细粒棘球绦虫EgM123蛋白融合霍乱毒素B亚单位疫苗的构建表达及免疫原性研究
齐文静1,2, 何黎2, 王甜2, 郑雪婷2, 郭宝平2, 张文宝2, 况玲1, 李军2
1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052
2.中亚高发病成因与防治国家重点实验室,临床医学研究院,新疆医科大学第一附属医院,乌鲁木齐 830054
通讯作者:李军,Email:1742712944@qq.com; ORCID:0000-0003-0244-1734; 况玲,Email:Kuangling62@126.com;ORCID:0000-0001-9056-3904
摘要
目的 构建和表达细粒棘球绦虫成虫特异表达EgM123基因与霍乱毒素B的融合蛋白(CTB-EgM123);并确定CTB-EgM123蛋白的抗原性。方法 将合成EgM123基因序列连接到pET28a/CTB原核表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21中。利用IPTG诱导目的基因的表达;用SDS-PAGE及Western-Blotting对表达蛋白进行分析和鉴定;用纯化蛋白免疫小鼠及犬,用ELISA方法对小鼠及犬的血清抗体效价和肠黏液的抗体亚类进行分析。结果 PCR和测序确定CTB-EgM123基因片段长度为804 bp,pET28a/CTB-EgM123原核表达阅读框序列正确。在37 ℃条件下,经IPTG 0.4 mmol/L诱导5 h,获得CTB-EgM123高表达的包涵体蛋白,分子质量为37 kDa。免疫小鼠结果表明复性CTB-EgM123蛋白具较好免疫原性,抗体效价>320 000;以IgG2a为主。检测免疫犬血清效价,结果发现用融合蛋白免疫后的犬血清抗体效价>64 000,效价高于EgM123免疫组( t=0.0064, P<0.05);且在4周时,抗体呈上升趋势,并能较长时间维持抗体水平。结论 原核表达载体pET28a/CTB-EgM123在大肠杆菌中成功表达,纯化蛋白接种小鼠和犬表明具有高的抗原性。表明CTB可以增强蛋白的免疫原性,并刺激小鼠和犬体内产生高水平的体液和黏膜免疫。本研究为研发犬用包虫病疫苗奠定了基础。
关键词: 细粒棘球绦虫; CTB-EgM123; 重组蛋白; 疫苗;
中图分类号:R382.5 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2019)07-0647-08
Expression of Echinococcus granulosus adult-worm EgM123 fused with cholera toxin B and its antigenicity
QI Wen-jing1,2, HE Li2, WANG Tian2, ZHENG Xue-ting2, GUO Bao-ping2, ZHANG Wen-bao2, KUANG Ling1, LI Jun2
1.College of Veterinary Medicine Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China
2.State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Clinical Medicine Institute, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China
Corresponding authors:Li Jun,Email:1742712944@qq.com;Kuang Ling,Email:Kuangling62@126.com
Abstract

We aimed to express Echinococcus granulosus EgM123 fused with cholera toxin B (CTB-EgM123) in Escherichia coli and to determine its antigenicity in both mice and dogs. The EgM123 was amplified and subcloned into pET28a containing CTB sequence, which was then transformed into E. coli BL21. The expression of the fused protein CTB-EgM123 was induced by IPTG. The expressed protein was analyzed and identified by SDS-PAGE and Western-Blotting. BalB/c mice and Beagles were immunized, and the serum antibody titers of mice and dogs and antibody isotypes in serum and intestinal mucus were analyzed by ELISA. PCR and sequencing analysis confirmed that the size of CTB-EgM123 was 804 bp and the open reading frame of pET28a/CTB-EgM123 was correct. The high yield of fused protein in form of inclusion body was induced by 0.4 mM of IPTG for 5 hours at 37 °C. SDS-PAGE showed that CTB-EgM123 was size of 37 kDa. Mice were induced with serum titer >320,000 with IgG2a being predominant in the serum. The fused protein was also induced dogs producing higher titer and longer production of antibodies compared with these dogs vaccinated with EgM123 ( P<0.05). We found CTB-EgM123 was successfully expressed in E. coli, and the purified protein could induce mice and dogs producing high titer of antibodies in serum and intestinal tissues, indicating the fused recombinant protein has good antigenicity in terms of stimulating high levels of humoral and mucosal immune responses, which is essential for dog vaccine development against E. granulosus infection.

