轮状病毒(rotaviruses, RV)是引起婴幼儿和所有年龄人群病毒性胃肠炎的主要病原体, 2016年引起全球大约13万例婴幼儿死亡和各年龄人群23万例死亡[1]。RV属于呼肠病毒科RV属, 其基因组由11个双链RNA节段组成, 分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4, VP6, VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6)。糖蛋白VP7和刺突蛋白VP4构成RV外衣壳, VP4蛋白经胰蛋白酶切割后裂解形成VP5* 和VP8* 两个蛋白, 其中VP8* 蛋白主要参与受体识别, 介导病毒作用宿主细胞[2]。基于VP4序列, A组RV分为P [1]-P[40]40种基因型, 基于VP8* 序列, RV分为P[I]-P[V] 5个基因组[3, 4]。 P[I]、P[IV]、P[V]主要感染动物, P[II]只感染人, P[III]既能感染人, 也能感染动物。P[1]、 P[2]、P[3]和P[7]属于P[I]基因组, 人群中广泛流行的P[4]、P[6]和P[8]属于P[II]基因组, P[9]、P[14]和P[25]属于P[III]基因组。
研究发现RV VP8* 可以识别HBGA作为其感染受体或配体[2, 5]。HBGA具有丰富的多态性, 包括ABO、分泌型和Lewis三个基因家族, 在世界人群中广泛分布[6]。不同P型的RV与HBGA的结合具有型别特异性, 不同人群对各型RV易感性也存在差异[7]。因而, 研究RV与HBGA的相互作用对于阐明RV的感染机制及宿主范围具有重要意义。
2009-2014年间P[9]RV在我国成都、武汉和济南等地被检出[8, 9, 10]。P[9]RV属于P[III]基因组, 既能感染人也能感染犬和猫[11], 具有在人和动物中跨物种传播的潜在可能。本研究表达和纯化了P[9]RV VP8* 蛋白, 对其与HBGA的结合特征进行了研究, 同时, 检测广东汕尾地区人群P[9]RV抗体水平, 分析P[9]RV抗体与HBGA的相关性, 为RV感染机制的研究及疾病防控提供一定的基础。
1.1.1 样本采集 于2015年1月24-27日采集广东省汕尾市3~88岁(平均年龄51.2岁)一般人群配对的唾液和血清样本206份; 266份唾液样本源于南方医院并已确定HBGA表型, 为本实验室保存[12], 随机选取45份用于本研究HBGA结合试验。
1.1.2 试剂 感受态细胞TOP10和BL21购于天根生化科技有限公司, 质粒提取试剂盒, 琼脂糖切胶回收试剂盒, T4连接酶, BamHI和Sal I内切酶购自美国thermo fisher scientific公司, GST-Resin购自上海七海富泰生物科技有限公司, 凝血酶购自英国GE公司, LB肉汤、LB琼脂购自北京路桥, 氨苄青霉素、IPTG购自sigma, HRP-羊抗人IgG购自美国Abcam, 表达载体pGEX-4T-1和兔抗VP8* 血清为本实验室保存。
1.2.1 P[9]RV VP8* 基因序列合成 P[9]RV VP8* 基因序列参照GenBank公布的AB077766基因序列, 序列范围位于10-702位点共693个碱基, 在VP8* 基因序列的上、下游分别加入BamH I和Sal I酶切位点, 序列由华大基因合成。
1.2.2 pGEX-4T-1-VP8* 重组表达载体的构建 将华大基因提供的含有质粒pUC57-VP8* 的穿刺菌涂于含氨苄青霉素(100 mg/mL)的营养琼脂平板, 根据thermo fisher scientific提质粒试剂盒说明书提取质粒后进行BamH I和Sal I双酶切, 切胶纯化VP8* 基因片段与经BamHI和Sal I双酶切的pGEX-4T-1表达载体连接, 连接产物转化至感受态细胞TOP10, pGEX-4T-1-VP8* 重组质粒经双酶切鉴定。
