胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立及其初步应用
唐虹1,2, 徐仲兰3, 孔科1, 唐海燕1, 范正杨1, 焦新安1,2, 黄金林1,2
1.扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室,扬州 225009
2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州 225009
3.扬州市妇幼保健院,扬州 225001
通讯作者:黄金林, Email: jinlin@yzu.edu.cn; ORCID:0000-0003-3056-4774
摘要
目的 建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法。方法 以胎儿弯曲菌表面蛋白基因 sapB2为靶基因,应用软件设计特异性引物,通过反应条件的优化,引物敏感性、特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测,建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法并应用于临床样品检测。结果 该研究建立的PCR方法能特异性扩增胎儿弯曲菌 sapB2(789 bp)基因片段,空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌以及其他17株参考菌如大肠杆菌、沙门菌等均未扩增出条带;胎儿弯曲菌纯培养物最低可检出0.23 pg/μL的DNA,模拟感染样品污水和奶牛粪便样品中胎儿弯曲菌的最低检出量分别为0.9 CFU/mL和20 CFU/g;临床样品检测中,400份奶牛肛门擦拭样品和125份产妇阴道擦拭样品的PCR检测结果均为胎儿弯曲菌阴性,与传统的平板分离方法同步检测结果一致。结论所建立的胎儿弯曲菌PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、简便快速等特点,为胎儿弯曲菌的快速检测提供了技术支持,对识别该菌株的暴发流行,相关疾病的诊断和控制具有重要意义。
关键词: 胎儿弯曲菌; PCR; 快速检测
中图分类号:R378.99 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2019)08-0694-05
Development and application of PCR method for the detection of Campylobacter fetus
TANG Hong1,2, XU Zhong-lan3, KONG Ke1, TANG Hai-yan1, FAN Zheng-yang1, JIAO Xin-an1,2, HUANG Jin-lin1,2
1. Key Laboratory of Zoonoses of Jiangsu Province, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
2. Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infection Diseases and Zoonoses of Jiangsu Province, Yangzhou 225009, China
3. Yangzhou maternal and child care service center, Yangzhou 225001, China
Corresponding author: Huang Jin-lin, Email: jinlin@yzu.edu.cn
Abstract

To establish a rapid detection assay for Campylobacter fetus, a PCR method was developed using a pair of specific primers targeting the surface protein gene sapB2 of Campylobacter fetus. Species-specific product could be detected after amplification of the DNA template of Campylobacter fetus, while other reference strains could not be detected. The detection limit of the PCR assay was 0.23 pg/μL DNA template of Campylobacter fetus pure cell culture. And it could detect as few as 0.9 CFU/mL and 20 CFU/g of Campylobacter fetus in artificial contaminated sewage and cow feces respectively. A total of 400 fresh cow anal swab samples and 125 of vaginal swab samples were detected for Campylobacter fetus by the PCR, and the result was consistent with that of the national standard method for Campylobacter fetus. These results suggest that the PCR assay can be used to rapidly detect Campylobacter fetus and show high specificity, sensitivity and being easy to handle. It provides technical support for the rapid detection of Campylobacter fetus, and it is of great significance to the diagnosis and control of Campylobacter fetus diseases.

Key words: Campylobacter fetus; PCR; rapid detection

胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus, C.fetus) 属于弯曲菌属, 包括胎儿弯曲菌胎儿亚种(C. fetus subsp. fetus), 胎儿弯曲菌性病亚种(C.fetus subsp. venerealis)和胎儿弯曲菌龟亚种(C.fetus subsp. testudinum) 3个亚种[1]C.fetus呈弧形或S形, 有鞭毛, 革兰染色阴性, 是一种可导致人类肠外感染(如菌血症、脑膜炎、关节炎、蜂窝组织炎等), 牛羊等牲畜流产、不育和生殖道炎症等疾病的人兽共患病原菌, 主要通过污染的水源、精液、流产的胎儿、粪便等进行传播, 给人的健康安全带来巨大威胁, 同时也对畜牧业造成严重的经济损失[2]