Key words: Echinococcus granulosus; CTB-EgM123; recombinant protein; vaccine; dog

包虫(棘球蚴)病是由棘球绦虫的中绦期幼虫寄生在体内所致的一种严重危害人畜健康的人兽共患病。其中, 由细粒棘球绦虫(Echinococcosis granulosa, E.g)引起的棘球蚴病称作囊型棘球蚴病(Cystic Echinococcosis, CE), 可引起人体内严重病变, 呈世界性分布[1]。我国是包虫病高发区[2, 3], 已证实25个省、市和自治区流行棘球蚴病, 其中, 甘肃、新疆、宁夏、内蒙古、青海、四川、陕西和西藏流行严重, 严重影响我国农牧区的经济发展和群众健康[4, 5]

E.g的生活史需要两种宿主参与完成, 中间宿主为食草动物类, 其幼虫寄生于动物脏器内; 而终末宿主为犬等食肉动物, 其成虫寄生在犬的小肠内。成虫在终末宿主犬体内发育45 d后成熟, 其虫卵随粪便排出, 污染食物和饮水, 被中间宿主或人摄入后感染发病[6], 病原如此往复循环于食肉和食草动物之间。在包虫病流行地区, 犬的感染数量远远小于绵羊, 免疫犬是理想的控制方法。目前关于犬的保护性疫苗已有了一定的研究, Zhang等[7]人利用差异显示PCR技术从E.g成熟成虫发育阶段中分离出EgM4、EgM9和EgM123成虫特异基因片段; 用EgM123-GST重组蛋白免疫犬, 经原头节攻击感染, 取得了减虫和抑制成虫发育的保护效果, 表明EgM123有望成为犬疫苗研制的重要保护性抗原[8]。王慧等[9]已成功构建了原核表达载体pET28a-EgM123, 并且在大肠杆菌中成功获得诱导表达, 并通过Western-blotting方法鉴定了该融合蛋白的免疫活性。

霍乱毒素B亚单位(CTB)为霍乱毒素的无毒亚单位, 它可作为免疫佐剂和输送抗原的载体, 已经有研究证明将其与目的抗原偶联或表达成融合蛋白后, 可使机体产生较强的系统免疫应答和局部黏膜免疫应答[10, 11]

本研究主要以细粒棘球绦虫EgM123融合霍乱毒素B亚单位载体来构建亚单位疫苗, 并在大肠杆菌中成功诱导表达, 通过ELISA和Western-blotting鉴定了该融合蛋白的免疫原性; 免疫小鼠和犬后发现能产生高水平的抗体, 同时可激活肠道产生黏膜免疫, 为包虫病疫苗的研究提供了依据。

1 材料与方法
1.1 材 料

1.1.1 实验动物 6~8周龄雌性BALB/c小鼠购自新疆医科大学动物中心, 在新疆医科大学第一附属医院动物室(AAALAC认证)根据国家科技部《实验动物管理条例》饲养。1~3岁比格犬购自上海实验动物中心, 实验前粪样及血清检测为阴性, 在本实验室动物隔离室观察1周。

1.1.2 质粒与菌种 CTB序列及引物由上海生物工程技术服务有限公司合成, 表达载体pET-28a(+)购于美国Invitrogen公司, 大肠杆菌E. coli(BL21)感受态细胞购自天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要试剂 T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR试剂、限制性内切酶NheI、BamHI和XhoI均购自日本TaKaRa公司; IPTG购自Promega公司; 兔抗EgM123-GST血清由本室保存; 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体, 羊抗鼠IgG、IgG2a、IgA抗体, 以及羊抗犬IgG抗体均购自Bethyl Lab; 其它常用试剂为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 原核表达载体pET28a/CTB的构建 根据原核表达载体pET28a上的多克隆位点, 在pET28a载体上引入CTB序列, 具体过程为:人工合成CTB序列, 两端分别带有酶切位点NheI(5'GCTAGC3')和BamHI(5'GGATCC3'); 然后将经NheI和BamHI酶切后CTB序列与经相同酶切后的pET28a载体的骨架大片段相连构建pET28a/CTB质粒, 经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将连接产物送至华大基因进行测序, 测序验证正确后得到中间载体pET28a/CTB。

