1.1.1 弓形虫type I型RH株及RH_{Δ ROP16}株 由本实验室传代保存, 复苏后腹腔接种小鼠。

1.1.2 实验动物 雌性6~8周龄SPF级BALB/c小鼠(20~25 g), 由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。

1.1.3 实验试剂 诺唯赞 SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒、 Hi Script ‖ QRT Super Mix for q PCR均购于合肥飒英斯生物公司。氯仿、异丙醇、无水乙醇、4%多聚甲醛均购于安徽欣乐生物有限公司。

1.2.1 BALB/c小鼠速殖子接种 分别收集RH野生型和RH_{Δ ROP16}速殖子, 显微镜下计数并稀释至1 000个/mL, 每组20只小鼠, 每只腹腔注射400 μ L, 观察并记录小鼠出现竖毛、弓背、腹水及活动迟缓的先后顺序及死亡时间。分别在感染后3 d、5 d和7 d, 麻醉状态下, 剖杀小鼠取脾脏组织, -80 ℃冰箱保存、备用。

1.2.2 脑组织和肺组织HE染色 分别于感染后3 d、5 d和7 d, 每组随机取5只小鼠, 无痛麻醉下眼球取血后脱颈处死, 分别取脑组织和肺组织, 置4%多聚甲醛固定24 h后, 石蜡包埋, 3 μ m切片。切片置于65 ℃烤箱过夜, 次日置于二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水, 置于苏木精染液3 min, 1%盐酸乙醇分化后水洗, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片。

1.2.3 脾组织总RNA提取 从-80 ℃冰箱取出脾组织, 用剪刀剪碎后加入 300 μ L Trizol用匀浆机硏磨后再加入700 μ L Trizol, 提取RNA并测定浓度及纯度。按照Hi Script QRT Super Mix for qPCR说明书逆转录为cDNA备用。

1.2.4 细胞因子引物的设计 根据GenBank中Arg-1、IL-10、IL-12p40、IFN-γ 和TNF-α 的序列, 用Premier 3设计引物, 上海生工生物工程有限公司合成。

Target Primer sequence(5'-3')

Arg-1 F: CAGAAGAATGGAAGAGTCAG

R: CAGATATGCAGGGAGTCACC

IFN-γ F: GGTCAACAACCCACAGGTCC

R: CGACTCCTTTTCCGCTTCC

IL-10 F: GCTCCTAGAGCTGCGGACT

R: TGTTGTCCAGCTGGTCCTTT

TNF-α F: ACGGCATGGATCTCAAAGAC

R: GTGGGTGAGGAGCACGTAGT

IL-12 F: GATGTCACCTGCCCAACTG

R: TGGTTTGATGATGTCCCTGA

GAPDH F: CAACTTTGGCATTGTGGAAGG

R: ACACATTGGGGGTAGGAACAC

1.2.5 细胞因子测定 按照SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒说明书20 μ L体系, 利用罗氏LC96 SW 1.1相对定量检测脾脏细胞因子变化。

取6只8周雌性小鼠, 每组3只, 分别腹腔注射1 200个虫株, 于第5 d无痛脱颈处死, 腹腔灌洗计数虫株数量。

实验数据用Graph Pad Prism 6.02软件进行统计分析, 采用t检验方法分析, 检验水平为α =0.05。

通过腹腔注射相同数量的速殖子建立RH_{Δ rop16}和野生型感染鼠模型, 动态观察二组鼠于感染3 d、5 d、6 d、7 d、8 d小鼠发病(见表1)。

表1

Tab.1

表1(Tab.1)