在人的肠道弯曲菌病中, 90%是由空肠弯曲菌和结肠弯曲菌导致的, 由C.fetus感染导致的案例较少[3]。但是Iraola G等人的最新研究表明人适应性C.fetus在人体内作为一种肠道致病菌能够无症状携带, 这大大增加了其在人与人之间传播的可能性[4]。相反, 在人弯曲菌菌血症案例中, 19%~53%是由C.fetus感染导致的, 而且据报道其死亡率高达14%[5, 6, 7]。在国外C.fetus感染案例屡见不鲜, 已然构成一个公共卫生问题, 然而在国内有关C.fetus感染病例的报道极少, 其流行传播未能得到重视。C.fetus培养条件严苛, 需要在微需氧环境(5% O2, 10% CO2, 85% N2)下才能生长, 由于其培养和鉴定的特殊性导致日常工作中容易被忽视或错误鉴定。传统的C.fetus鉴定方法是通过观察形态、培养特性及生理生化特性等生物学特征, 用以区分C.fetus与其他细菌。该方法耗时较长, 难以适应现代诊断和研究需求, 且传统鉴定方法中能区分C.fetus与其他弯曲菌的特异性试验较少, 主要通过1%甘氨酸生长试验、25 ℃和42 ℃温度生长试验、3.5% NaCl生长试验、萘啶酮酸和头孢霉素药敏试验、马尿酸水解试验以及氧化酶试验等来区分C.fetus与其他弯曲菌, 从分离培养到鉴定完成至少需要68 d, 对于某些需要增菌处理的样品, 还需多耗费1~2 d[8]。由于弯曲菌种类繁多, 生物学特性各异, 难以将C.fetus与其他弯曲菌区分开, 此外C.fetus生化变型中间种的存在, 更是增加了其区分难度[9, 10]。因此, 本研究旨在建立一种特异性检测C.fetus的PCR方法, 为C.fetus感染的快速诊断、防控及深入研究奠定基础。

1 材料与方法
1.1 菌种

实验菌株C.fetus标准株(NCTC10842)购自ATCC菌种库, 空肠弯曲菌(NCTC11168)由遵义医学院孙万邦教授惠赠, 结肠弯曲菌、唾液弯曲菌、豚肠弯曲菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、恶臭假单孢杆菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、粪肠球菌、屎肠球菌、副干酪乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、嗜低温弓形菌、乳酸乳球菌、福氏志贺菌、副溶血弧菌、小肠肠球菌、格氏乳球菌、肠链球菌、金黄色葡萄球菌由本室保存。

1.2 主要试剂

2 Taq Master mix(南京Vazyme公司); DNA marker(大连TaKaRa公司); 厌氧罐、微需氧产气袋(日本MGC公司); Carry-Blair运送培养基(中国科学院上海昆虫科技开发公司); 弯曲菌CCDA琼脂和Bolton肉汤(英国OXOID公司); 无菌脱纤维绵羊血(北京Solarbio公司); 抗生素甲氧苄氨嘧啶、放线菌酮(日本Wako公司); 两性霉素B(上海Uniche公司); 多粘菌素B(美国Amresco公司); 萘啶酮酸(青岛海博公司); 525份临床检测样品中, 400份奶牛肛门擦拭样品采自某奶牛养殖场, 125份产妇阴道擦拭样采自某妇幼保健院。

1.3 方法

1.3.1 引物设计 从GenBank中获得C.fetus特异性基因sapB2序列(登录号:AF048699), 应用软件Primer Premier 5.0设计特异性引物(见表1), 经比对得知引物覆盖区域与NCBI库中已有的C.fetus菌株的同源性均为100%。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列 Tab.1 Primers used for PCR

1.3.2 细菌基因组DNA的提取 C.fetus的DNA模板参照黄金林等方法制备[10]。将菌株接种于CCDA培养基上, 37 ℃微需氧条件下培养36~48 h后挑取3~5个菌落, 加到100 μ L SW中用移液枪吹匀, 沸水煮15 min, 取出立即置于冰上, 8 000 r/min离心5 min, 吸取上清转移至-20 ℃保存备用。同时提取菌株基因组DNA用于特异性及灵敏度试验。

1.3.3 PCR扩增条件优化 PCR扩增体系(25 μ L)如下:DNA模板2 μ L, 2× Taq Master mix 12 μ L, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μ L, 灭菌去离子三蒸水9 μ L。配好体系瞬时离心10 s, 使反应物集中于PCR管底部后再进行PCR扩增。PCR循环参数为:95 ℃ 7 min, 95 ℃ 30 s, 最佳退火温度下45 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环; 72 ℃ 7 min; 4 ℃保存备用。取8 μ L PCR扩增产物点样, 用1.0%的琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙锭), 以PCR Marker DL2000作对照, 100 V电泳45 min。凝胶在紫外灯下观察, GelDoc 2000凝胶成像系统成像并保存图片。利用建立的PCR方法, 在53 ℃~60 ℃退火温度范围进行PCR反应, 经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果, 确定最佳退火温度。

1.3.4 特异性试验 用引物CFF/CFR对C.fetus、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、唾液弯曲菌、豚肠弯曲菌以及鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、恶臭假单孢杆菌等22种细菌进行PCR检测, 并通过电泳观察PCR扩增结果。