1.2.3 重组pGEX-4T-1-VP8* 蛋白的诱导表达与纯化 将鉴定正确的重组质粒转化到感受态细胞BL21, 挑取单个菌落接种于4个5 mL含有氨苄青霉素(100 mg/mL)的LB液体培养基中, 37 ℃, 200 r/min震荡培养12~16 h, 将培养物以1∶ 100的稀释度接种于新鲜LB液体培养基中, 37 ℃震荡培养3.5 h至OD600为0.40.6, 加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L。继续22 ℃ 220 r/min震荡培养12~16 h。于4 ℃, 5 000 r/min离心菌液12 min, 弃上清, 收集菌体, 用80 mL PBS充分重悬菌体, 并将菌液于冰浴中对其进行超声破碎, 于4 ℃, 12 000 r/min离心75 min。利用GST-resin对GST融合蛋白进行纯化获得GST-VP8* , 或者用凝血酶除去融合蛋白的GST标签蛋白, 纯化获得VP8* 进行SDS-PAGE电泳检测。
1.2.4 VP8* 蛋白的Western blot鉴定分析 取10 μ LVP8* 蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳, 转印至硝酸纤维素膜, 依次用5% BSA封闭、兔抗VP8* 血清(1∶ 1 000)、HRP-羊抗兔IgG(1∶ 3 000)孵育、PBST充分洗涤, 最后HRP-DAB底物显色。
1.2.5 各型唾液HBGA受体与GST-VP8* 蛋白结合的梯度试验 应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测[12], 在南方医院采集的唾液样本中随机选取各型HBGA(分泌型A、B、O和非分泌型N)各两份, 将唾液用PBS缓冲液按终浓度1∶ 1 000稀释后每孔100 μ L包被于96孔酶标板上, 4 ℃过夜; 0.05%PBST洗板5次, 每孔加入5%脱脂奶粉-PBS 200 μ L于37 ℃封闭1 h; 0.05%PBST洗板5次, 将P[9]RV GST-VP8* 蛋白经1%脱脂奶粉-PBS3倍梯度稀释(15 μ g/mL, 5 μ g/mL和1.7 μ g/mL)后, 加入到相应的孔中, 37 ℃孵育1 h; 0.05%PBST洗板5次, 每孔加入兔抗VP8* 血清(1∶ 3 000)100 μ L, 37 ℃反应1 h; 0.05%PBST洗板5次, 每孔加入HRP-羊抗兔IgG(1∶ 3 000)100 μ L, 37 ℃反应1 h; 0.05%PBST洗板5次, 使用TMB避光显色10 min后每孔加入100 μ L 2 mol/L磷酸终止反应, 测定波长为450 nm的吸光值, 阳性信号的截断值为背景/空白孔的平均值加三倍标准差约为OD450=0.2。
1.2.6 唾液样本与P[9]RV结合试验 将45份在南方医院采集的唾液样本(HBGA分型A型21份, B型8份, O型8份, N型8份)用PBS缓冲液按终浓度1∶ 1 000稀释后每孔100 μ L包被于96孔酶标板, 4 ℃过夜; 0.05%PBST洗板1次, 每孔加入5%脱脂奶粉-PBS 200 μ L于37 ℃封闭1 h; 0.05%PBST洗板1次, 每孔加入1%脱脂奶粉-PBS稀释的GST-VP8* 蛋白(10 μ g/mL)100 μ L, 37 ℃孵育1 h; 0.05% PBST洗板5次, 每孔加入兔抗VP8* 血清(1∶ 3 000)100 μ L, 37 ℃反应1 h; 0.05%PBST洗板5次, 每孔加入HRP-羊抗兔IgG(1∶ 3 000)100 μ L, 37 ℃反应1 h; 0.05%PBST洗板5次, 使用TMB避光显色10 min后每孔加入100 μ L 2 mol/L磷酸终止反应, 测定波长为450 nm的吸光值。