1.2.2 EgM123基因的克隆及鉴定 根据GenBank上已经发表的EgM123基因编码序列的多克隆位点, 设计并合成特异性引物用于扩增EgM123目的基因片段。在上、下游引物的5'端分别引入了一个酶切位点BamHI和XhoI。引物序列为:

Primer-F1(下划线部分为BamHI的识别序列):

5'-GCGGATCCATGGAACCAGTGAATTTTGCCTGCCC-3';

Primer-R1(下划线部分为XhoI的识别序列):

5'-CCCTCGAGTTTCGTCTTTAAGGCACGAAACAACTTGAAAAGC-3'。

引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。以细粒棘球绦虫成虫cDNA(提取成虫总RNA后, 经反转录后得到cDNA)为模板扩增EgM123基因片段。反应程序为:94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共30个循环; 72 ℃延伸7 min, 4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.2.3 pET28a/CTB-EgM123重组质粒的构建与鉴定 将纯化后的EgM123 PCR产物和中间载体pET28a/CTB分别经BamHI和XhoI双酶切之后回收, 连接, 转入大肠杆菌BL21, 转化菌涂布于含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培养板, 于37 ℃培养箱倒置培养过夜; 挑取经PCR方法初筛得到的阳性菌株送至华大基因公司进行测序鉴定。

1.2.4 pET28a/CTB-EgM123融合蛋白的诱导表达 将测存正确的阳性克隆, 接种于含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培养基中, 在37 ℃, 220 r/min振荡摇床中培养过夜。按照1%体积将培养过夜的菌液接种于含相同浓度卡那霉素的LB液体培养基中, 在37 ℃, 220 r/min振荡摇床中培养至OD值达到0.6左右, 加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG进行诱导, 分别在诱导培养2 h、3 h、4 h、5 h时收集菌液, 进行SDS-PAGE检测。

将菌液培养物于4 ℃, 4 000 r/min, 离心15 min, 收集细菌沉淀。将菌体在液氮-室温环境中冻融3次。用预冷的Binding Buffer缓冲液(pH7.4)重悬菌体沉淀, 先用高压细胞破碎仪(FPG12800, STANSTED)高压破碎菌体重悬液, 再用超声仪破碎裂解物(功率400 W, 时间5 s, 间歇5 s, 总时长为2 min)。然后在4 ℃, 12 000 r/min, 离心60 min。离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE(配制5%浓缩胶, 12%分离胶, 20 mA恒流电泳约1 h, 用0.1%考马斯亮蓝染色2 h, 然后脱色至本底无色为止)。分析检测蛋白表达情况, 同时在表达过程中收集的诱导前菌液作为未诱导对照。

1.2.5 CTB-EgM123融合蛋白的纯化与复性 按照1.2.4的表达方法大量诱导蛋白表达, 离心菌液, 弃掉上清, 将菌体沉淀用不含尿素的Binding Buffer缓冲液(300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L PB, pH7.4)重悬, 用细胞破碎仪及超声仪破碎菌体沉淀。先用PBS将处理好的菌体沉淀洗10次, 前5次, 4 ℃, 10 000 r/min离心10 min; 后5次, 4 ℃, 5 000 r/min离心10 min。再用Buffer 1(50 mmol/L PB, 300 mmol/L NaCl, 8 mol/L Urea, 10 mmol/L Imidazole, pH7.4)对洗好的沉淀进行溶解, 完全溶解后, 4 ℃, 10 000 r/min, 离心30 min, 上清用0.45 μ mol/L的滤膜过滤后进行纯化复性。

将1 mL的镍螯合组氨酸柱子用10倍柱体积Buffer 1进行平衡; 将已处理好的蛋白裂解液, 加到柱子中; 等蛋白与树脂结合后, 用10倍体积的Buffer 1冲洗柱子, 洗去未结合上的蛋白及杂蛋白; 以60倍柱体积的Buffer 1和Buffer 2(50 mmol/L PB, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Imidazole, pH7.4)按照一定的体积与流速, 将尿素从8 M替换为0 M进行复性; 再以10倍体积的Washing Buffer 1(50 mmol/L PB, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Imidazole, pH7.4)冲洗镍柱; 最后以5倍柱体积的Buffer 3(50 mmol/L PB, 300 mmol/L NaCl, 1 mol/L Imidazole, pH7.4)洗脱收集目的蛋白(AKTA PURE)。