1.3.5 灵敏度试验 用分光光度计测定C.fetus DNA模板的浓度后, 分别作10倍梯度稀释, 每个梯度各取2 μ L进行PCR扩增, 并通过电泳观察比较条带亮度, 直至不出现条带。

1.3.6 模拟污染试验 收获新鲜培养的C.fetus, 用PBS作10倍梯度稀释, 同时每个梯度做菌落计数, 然后将每个稀释度各取10 μ L菌液分别加入到10 mL污水、10 g奶牛粪便样品中, 向模拟污染样品中加入90 mL增菌培养基, 微氧条件下置于摇床上37 ℃ 120 r/min培养48 h。将菌液梯度稀释后转接至CCDA培养基上培养36~48 h后, 挑取典型菌落35个, 按上述煮沸法提取DNA模板, 再用该PCR方法对可疑菌落进行鉴定, 鉴定正确后对培养基上的阳性菌落进行计数。根据计数结果以及10 mL污水和10 g奶牛粪便样品中C.fetus的污染量, 计算该PCR检测方法在两类样品中C.fetus检测限。

1.3.7 临床样品检测 将本研究建立的PCR检测方法应用于检验检疫实际工作中。从某奶牛养殖场采集400份奶牛肛门擦拭样品, 同时连续10 d从某妇幼保健院共采集125份产妇阴道擦拭样品, 在两类样品采集过程中各随机选取10个个体采集双份样品用于设置分离过程阳性对照组, 样品均用Carry-Blair运送培养基暂时保存, 并于24 h内送至实验室检测。将棉拭子头剪下置于无菌采样袋中, 实验组直接加入10 mL增菌培养基进行增菌, 对照组额外加入50 CFU的C.fetus, 微氧条件下置于摇床上37 ℃ 120 r/min培养48 h。取菌液0.5 mL, 8 000 r/min 离心5 min, 弃上清液, 加入100 μ L灭菌去离子三蒸水, 混匀后煮沸15 min, 10 000 r/min离心5 min, 吸出上清液作为DNA模板, 用本研究建立的PCR方法进行C.fetus病原学检测。同时对增菌产物以弯曲菌传统的平板分离方法进行平行检验。

2 结果与分析
2.1 PCR反应条件优化结果

在53 ℃~60 ℃退火温度范围对相同C.fetus DNA模板进行PCR扩增, 扩增效果经琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示, 确定59 ℃时扩增效果最佳, 即为最优退火温度。PCR扩增的目的片段约789 bp, 与预期结果(789 bp)相符。

图1 C.fetus温度梯度PCR扩增结果
M: DL2000 DNA Marker; 1-8: Annealing temperature of 53.0 ℃, 53.5 ℃, 54.3 ℃, 55.7 ℃, 57.3 ℃, 58.6 ℃, 59.5 ℃ and 60.0 ℃, respectively; 9: Negative control
Fig.1 Results of PCR amplification by temperature gradient of Campylobacter fetus

2.2 特异性试验

电泳结果显示, 仅C.fetus在789 bp处出现属特异性条带, 而空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌均没有条带, 其他17株参考菌株如沙门菌、大肠杆菌也均不能扩增出条带(图2)。

图2 C.fetus PCR检测方法的特异性
M: DL2000 DNA Marker; 1: C.fetus, 2: C.jejuni, 3: C.coli, 4: C.sputorrum, 5: C.hyointestinalis, 6: S.typhimurium, 7: S.pullorum, 8: P.putida, 9: E.coli, 10: L.monocytogenes, 11: E.faecalis, 12: E.faecium, 13: L.paracasei, 14: L.casei, 15: A.Cryaerophilus, 16: L.lactis, 17: S.flexneri, 18: V.parahaemolyticus, 19: E.hirae, 20: L.garvieae, 21: S.entericus, 22: S.aureus
Fig.2 Specificity test of PCR for the detection of C.fetus

2.3 灵敏度试验

用分光光度计测得C.fetus纯培养物DNA模板浓度为227.23 ng/μ L, 对不同稀释度的模板进行PCR扩增, 最低在10-6稀释度时能检测到目的条带。由此可知该PCR检测方法最低可检出0.23 pg/μ L的C.fetus DNA(图3)。

图3 C.fetus PCR检测方法的敏感性
M: DL2000 DNA Marker; 1-7: 227.23× 100 ng/μ L-227.23× 10-6 ng/μ L
Fig.3 Sensitivity test of PCR for the detection of C.fetus amplification

2.4 模拟污染试验

经人工模拟污染的污水、奶牛粪便样品, 通过增菌、平板选择性培养以及PCR检测, 得知污水中C.fetus检测限为0.9 CFU/mL, 牛粪便样品为20 CFU/g。