1.2.7 血清中P[9]RV特异性IgG的检测 206份血清样本取自广东省汕尾市的一般人群。利用P[9]RV VP8* 蛋白作为捕获抗原, 采用ELISA检测血清样本中P[9]RV特异性IgG抗体。用PBS缓冲液稀释VP8* 蛋白至0.5 μ g/mL每孔100 μ L包被于96孔酶标板上, 4 ℃过夜; 0.05%PBST洗板1次, 每孔加入5%脱脂奶粉-PBS 200 μ L于37℃封闭1 h; 0.05%PBST洗板1次, 每孔加入1%脱脂奶粉-PBS两倍梯度稀释的血清样本, 37 ℃孵育1 h; 0.05%PBST洗板1次, 每孔加入用1%脱脂奶粉-PBS稀释的HRP-羊抗人IgG(1∶ 3 000), 37 ℃反应1 h; 0.05%PBST洗板5次, 使用TMB避光显色10 min后每孔加入100 μ L 2 mol/L磷酸终止反应, 测定波长为450 nm的吸光值。
1.2.8 唾液HBGA表型鉴定 206份唾液样本取自广东省汕尾市的一般人群。唾液HBGA表型检测包括ABO、Lewis以及分泌型, 采用ELISA方法检测。将煮沸的唾液用PBS缓冲液1∶ 1 000稀释后每孔100 μ L包被于96孔酶标板上4 ℃过夜; 0.05%PBST洗板1次, 每孔加入5%脱脂奶-PBS 200 μ L于37 ℃封闭1 h; 0.05%PBST洗板1次, 将单克隆抗体包括A、B、H、Lewis b、Lewis x和Lewis y经1%脱脂奶粉-PBS 1∶ 300稀释后, 加入到相应的孔中, 37 ℃孵育1 h; Lewis a 4 ℃过夜; 0.05%PBST洗板5次; 其中Lewis a相对应的二抗为HRP-羊抗鼠IgG(1∶ 300); 余为HRP-羊抗鼠IgM(1∶ 300), 37 ℃, 反应1 h; 0.05%PBST洗板5次, 使用TMB显色10 min后每孔加入100 μ L 2 mol/L磷酸终止反应, 测定波长为450 nm的吸光值。
1.2.9 统计分析 采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析。抗体阳性和阴性两组HBGA表型比较采用χ 2检验, 不满足χ 2检验条件时, 采用Fisher确切概率法检验, 检验水准α =0.05。
pGEX-4T-1-VP8* 重组质粒经BamH I与Sal I双酶切鉴定, 获得大小约5 kb的pGEX-4T-1载体和700 bp的VP8* 片段(图1), 表明成功构建pGEX-4T-1-VP8* 表达质粒。
通过原核表达系统, 得到可溶形式的P[9]RV VP8* 蛋白, SDS-PAGE电泳结果显示:融合蛋白大小约为52 kD条带, 经凝血酶去除GST标签蛋白后获得约为28 kD 的目的蛋白, 与预期VP8* 蛋白大小一致(图2)。为了进一步验证原核表达系统表达VP8* 蛋白的特异性, 将SDS-PAGE凝胶分离的目的蛋白转印到PVDF膜上, 经特异性抗体进行Western blot分析, 在大小为52 kD和28 kD位置显示条带, 证明了研究所用的原核表达系统BL21(DE3)表达的VP8* 蛋白具有特异性(图3)。
结合P[9]RVGST-VP8* 蛋白与唾液HBGA受体的结合情况如图4所示。GST-VP8* 蛋白与A型分泌型HBGA受体结合, 且呈梯度反应关系, 与B、O型和非分泌型不结合。进一步以中国人群唾液样本验证P[9]RV与HBGA受体结合特征, 随机抽取45份唾液样本用于本研究验证, 根据梯度实验结果, 为保证OD值的有效性及背景值的可参考性, 我们把后续实验中GST-VP8* 蛋白与唾液HBGA受体结合实验的浓度定为10 μ g/mL。结果如图5所示:GST-VP8* 蛋白与A型分泌型HBGA受体结合, 与B、O型和非分泌型不结合。各型OD均值分别为A=0.751, B=0.135, O=0.130, N=0.160。