1.2.6 Western-blotting检测融合蛋白 采用Western-blotting法将未诱导和诱导表达的pET28a-CTB-EgM123菌液的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分离蛋白, 然后电转移至PVDF膜上(电泳条件:80 V, 2 h), 将PVDF膜浸入5%的脱脂奶粉溶液中于37 ℃封闭1 h; 用PBST洗3次, 每次5 min; 将PVDF膜浸泡于重组EgM123-GST抗原免疫的兔血清 (1∶ 400稀释)中, 37 ℃孵育1 h, PBST洗3次, 每次5 min; 二抗为羊抗兔的IgG-HRP(1∶ 2 000稀释), 室温孵育1 h, PBST洗3次, 每次5 min, 以4-氯-1萘酚显色, 用PBS终止反应。

1.2.7 CTB-EgM123融合蛋白的生物活性分析

1.2.7.1 融合蛋白免疫小鼠- ELISA检测血清效价及抗体亚类 将BALB/c雌性小鼠随机分组, 每组10只, 分别为CTB-EgM123蛋白, EgM123蛋白和PBS对照组, 蛋白抗原免疫剂量为25 μ g/只/次, 每只小鼠免疫100 μ L。间隔两周免疫1次, 共免疫3次。第1 次免疫用弗氏完全佐剂, 后 2 次加强免疫均用弗氏不完全佐剂。采用背部皮下多点注射免疫, 每次免疫前和免疫后2周小鼠尾静脉采血并分离血清用于检测细粒棘球绦虫成虫特异抗原EgM123特异性IgG抗体效价。

肠黏液的制备:称取相同重量的5 g小肠组织, 纵向剖开小肠, 刮取黏膜放入1.5 mL EP管中, 加0.5 mL体积的PBS于肠黏液中, 用搅拌器快速搅拌, 3 000 g离心10 min, 分离上清, 用于检测 EgM123特异性IgA抗体。

用ELISA方法检测免疫6周后小鼠血清中IgG抗体效价。以细粒棘球绦虫成虫特异表达EgM123为抗原, 浓度为0.5 μ g/mL进行包被, 100 μ L/孔, 4 ℃过夜, PBS洗3次; 用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h, PBS洗3次; 以待测小鼠血清为一抗, 37 ℃孵育1h, PBST洗3次; 以1∶ 10 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP及其亚类为二抗, 37 ℃孵育1 h, PBST洗3次; 加入底物ABTS显色, 酶标仪检测OD405值。

用相同ELISA方法检测小鼠肠黏液中IgA抗体。以小鼠肠黏液为一抗, 羊抗鼠IgA-HRP为二抗, 稀释度为1∶ 10 000。

1.2.7.2 融合蛋白免疫犬- ELISA检测血清效价 随机将比格犬分组, 每组10只, 分别设CTB-EgM123蛋白与EgM123蛋白免疫组及PBS对照组, 免疫剂量为100 μ g/只犬/次, 间隔两周免疫1次, 以相同剂量的Quil A为佐剂充分混合均匀后进行免疫。采用背部皮下多点注射免疫。免疫前和免疫后2周采血, 分离血清, 用于检测EgM123特异性IgG抗体效价。

用与鼠相同的ELISA方法检测免疫3次后犬血清中特异性IgG抗体效价。以不同稀释度的犬血清为一抗, 羊抗犬IgG-HRP按1∶ 10 000稀释为二抗, 用相同ELISA方法检测0~8周犬血清中特异性IgG抗体水平。

1.2.8 统计分析 采用SPSS19.0与GraphPad5.0进行统计学的相关分析与作图。两组间比较采用t检验, P< 0.05则差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 原核表达载体的构建及鉴定

以CTB、EgM123、CTB-EgM123等质粒为模板进行PCR, 扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测, PCR扩增产物分别在200~500 bp, > 500 bp, 750~1 000 bp之间有清晰的DNA条带, 与预期目的基因大小(201 bp, 603 bp和804 bp)一致(图1)。将CTB-EgM123的测序结果与GenBank中EgM123 cDNA序列进行比对, 其结果为100%同源(图2), 表明CTB-EgM123基因序列正确, 重组表达质粒构建成功。