2.5 临床样品检测

用本研究建立的PCR方法对525份临床样品进行检测, 结果显示525份临床样品均为C.fetus阴性, 其中400份奶牛肛门擦拭样品对应的10份对照组PCR检测结果均为C.fetus阳性, 125份产妇阴道擦拭样品对应的10份对照组也均为C.fetus阳性。弯曲菌传统平板分离方法同步检测结果显示, 400份奶牛肛门擦拭样品中检出7份空肠弯曲菌阳性, 2份唾液弯曲菌阳性, 1份豚肠弯曲菌阳性, 未检测到C.fetus, 10份对照组中, 8份为C.fetus阳性, 2份C.fetus阴性; 125份产妇阴道擦拭样品用传统平板分离方法检出1份空肠弯曲菌阳性, 未检出C.fetus, 其10份对照组均为C.fetus阳性。实验组中两种检测方法结果一致, 均为C.fetus阴性; 对照组中两类样品的PCR方法的回收率均为100%, 奶牛肛门擦拭样品平板分离法回收率为80%产妇阴道擦拭样品平板分离法回收率为100%。PCR方法整个检测过程仅需2 d, 而传统方法耗时7 d。

3 讨 论

当今社会, 随着宠物家庭数量增加, 人与动物亲密接触机会增多, 此外人类食用多种生的或半熟肉制品, 都大大增加了人感染人兽共患病的风险。C.fetus作为一种常见的人兽共患病原菌, 其引起的感染常因其生长缓慢, 培养条件特殊等特性以及传统检测技术耗时费力、诊断不准确而导致误诊或延误治疗。因此开发C.fetus快速检测方法, 以识别该病原菌的暴发流行, 及时诊断和控制胎儿弯曲菌病显得非常迫切和重要。

随着核酸检测技术的发展, 越来越多的研究者将这项技术应用到诊断领域。本研究以C.fetus表面蛋白基因sapB2为靶基因, 设计特异性引物, 建立C.fetus PCR检测方法。同源性比对结果显示, sapB2基因在C.fetus不同亚种中的一致性均在82%以上, 具有很高的保守性。试验结果也证明, 当以空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌这4个不同的弯曲菌种, 以及17种其他细菌如大肠杆菌、屎肠球菌等作为参考菌株时, 仅C.fetus能被扩增, 说明该PCR方法具有较强的特异性。用本研究建立的PCR方法对C.fetus纯培养物进行检测, 最低可检出0.23 pg/μ L的DNA, 该结果与国内其他细菌PCR检测方法结果相似[11, 12]。对模拟污染样品的检测结果显示, 污水中C.fetus的最低检测限为0.9 CFU/mL, 奶牛粪便样品中为20 CFU/g。该检测结果与何蕊等人的结果基本一致, 均具有较高的灵敏度[13]

临床样品检测过程中, 400份奶牛肛门擦拭样品PCR检测结果均为C.fetus阴性, 同样传统平板分离方法同步检测结果也均为C.fetus阴性, 两者检测结果相符, 显示该PCR方法具有良好的实用性。传统平板分离方法同步检测到空肠弯曲菌、唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌的存在, 但该PCR方法检测结果中未产生非特异性条带, 再次表明其具有较好的特异性。400份样品均未分离出C.fetus, 这可能与该地区C.fetus的分布和流行情况有关。目前国内未有报道说该地区暴发过C.fetus感染[14]。10份对照组中, PCR检测结果均为C.fetus阳性, 平板分离法8份为C.fetus阳性, 可能原因与样品的增菌过程有关, 肛门擦拭样中含有多种肠道细菌如大肠杆菌、屎肠球菌等, 这些细菌均为兼性厌氧菌, 在营养丰富的弯曲菌增菌培养液中生长旺盛, 增殖活跃, 繁殖周期短, 使得生长缓慢的弯曲菌失去生长优势而被掩盖, 难以被传统的平板分离法检出, 而灵敏度较高的PCR方法则只需微量的DNA就能将C.fetus检出[15]

综上所述, 本研究建立的C.fetus PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、简便快速等特点, 适用于食品和环境中弯曲菌的检测, 克服了传统鉴定方法的不足, 为C.fetus的快速检测提供技术支持, 对于识别该菌株的暴发流行, 相关疾病的诊断、控制以及C.fetus分子流行病学研究具有重要意义。

利益冲突:

本文引用格式:唐虹, 徐仲兰, 孔科, 等. 胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立及其初步应用[J]. 中国人兽共患病学报, 2019, 35(8):694-698. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.130

The authors have declared that no competing interests exist.

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