采集广东省汕尾市206名一般人群配对的血清和唾液样本, 检测血清P[9]RV特异性IgG抗体滴度和唾液HBGA表型。206份血清样本中P[9]RV特异性IgG检出率为13.6%(28/206)。血清P[9]RV特异性IgG与HBGA表型有关。与P[9]RV特异性IgG阴性的个体相比, A型HBGA受体在P[9]RV特异性IgG阳性的个体中所占的比例明显较高(P=0.001), 分泌型受体在P[9]RV特异性IgG阳性的个体中所占的比例明显较高(P=0.017); 相反, Lea+/Lex+在P[9]RV特异性IgG阳性的个体中所占的比例明显较低(P=0.014)。
VP8* 是RV表面刺突蛋白VP4的远端, 主要参与受体识别, 介导病毒识别宿主细胞, 研究表明, 重组VP8* 蛋白可以识别HBGA受体, 提示VP8* 蛋白可成为研究RV-HBGA相互作用的理想模型[13]。本研究以P[9]RV为对象, 表达纯化了VP8* 蛋白, 通过唾液HBGA结合鉴定, 发现P[9]RV特异性地与A型HBGA结合。国外有研究使用当地RV融合VP8* 蛋白, 采用血凝结合试验得出P[III]RV与A型分泌型HBGA受体结合的模式[13]。本研究利用中国人群唾液样本, 证实了P[9]RV VP8* 与A型分泌型HBGA受体结合, 而不与B、O型分泌型HBGA受体及非分泌型HBGA受体结合。
我们还研究了一般人群血清样本中P[9]RV特异性IgG阳性率和HBGA表型之间关系。发现A型分泌型HBGA个体配对的血清中P[9]RV特异性IgG阳性率明显较高, A型分泌型存在于Leb+/Ley+和分泌型HBGA个体中, 不存在于Lea+/Lex+和非分泌型HBGA个体中, 因此, Leb+/Ley+和分泌型HBGA个体配对的血清中P[9]RV特异性IgG阳性率明显较高, 而Lea+/Lex+和非分泌型HBGA个体配对的血清中不存在P[9]RV特异性抗体。表明A型分泌型HBGA受体可能是P[9]RV重要的宿主易感因素。
我国1980-2011年间P型RV中P[8]和P[4]为主要流行株, 检出率分别为50.2%和18.2%, P[9]的检出率较低为0.9%[14]。研究RV与HBGA受体的关系有助于理解RV的流行病学。我们课题组对P[8]和P[4]RV与HBGA结合方式开展了研究[12], 发现P[8]和P[4]RV能识别具有A、B和O分泌者的HBGA受体, 且分泌型人群占我国总人群的80%90%人[15], 表明P[8]和P[4]RV具有广谱易感人群, 一定程度上解释了P[8]和P[4]RV为主要流行株的原因。本研究发现P[9]RV VP8* 与分泌型A型HBGA受体结合, 而不与分泌型B、O型HBGA受体及非分泌型HBGA受体结合, P[9]RV易感人群范围较窄, 解释了我国P[9]RV检出率低于P[8]RV检出率这一现象。
Wang等[16]发现我国两株罕见的人P[9]型RV可能来源于犬和猫。P[9]RV能够跨物种传播可能是因为这些物种具有某种相同的物质, 本研究发现, P[9]RV VP8* 与分泌型A型HBGA受体结合, 在很多动物物种中也表达A型HBGA受体[17], 动物和人类中都具有A型HBGA抗原可能是P[9]RV跨物种传播的原因。
利益冲突:无
本文引用格式:侯玉珍, 龙艳, 郭伦爱, 等.P[9]轮状病毒受体结合特征及其人群抗体水平与HBGA相关性研究[J].中国人兽共患学报, 2019, 35(8):688-693. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.128
The authors have declared that no competing interests exist.
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