

分别用牛羊猪布鲁氏菌的扩增引物对牛、羊、猪种标准菌株的DNA及其倍比稀释品进行扩增。电泳检测结果显示牛种和猪种引物的检测灵敏度均为10-2; 羊种布鲁氏菌的检测灵敏度为10-3, 阴性对照未见扩增; 见图2。

图2 AMS-PCR灵敏度检测结果
M:分子量标(Marker, DL2000), lane 1~10表示DNA原始-10-9, lane11为阴性对照。A为牛种引物的灵敏度检测结果, B为羊种引物的灵敏度检测结果。
Fig.2 Sensitivity detection of AMS-PCR

2.3 BAMS-PCR菌株鉴别结果

采用BAMS-PCR方法对临床分离的菌株进行了扩增。扩增结果显示, 牛羊猪种布鲁氏菌有预期的扩增条带, 扩增结果与经典鉴定方法的符合率为100%; 见图3, 表3

图3 AMS-PCR扩增结果
M:分子量标(Marker, DL2000), lane 1~3, 牛种1型、羊种1型、猪种1型阳性对照; lane 4, 5为牛种布鲁氏菌; lane7~23为羊种布鲁氏菌; lane23为阴性对照
Fig.3 Amplification of AMS-PCR

表3 219株布鲁氏菌的BAMS-PCR 鉴定结果 Tab.3 BAMS-PCR Identification of 219 Brucella spp.
2.4 BAMS-PCR临床样本鉴定结果

采用BAMS-PCR对临床的血清、全血和动物组织样本进行了扩增。扩增结果显示牛羊猪种布鲁氏菌阳性对照分别获得了预期的扩增条带, 阴性对照未见扩增。阳性血清的扩增条带较为模糊, 仅6份样品为阳性, 1份为羊种布鲁氏菌阳性, 3份为牛种布鲁氏菌阳性; 1份为布鲁氏菌阳性, 1份同时获得了牛种和羊种布鲁氏菌; 此外, 全血和组织样本的扩增结果均为阴性; 部分阳性血清扩增结果见图4。

图4 97份血清样本的BAMS-PCR扩增结果
M:分子量标(Marker, DL2000), lane 1~3, 牛种1型、羊种1型、猪种1型阳性对照; lane 4-22临床血清样本, lane4为羊种布鲁氏菌; lane8为布鲁氏菌; lane 11 同时获得了牛种和羊种布鲁氏菌; lane12, 14, 17为牛种布鲁氏菌; lane23为阴性对照。
Fig.4 BAMS-PCR amplification of 97 serum samples

3 讨 论

快速的种型鉴定对布病的诊断、治疗及疫情的防控具有重要的意义。在布鲁氏菌的鉴别中通常用BCSP31-PCR或16S-PCR在种属水平进行鉴定, 再用AMOS-PCR等进行种型鉴别, 不仅增加了实验步骤和时间, 并存在资源等的额外耗费[11]。鉴于此, 本研究建立了一种可在同一个反应体系中同时鉴定布鲁氏菌并能鉴别牛、羊、猪种主要致病布鲁氏菌的BAMS-PCR[布鲁氏菌属(Brucella spp. ), 牛种(B. abortus)、羊种(B. melitensis)和猪种(B. suis)]方法; 与AMOS-PCR相比, 该方法实现了对布鲁氏菌属和生物型的同时鉴别, 并可在2 h内报告实验结果, 缩短了试验周期, 提高了检测效率[12]。在该实验中布鲁氏菌属引物能特异性地扩增牛、羊、猪、犬种、绵羊附睾和沙林鼠种6个经典布鲁氏菌的19个生物型, 扩增条带为208 bp; 人苍白杆菌、大肠杆菌O:157等阴性对照菌株未见扩增; 牛种布鲁氏菌引物可特异性的检测牛种1、2、4型, 羊种引物可检测羊种布鲁氏菌的3个生物型, 猪种引物能特异性的检测猪种1型布鲁氏菌, 扩增条带分别为113 bp, 252 bp和130 bp, 实现了布鲁氏菌及牛羊猪主要致病性布鲁氏菌的同时检测和鉴别。牛种和猪种布鲁氏菌引物的检测灵敏度均为10-2(100 pg/μ L ); 而羊种布鲁氏菌引物的检测灵敏度为10-3(10 pg/μ L ), 该方法具有较高的检测灵敏度, 是一种新型的布鲁氏菌鉴别方法集成, 适合布鲁氏菌的快速检测和鉴别。

BAMS-PCR对219株临床分离菌株的鉴定结果显示, 所有实验菌株全部为布鲁氏菌, 其中159株为羊种布鲁氏菌, 23株为牛种菌, 27株为猪种布鲁氏菌, 另有10株未知种型(犬种5株, 2株牛种3型和3株猪种3型), 鉴定结果与常规鉴定的符合率为100%。我国流行的菌种主要是羊种, 其次为牛种和猪种[13], 该方法可满足我国布病流行区实验室布鲁氏菌的种型鉴定。

采用BAMS-PCR对临床采集的血清和全血样本进行了扩增。97份全血样本和30份动物组织样本的扩增全部为阴性, 表明用全血或动物组织作为标本进行布鲁氏菌DNA扩增尚不成熟[14]。在70份血清抗体阳性样本中有6份为PCR扩增阳性, 阳性率仅为8.6%(6/70); 其中1份仅判定为布鲁氏菌感染, 未能鉴别其种型; 另1份样本鉴定为羊种布鲁氏菌感染; 有3份鉴定为牛种布鲁氏菌感染; 其余1份同时表现为牛种和羊种布鲁氏菌阳性, 可能是同时感染了牛种和羊种布鲁氏菌所致。Kamal IH等[10]在对临床采集的血清进行布鲁氏菌DNA检测时发现有血清样本可同时检出牛种和羊种布鲁氏菌DNA, 可能是同时感染两种布鲁氏菌导致, 应开展相应的分子流行学和现场流行病学进一步证实。

本研究建立了能在同一反应体系中同时鉴定布鲁氏菌并能鉴别牛羊猪种主要致病性的布鲁氏菌, 建立的方法有较高的特异性和相当的敏感性。在临床分离菌株的鉴别中与常规鉴定结果相同, 而且具有快速、准确、操作简便, 结果易判读并能同时检测多个靶基因的优点, 可极大地缩短实验时间, 降低试验成本, 减少工作人员的生物安全风险[15], 是临床分离布鲁氏菌的鉴定和种型鉴别的最佳辅助鉴定方法, 优化布鲁氏菌的鉴定程序, 提升了实验室的检测能力, 对人畜间布病的诊疗、防控具有重要的意义。

利益冲突:无

编辑:张智芳

The authors have declared that no competing interests exist.

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