图1 CTB、EgM123、CTB-EgM123基因的PCR扩增
M:DNA分子量标准(DL2000); 1:CTB PCR扩增产物; 2:EgM123 PCR扩增产物; 3:CTB-EgM123 PCR扩增产物
Fig.1 PCR product of CTB, EgM123, CTB-EgM123 gene

图2 CTB-EgM123基因序列与已发表的EgM123基因序列同源性比较Fig.2 Alignment of EgM123 from cloned CTB-EgM123 and EgM123 cDNA published sequences

2.2 CTB-EgM123融合蛋白的诱导

将构建好的重组质粒CTB-EgM123转化到大肠杆菌BL21中, 经0.4 mmol/L IPTG, 37 ℃诱导培养后, 对菌体进行超声破碎、离心。然后分别对诱导2 h、3 h、4 h、5 h的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析, 结果显示与未诱导菌相比, 2 h~5 h内诱导菌的沉淀在35 kDa~50 kDa之间有明显差异表达的蛋白条带(图3A), 与目的蛋白的预测值37 kDa相一致。表达菌体经超声破碎离心后发现, 目的蛋白主要存在于沉淀中, 说明该融合蛋白主要以包涵体形式表达(图3A)。经过镍离子柱亲和层析的方法进行纯化复性后, 得到纯度较高的CTB-EgM123蛋白(图3B)。

图3 SDS-PAGE 检测CTB-EgM123 蛋白的诱导表达及纯化 图A:融合蛋白的诱导表达
M:标准分子质量; 1:CTB-EgM123转化BL21未诱导菌体蛋白沉淀; 2, 4, 6, 8:分别为CTB-EgM123转化BL21诱导菌体蛋白2, 3, 4, 5 h的上清; 3, 5, 7, 9:分别为CTB-EgM123转化BL21诱导菌体蛋白2, 3, 4, 5 h的沉淀 图B:融合蛋白的纯化 M:标准分子质量; 1:CTB-EgM123蛋白纯化结果。
Fig.3 SDS-PAGE showing the expression of CTB-EgM123 protein induced by IPTG

2.3 CTB-EgM123融合蛋白的免疫原性鉴定

将诱导表达的pET28a/CTB-EgM123菌液沉淀、PET28a裂解液以及CTB-PET28a裂解液经Western-blotting分析鉴定, 同时使用兔抗EgM123抗体和正常兔血清做对比, 结果表明CTB-EgM123 蛋白与兔抗EgM123抗体产生特异性结合, 且条带位置与SDS-PAGE一致而其他蛋白则不被识别, 说明CTB-EgM123是我们需要表达的功能蛋白(图4)。

图4 Western-blotting 分析CTB-EgM123 蛋白的活性
图A:SDS-PAGE 图B:一抗为正常兔血清 图C:一抗为兔抗EgM123血清 M:蛋白分子质量标准 1:PET28a裂解液; 2:CTB- PET28a裂解液; 3:CTB-pET28a-EgM123蛋白
Fig.4 Western-blotting analyze the activity of CTB-EgM123 protein

2.4 CTB-EgM123融合蛋白免疫小鼠的抗体效价

检测免疫6周后, 免疫小鼠血清效价。与正常小鼠血清相比, CTB-EgM123与EgM123蛋白免疫后的小鼠血清抗体效价可达到1∶ 320 000以上。但两组蛋白所产生的抗体滴度在1∶ 80 000之前, CTB-EgM123免疫组的血清效价高于EgM123免疫组, 差异有统计学意义, t=0.031 9, P< 0.05(图5)。说明CTB具有增强EgM123蛋白的免疫原性作用, 显示其具有佐剂活性。

图5 ELISA检测CTB-EgM123与EgM123免疫小鼠6周后血清中IgG抗体效价Fig.5 ELISA determining the titer of IgG antibody in the sera of mice after 6 weeks of immunization

检测CTB-EgM123与EgM123融合蛋白免疫6周后, 小鼠肠黏液中IgA抗体。结果发现CTB-EgM123免疫组其肠黏液中IgA抗体反应比PBS组高, 有统计学差异, t=0.041 0, P< 0.05; EgM123免疫组其肠黏液中IgA抗体反应同样比PBS组高, 有统计学差异, t=0.000 6, P< 0.05; 而CTB-EgM123免疫组的IgA抗体水平虽然高于EgM123免疫组, 但无统计学差异, t=0.462 2, P> 0.05(图6)。说明CTB-EgM123具有肠粘膜免疫应答性。