表1 RHΔ rop16小鼠和RH小鼠弓形虫病症状 Tab.1 Mice infected with wild-type RH strain and RHΔ rop16 strain checked for clinical signs of toxoplasmosis Group (n=3) Days after injection of tachyzoites 3 d 5 d 6 d 7 d 8 d control No obvious symptoms No obvious symptoms No obvious symptoms No obvious symptoms No obvious symptoms RH No obvious symptoms kyphosis, piloerection, a small amount of ascites kyphosis, piloerection, scites, death kyphosis, piloerection, scites, death All death Δ ROP16 No obvious symptoms kyphosis, piloerection, a small amount of ascites kyphosis, piloerection, a small amount of ascites kyphosis, piloerection, scites, death All death

表1 RHΔ rop16小鼠和RH小鼠弓形虫病症状 Tab.1 Mice infected with wild-type RH strain and RHΔ rop16 strain checked for clinical signs of toxoplasmosis

两组动物存活率无差异。 野生型RH感染组第6 d开始出现死亡, RH_{Δ ROP16}感染组小鼠第7 d开始出现死亡, 但两组均在第8 d死亡, 统计学分析两组小鼠存活率之间无统计学差异(P> 0.05)(见图1)。

图1

Fig.1

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	图1 感染野生型RH虫株和RHΔ rop16虫株小鼠的存活率无统计学差异(P> 0.05)Fig.1 Survival curve of mice infected wild-type RH strains and RHΔ rop16 strains(P> 0.05)

2.3.1 肺组织切片HE染色显示感染后3 d可见炎性细胞广泛浸润、间质细胞轻度增生, 部分肺泡内可见淤血。感染后第5 d可见广泛炎性细胞浸润、肺毛细血管充血明显, 肺间质细胞明显增生、肺泡壁增厚, 部分肺泡腔闭塞, 重度肺水肿、肺泡间隔破裂, 感染7 d肺严重淤血、水肿, 两者未见明显差异(见图2)。

图2

Fig.2

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	图2 感染野生型RH株和RHΔ rop16株小鼠肺部组织病理学改变Fig.2 Histopathological lesions in the lung of mice infected with wild-type RH strain and RHΔ rop16 strain with H& E staining(× 200)

2.3.2 脑组织切片HE染色显示两组小鼠感染后3 d脑间质均表现轻度疏松、水肿; 随着感染时间的延长, 脑组织间质疏松、水肿渐趋严重, 可见胶质细胞变性及坏死。感染后第7 d, 野生型RH感染小鼠脑组织局部可见大量小细胞增生浸润(见图3), 而同期RH_{Δ rop16}感染小鼠未见异常增生, 感染野生虫株的宿主脑组织病变更严重。

图3

Fig.3

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	图3 感染野生型RH株和ROP16缺陷虫株小鼠脑部组织病理学改变Fig.3 Histopathological changes in the brain of mice infected with wild-type RH strain and RHΔ rop16 strain with H& E staining(× 200)

为研究ROP16_I/III基因缺陷虫株感染宿主体内炎性免疫应答的特征, qRT-PCR检测脾细胞炎性因子及抑炎因子水平。结果表明, RH_{Δ rop16}株感染鼠脾脏Arg-1 mRNA水平明显低于野生型RH株感染鼠(t_3d=2.417, t_5d=3.525, t_7d=4.863, P均< 0.05)。两株弓形虫感染鼠脾脏IL-10、IL-12和TNF-α mRNA水平差异无统计学意义(IL-10: t_3d=2.319, t_5d=1.481, t_7d=0.911; IL-12: t_3d=0.200, t_5d=0.589, t_7d=1.315; TNF-α : t_3d=1.833, t_5d=1.313, t_7d=1.969; IFN-γ :t_3d=0.669, t_5d=1.473, t_7d=1.664; P均> 0.05)(见图5)。

图5

Fig.5

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	图5 野生型虫株感染的小鼠ARG-1明显高于敲除株(P< 0.05); IL-10、IFN-γ 、IL-12、TNF-α 无统计学差异(P> 0.05)Fig.5 Levels of Arg-1, IL-10, IFN-γ , IL-12 and TNF-α mRNA detected by qRT-PCR. Mice (n=3/ group) infected with wild-type RH strain and RHΔ rop16 strain