图6 ELISA检测CTB-EgM123与EgM123免疫小鼠肠黏液中的抗体IgAFig.6 Intestinal mucosal IgA of mice vaccinated with CTB-EgM123 and EgM123 by ELISA

检测CTB-EgM123与EgM123融合蛋白免疫小鼠后0~6周其血清中抗体亚类, 将免疫血清按照1∶ 10 000进行稀释, 发现CTB-EgM123与EgM123蛋白免疫小鼠组血清其IgG2a抗体反应比PBS对照组高。虽然CTB-EgM123组IgG2a抗体反应从第3周开始低于EgM123组, 但差异无统计学意义, t=0.1633, P> 0.05(图7)。

图7 ELISA检测0~6周内CTB-EgM123与EgM123免疫小鼠血清的抗体亚类IgG2aFig.7 ELISA detection Antibody subclass IgG2a of mouse immune serum within 0-6 weeks

2.5 CTB-EgM123融合蛋白免疫犬的抗体效价

用融合蛋白免疫犬后, 测定犬免疫3次后血清中IgG抗体效价。结果发现, 用CTB-EgM123与EgM123蛋白免疫犬之后, 犬体内均产生了良好的免疫效果。与对照组犬血清相比, CTB-EgM123蛋白免疫后的犬血清抗体效价可达到1∶ 64 000以上。CTB-EgM123免疫组的血清效价高于EgM123免疫组, 在抗体效价< 32 000时, 差异有统计学意义, t=0.006 491, P< 0.05(图8)。检测犬免疫0~8周之间血清中IgG抗体变化。将免疫血清按照1∶ 400进行稀释, 结果发现CTB-EgM123与EgM123蛋白免疫组其犬血清中IgG抗体反应从第4周开始升高, 与PBS组相比, 差异均有统计学意义, 分别为t=0.000 2及t=0.000 3, P< 0.05(图9)。其中, CTB-EgM123免疫组抗体反应高于EgM123免疫组, 但差异无统计学意义, t=0.281, P> 0.05(图9)。同样说明CTB具有增强EgM123蛋白在犬体内的免疫原性作用, 显示其具有佐剂活性。

图8 ELISA检测CTB-EgM123与EgM123免疫犬6周后血清中IgG抗体效价Fig.8 ELISA detection the titer of IgG antibody in serum after 6 weeks of immunization

图9 ELISA检测0~8周内CTB-EgM123与EgM123免疫犬血清的抗体IgGFig.9 ELISA detection IgG antibody of dog immune serum within 0-8 weeks

3 讨论

犬是包虫病的传染源, 在包虫病传染过程中具有重要意义。我们的前期研究证明, 在成虫成熟期前对犬进行驱虫, 阻断成虫向环境中排放虫卵, 可以切断传染循环链, 可使中间宿主免受感染, 达到控制包虫病流行的目的[12]。在我国采取“ 犬犬投药、月月驱虫” 的无虫卵污染驱虫措施, 可以阻断病原的传播[12]。但是高频度的驱虫在牧区的执行有很大的困难, 若能对犬实施免疫接种预防, 可以极大程度减少防控的工作量, 加快包虫病的控制。保护性抗原的筛选对研制犬抗虫疫苗具有很大的影响, 研究证明EgM123免疫犬, 然后再用原头节进行攻击感染, 产生了一定的保护效果[8]。我们的前期研究证明重组EgM123蛋白能刺激犬产生抗体, 但是抗体水平不能长时间维持[13]。如何加强抗原刺激机体产生长时间高效价的抗体, 是本研究的目的。

本研究试图加入佐剂肽CTB与EgM123进行融合, 激发更高水平的抗原抗体反应。但CTB的加入是否对EgM123蛋白的表达有影响, 是否具有好的活性, 是我们首先要解决的问题。研究结果发现, 融合蛋白是以包涵体的形式表达, 对EgM123的表达不产生影响。同时, 融合蛋白在IPTG诱导下2 h开始产生高水平表达。通过对包涵体的复性处理, 得到了可溶性的纯化蛋白, 免疫接种小鼠及犬均可产生体液免疫和细胞免疫应答, 表明具有很强的免疫原性。

CTB作为免疫佐剂和输送抗原的载体, 将其与目的抗原偶联或表达成融合蛋白后, 可使机体产生较强的系统免疫应答和局部黏膜免疫应答。另外, 融合蛋白可以极大程度降低佐剂的费用。Dertzbaugh等[14]用链球菌糖基化转移酶与CTB的融合蛋白, 分别通过腹腔与口服途径免疫小鼠, 结果发现两种途径都能产生很高的血清IgG抗体。在本实验中, 图5及图8结果说明融合蛋白免疫小鼠和犬后均能产生高水平的IgG抗体, 同时CTB-EgM123蛋白免疫小鼠及犬的血清效价均高于EgM123蛋白免疫小鼠和犬的血清效价, 证明CTB具有诱导增强免疫应答作用, 能加强EgM123蛋白的免疫原性, 具有佐剂活性。

Tochikubo等[15]用牛血清白蛋白(BSA)与CTB的混合液, 通过口服及鼻内途径免疫小鼠, 结果发现鼻内与口服免疫小鼠均可产生BSA特异性血清及IgA抗体应答, 而仅用BSA免疫的小鼠体内则不会产生抗体应答。这些实验结果均能证明CTB具有免疫佐剂活性, 并可以增强蛋白的免疫原性。在本实验中, 图6结果表明CTB-EgM123蛋白免疫小鼠后, 其肠黏液能产生一定水平的IgA抗体, 并且高于EgM123免疫小鼠肠黏液产生的IgA抗体, 表明CTB自身就具有免疫原性, 与EgM123融合可以增强局部黏膜免疫。

对于CTB作为佐剂诱导增强免疫应答的机制和类型尚无定论。许多研究显示CTB刺激的免疫反应以Th2型为主[16, 17], 亦有研究显示以Th1型为主[18], 而有些则发现同时兼具Th1型与Th2型免疫应答, 这可能与共免疫抗原的性质相关[19, 20]。Coccia等[21]研究发现CTB可以抑制黏膜Th1细胞。Holmgren等[22]推测rCTB(重组CTB)可以刺激小鼠淋巴细胞的增殖和分化, 分泌Th2型细胞因子, 同时还可以诱导局部黏膜免疫以及全身免疫。在本研究中, 如图7结果所示, ELISA检测两种蛋白免疫小鼠后血清产生的抗体亚类结果所示, 在IgG2a抗体中发现CTB-EgM123组的抗体反应略低于EgM123组。这与Coccia等的研究相一致{21}, CTB抑制了Th1细胞产生的IgG2a抗体。

研究表明, 犬抗细粒棘球绦虫的保护与体液的IgG成正相关[23]。在本实验中, 用ELISA检测免疫犬血清中的IgG抗体效价, 结果如图8所示, CTB-EgM123及EgM123蛋白都能刺激犬产生高水平的IgG抗体, 并且CTB-EgM123蛋白的抗体效价显著地高于EgM123蛋白, 研究结果显示CTB能加强EgM123蛋白的免疫效果, 尤其是可以提高IgG的水平。同时与我们早期研究相比[13], CTB-EgM123蛋白免疫犬后, 刺激机体产生有效性抗体的时间, 能维持的更久。但是EgM123蛋白融合CTB后在犬的原头蚴攻击感染实验中, 能否提高犬的保护性, 我们将进一步的开展研究。

本研究通过PCR扩增出大小为603 bp的EgM123基因片段, 并将其连接到已构建好的pET28a/CTB原核表达载体中, 用IPTG诱导重组质粒pET28a/CTB-EgM123在大肠杆菌BL21中的表达, Western blotting结果显示正确表达了目的蛋白。纯化及复性后得到了纯度> 95%的蛋白, 用抗原免疫小鼠后能产生高水平抗原抗体反应, 可激活肠道局部粘膜特异性的IgA反应; 用抗原免疫犬不仅产生了高水平的抗体, 而且相对于EgM123能提高抗体水平。因此该融合蛋白可作为包虫病候选疫苗进行更深一步研究。

利益冲突:

引用本文格式:齐文静, 何黎, 王甜, 等.细粒棘球绦虫EgM123蛋白融合霍乱毒素B亚单位疫苗的构建表达及免疫原性研究[J].中国人兽共患病学报, 2019, 35(7):647-654. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.087

The authors have declared that no competing interests exist.

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